Способ определения холинсодержащих фосфолипидов Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 G01N33/52 

Изобретение относится к биохимии, химии и физико-химической биологии и может быть использовано при биохимическом анализе фосфолипидов в растворах крови, органах и органеллах.животных. Целью изобретение является повьше ние чувствительности и точности опре деления. Пример. К5мг лизосом печени крыс прибавляют 10 мл смеси хлоро формметанол 2:1, два раза смесью 1:1 по 5 мл и затем осадок заливают этой же смесью 1:1 (5 мл) и оставляют на ночь. На следующий день экстракция липидов проводится еще дважды по 5 мл смесью хлороформ-метанола 2: 1. Объединенные липидные экстракты отмывают от водорастворимых примесей охлажденным раствором 15 мл 0,ЗМ NaCl (раствор добавляется с таким расчетом, чтобы верхний водньш слой содержал не более 50% спирта,чтобы он не извлекал фосфолипиды). После центрифугирования верхний водораство римый слой отсасывается. Пленка, обр зующаяся на поверхности раздела двух фаз (хлороформенньй и водно-спиртовой) растворяется добавлением неболь шого количества этилового спирта. Хлороформеиный экстракт, содержащий фосфолипиды, упаривают досуха, под вакуумом,при комнатной температуре, Общее количество липида определяют весовым методом: определено 2,75 мг общей фракции липидов. Липиды раство ряют в 50 мл CCf (55 мкг/мл). Процесс выделения липидов и определения в них количества холинсодержащих фосфолипидов (фосфатидилхолин. сфингомиелин) проводят при стандартных условиях (комнатная температура 18 - 20°С, давление 760 мм рт.ст.). К 5 мл липидов (55 мкг/мл) прибавляют 5 мл реактива Драгендорфа. Для его приготовления 1,7 г нитрата висмута растворяют в 100 мл 20% уксусной кислоты (i раствор), а 10 г иодида калия в 25 мл дистиллированной воды ( 1 раствор) и перед опытом 20 мл раствора Т смешивают с 5 мл раствором 1 и разбавляют 70 мл воды. После смешивания и встряхивания липидного раствора с реактивом Драгендорфа водную и органическую фазы разделяют и измеряют интенсивность поглощения, перешедшего в органическую фазу (СС ) реактива при длине волны 500 нм и определяют количество холинсодержаших фосфолипидов по стандартной кривой, которая построена по известным концентрациям фосфотидилхолина. Количество холинсодержащих фосфолипидов в 1 мп CCf составляет 22 мкг. На вьщеленные из лизосом 2,75 мг липидов приходится (22 мкг х 50 мл) 1,1 мг холинсодержащих фосфолипидов. На 1 мг общей фракции липида лизосом приходится 400 мкг, а на 1 мг лизосом (1,1 мг : 5 мг)220 мкг холинсодержащих фосфолипидов. Предлагаемый способ более точно определяет заданное количество фосфолипида. Ошибка опыта в известном способе составляет А,9%, а в предлагаемом - 3,3%. С помощью известного способа невозможно определить количество холинсодержащих фосфолипидов ниже 30 мкг, а предлагаемым способом можно определить 8 мкг холинсодержащего фосфолипида.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ФОСФОЛИПИДОВ путем обработки раствора фосфолипидов реагентом, образую11№1м окрошенный комплекс с фосфолипидами, с последующим измерением интенсивности поглощения окрашенного комплекса в органической фазе, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности определения фосфолипиды растворяют в четырехклористом углероде, а в качестве реагента используют реактив драгендорфа при объемном соотношении реагента и раствора фосфолипидов не менее 4:5.