ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/47/ПЕКИН/95/35(H1N1) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ДЕТЕЙ Российский патент 2000 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 C12N7/00 C12R1/92 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма A/47/Пекин/95/35(H1N1). Известный штамм А/47/Техас/91/2/6 (H1N1) - прототип [1] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичным вирусу А/Пекин/262/95 (H1N1).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса А/Пекин/262/95 (H1N1).

Вакцинный штамм А/47/Пекин/95/35(Н1N1) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Пекин/262/95 (H1N1) с холодоадаптированным штаммом А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) - донором аттенуации - с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу А/Ленинград/134/47/57 (H2N2). Донор аттенуации - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для детей [2].

Методом рестрикционного анализа ДНК копий генов родительских вирусов и реассортантного вакцинного штамма установлено, что вакцинный штамм A/47/Пекин/95/35(H1N1) унаследовал 6 генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS) от донора аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), и 2 гена, кодирующих поверхностные белки - НА (гемагглютинин) и NA (нейраминидазу) - от эпидемического вируса А/Пекин/262/95 (H1N1). Гемагглютинин в РТГА идентичен вирусу А/Пекин/262/95 (Н1N1), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Штамм является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при 33^oC и 40^oC составляет 7.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при 33^oC и 25^oC - 3.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл).

Таким образом, представленный вакцинный штамм A/47/Пекин/95/35(H1N1) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса А/Пекин/262/95 (H1N1), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34^oC в течение 48 часов - 8,5-9,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность -1:512.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Образец паспорта на вакцинный штамм A/47/Пекин/95/35 (H1N1) прилагается.

ШТАММ А/47/ПЕКИН/95/35 (H1N1) АРЕАКТОГЕНЕН ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ДЕТЯМ 3-14 ЛЕТ.

Пример. Группу из 101 ребенка в возрасте 3-14 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл рекомбинантным вакцинным штаммом А/47/Пекин/95/35 (H1N1) с инфекционной активностью 8,5 1g ЭИД₅₀/0,2 мл. Группа детей того же возраста из 101 человека получила плацебо.

Сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5^oC и средние реакции с кратковременным повышением температуры в диапазоне 37,6-38,5^oC не наблюдались. Слабые температурные реакции (до 37,5^oC) у привитых наблюдались у 11 человек (10,9% случаев). Слабые температурные реакции (до 37,5^oC) в группе плацебо наблюдались у 15 человек (14,9% случаев). Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0% (таблица 1).

Таким образом, вакцинный штамм А/47/Пекин/95/35 (H1N1) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФС 42-3353-97 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения детям 3-14 лет.

ПАСПОРТ ШТАММА
1. Название штамма - А/47/Пекин/95/35 (H1N1).

2. Серия - серия 1.

3. Метод получения - рекомбинация; характеристика родительских вирусов:
а) эпидемический вирус - А/Пекин/262/95 (H1N1);
б) донор аттенуации - А/Ленинград/134/47/57 (H2N2).

4. Количество пассажей - 6 в процессе рекомбинации.

5. Характеристика штамма до лиофилизации:
а) оптимальные условия репродукции - 33^oC, 48 часов;
б) гемагглютинирующая активность - 1:512;
в) инфекционная активность - 8.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;
г) чувствительность к ингибиторам - ингибиторорезистентный;
д) разность в показателях инфекционной активности при 33^oC и 40^oC - 7.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;
е) разность в показателях инфекционной активности при 33^oC и 25^oC - 3.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;
ж) структура генома рекомбинанта:
- гены от эпидемического вируса - НА, NA;
- гены от донора аттенуации - РА, РВ1, РВ2, NP, М, NS.

6. Характеристика штамма после лиофилизации:
а) дата лиофилизации - 14 сентября 1998 года;
б) объем материала в ампуле - 1 мл;
в) количество доз в серии - 3;
г) инфекционная активность - 7.5 lg ЭИД₅₀/0.2 мл;
д) гемагглютинирующая активность - 1:256.

7.Рекомендуемое разведение при вакцинации - 1:3.

8. Антигенная специфичность
а) гемагглютинина в РТГА - идентичен вирусу А/Пекин/262/95 (H1N1), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется;
б) нейраминидазы - идентична вирусу А/Пекин/262/95 (H1N1) по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов.

9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении - безвреден.

10. Бактериологический контроль лиофилизированного материала: дата проведения - 14 сентября 1998 года, результат - стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.

ЛИТЕРАТУРА
1. Штамм A/47/Texac/91/2/6 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для детей. Патент РФ 2077581 от 20.04.97. Опубликовано в бюллетене изобретений N 11 от 20.04.97.

2. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука.- 1994.- 151 с.

Вакцинный штамм А/47/Пекин/95/35(Н1N1) является реассортантом. Получен путем скрещивания эпидемического вируса А/Пекин/262/95 (H1N1) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) - донором аттенуации. Штамм безвреден для детей. Штамм A/47/Пекин/95/35(H1N1) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 33 - 34^oС, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал от эпидемического вируса два гена, кодирующих поверхностные белки (гемагглютинин и нейраминидазу), и шесть генов, кодирующих негликозилированные белки от донора аттенуации. Штамм А/47/Пекин/95/35(Н1N1) ареактогенен для детей при интраназальном введении. Свойства штамма дают возможность гарантированно получать реассортантные вакцинные штаммы из вновь появляющихся эпидемических вирусов. 1 табл.

Штамм вируса гриппа А/47/Пекин/95/35 (Н1N1) ГИСК N 394/5 (Государственный институт стандартизации и контроля им.Л.А.Тарасевича), используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для детей.