ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/ПЕКИН/95/25(H1N1) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ Российский патент 2000 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 C12N7/00 C12R1/92 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма А/17/Пекин/95/25 (H1N1). Известный вакцинный штамм А/17/Техас/91/1/3 (H1N1) - прототип [1] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом, аналогичным вирусу гриппа А/Пекин/262/95 (H1N1).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса А/Пекин/262/95 (H1N1).

Вакцинный штамм А/17/Пекин/95/25 (H1N1) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Пекин/262/95 (H1N1) с холодоадаптированным штаммом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации - с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Донор аттенуации - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых [2].

Методом рестрикционного анализа ДНК копий генов вакцинного и родительских штаммов установлено, что вакцинный штамм А/17/Пекин/95/25 (H1N1) унаследовал 6 генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS) от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и 2 гена, кодирующих поверхностные белки - НА (гемагглютинин) и NA (нейраминидазу) - от эпидемического вируса А/Пекин/262/95 (H1N1). Гемагглютинин в РТГА идентичен вирусу А/Пекин/262/95 (H1N1), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Штамм является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при 33^oC и 40^oC составляет 7.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при 33^oC и 25^oC -3.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл).

Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/Пекин/95/25 (H1N1) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса А/Пекин/262/95 (H1N1), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34^oC в течение 48 часов - 8,0-9,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность -1:512.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Пекин/95/25 (H1N1) прилагается.

ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/ПЕКИН/95/25 (H1N1) АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ВЗРОСЛОГО КОНТИНГЕНТА
Пример 1. При вакцинации 87 взрослых лиц интраназально распылителем РДЖ-4М рекомбинантным вакцинным штаммом А/17/Пекин/95/25 (H1N1) с инфекционной активностью 8,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5^oC и средних реакций с повышением температуры в диапазоне 37,6-38,5^oC не наблюдалось. Слабые температурные реакции до 37,5^oC отмечены у двух привитых (2,3%).

В контрольной группе из 52 лиц, получивших плацебо, сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5^oC, средних реакций с повышением температуры в диапазоне 37,6-38,5^oC и слабых температурных реакций до 37,5^oC не наблюдалось (таблица).

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Пекин/95/25 (H1N1) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым Фармакопейной статьей ФС 42-3569-98 к вакцинным штаммам для живой гриппозной вакцины для интраназального применения для взрослых.

ПАСПОРТ ШТАММА
1. Название штамма - А/17/Пекин/95/25 (H1N1).

2. Серия - серия 1.

3. Метод получения - рекомбинация; характеристика родительских вирусов:
а) эпидемический вирус - А/Пекин/262/95 (H1N1);
б) донор аттенуации - А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

4. Количество пассажей - 6 в процессе рекомбинации.

5. Характеристика штамма до лиофилизации:
а) оптимальные условия репродукции - 33^oC, 48 часов;
б) гемагглютинирующая активность -1:512:
в) инфекционная активность - 8.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;
г) чувствительность к ингибиторам - ингибиторорезистентный;
д) разность в показателях инфекционной активности при 33^oC и 40^oC - 7.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;
е) разность в показателях инфекционной активности при 33^oC и 25^oC - 3.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

ж) структура генома рекомбинанта:
- гены от эпидемического вируса - НА, NA;
- гены от донора аттенуации - РА, РВ1, РВ2, NP, М, NS.

6. Характеристика штамма после лиофилизации:
а) дата лиофилизации - 14 сентября 1998 года;
б) объем материала в ампуле - 1 мл;
в) количество доз в серии - 3;
г) инфекционная активность - 7.5 lg ЭИД₅₀/0.2 мл:
д) гемагглютинирующая активность -1:256.

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации - 1:3.

8. Антигенная специфичность:
а) гемагглютинина в РТГА - идентичен вирусу А/Пекин/262/95 (H1N1), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется;
б) нейраминидазы - идентична вирусу А/Пекин/262/95 (H1N1) по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов.

9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении - безвреден.

10. Бактериологический контроль лиофилизированного материала: дата проведения - 14 сентября 1998 года результат - стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.

Литература
1. Штамм А/17/Texac/91/1/3 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых. Патент РФ 2084524 от 20.07.97. Опубликован в бюллетене изобретений N 20 от 20.07.97.

2. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука, 1994, 151с.

Вакцинный штамм А/17/Пекин/95/25 (H1N1) является реассортантом. Он получен путем скрещивания эпидемического вируса А/Пекин/262/95 (H1N1) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом - донором аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2). Штамм безвреден для взрослых людей. Штамм А/17/Пекин/95/25 (H1N1) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 33-34°С. Характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал от эпидемического вируса два гена. Эти гены кодируют поверхностные белки (гемагглютинин и нейраминидазу). Полученные от донора аттенуации шесть генов кодируют негликозилированные белки. Штамм А/17/Пекин/95/25 (H1N1) ареактогенен для взрослых людей при интраназальном введении. Таким образом, вакцинный штамм А/17/Пекин/95/25 (H1N1) по биологическим свойствам и показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым фармакопейной статьей ФС 42-3569-98 к вакцинным штаммам для живой гриппозной вакцины для интраназального применения для взрослых. Свойства штамма дают возможность гарантированно получать реассортантные вакцинные штаммы из вновь появляющихся эпидемических вирусов. 1 табл.

Штамм вируса гриппа А/17/Пекин/95/25 (Н1 N1) ГИСК N 393/4 (Государственный институт стандартизации и контроля им.Л.А.Тарасевича), используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых.