ГЕПТАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ, СОЧЕТАЮЩЕЙСЯ С ТЕРМОРЕГУЛЯТОРНОЙ И/ИЛИ С СОСУДОДВИГАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И/ИЛИ С ВЛИЯНИЕМ НА ПОВЕДЕНЧЕСКУЮ РЕАКЦИЮ ИСПЫТУЕМОГО, И СПОСОБ ИЗМЕНЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ДЕРМОРФИНА Российский патент 1999 года по МПК A61K38/08 

Изобретение относится к области медицины и может найти применение при разработке новых физиологически активных соединений, а также при лечении заболеваний, требующих использования анальгетиков, терморегуляторов, соединений с сосудодвигательной активностью и соединений, влияющих на поведенческую активность испытуемого.

Известен гептапептид дерморфин (ДМ) общей формулы Н-Тyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂, обладающий анальгетической, терморегуляторной активностью и влиянием на поведенческую реакцию испытуемого. (Emel'yanova T.G., Usenko А. В. , Deigin V. I, Yarova E.P. end Kamensky A. A. Effect of Dermorphin of Thermoregulation in Rats at Selected Ambient Temperatures. - Peptides, 1996, V 17, N 2. P 241-245) [1] - прототип для вещества.

Однако данный известный природный гептапептид обладает физиологической активностью недостаточно высокого уровня.

Известен способ изменения физиологической активности дерморфина общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂ путем химической модификации входящего в его состав аминокислотного остатка. (Т.Г. Емельянова, Е.Ю. Батурина, О. Г. Воскресенская, А.А. Каменский, В.И. Дейгин, Е.П. Ярова, А.Б. Усенко. Физиологические эффекты дерморфина и его аналога [D-Ala⁴] - дерморфина. ДАН, т. 346, N 2, с. 271-274) [2] - прототип для способа.

В данном известном способе химическую модификацию осуществляют путем замены в молекуле дерморфина аминокислотного остатка, Gly, находящегося в 4-м положении, на аминокислотный остаток D-Ala.

Такая замена обеспечивает изменение уровня анальгетической и терморегуляторной активности исходного дерморфина.

Однако уровень анальгетической и терморегуляторной активности дерморфина, химически модифицированного данным известным способом, также недостаточно высок. Кроме того, не описаны иные виды физиологической активности данных известных химически модифицированных соединений.

При лечении ряда заболеваний необходимы средства, сочетающие высокую анальгетическую активность с различным уровнем терморегуляторной и/или сосудодвигательной активности, и/или с влиянием на поведенческую реакцию испытуемого.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является расширение ассортимента соединений, обладающих широким спектром физиологической активности, а также рекомендация пути превращения природного гептапептида дерморфина в соединения с широким спектром физиологической активности, включая высокую анальгетическую активность уровня.

Достигается этот технический результат тем, что у гептапептида общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH₂, где X - D-Pro, или Dh-L-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин, выявлены анальгетическая активность, сочетающаяся с терморегуляторной и/или сосудодвигательной активностью, и/или с влиянием на поведенческую активность испытуемого.

Достигается указанный технический результат также тем, что в способе изменения физиологической активности дерморфина общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂ путем химической модификации входящего в состав аминокислотного остатка отличительной особенностью является то, что химическую модификацию осуществляют в аминокислотном остатке Pro.

В конкретном случае химическую модификацию осуществляют путем замены аминокислотного остатка L-Pro на D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин.

Неожиданно было установлено, что химическая модификация молекулы дерморфина, осуществленная именно в 6-м положении, в аминокислотном остатке Pro, приводит к наиболее выраженному изменению соотношения уровней физиологических активностей исходного природного гептапептида дерморфина: анальгетической, терморегуляторной, сосудодвигательной и уровня влияния на поведенческую реакцию испытуемого.

На фиг. 1 приведен график влияния [Dh-Pro⁶]ДМ на изменения температуры тела крыс, находящихся в холодной среде.

На фиг. 2 приведен график влияния [Dh-Pro⁶]ДМ на изменения температуры тела крыс, находящихся в комфортной среде.

На фиг. 3 приведен график влияния [Dh-Pro⁶]ДМ на изменения температуры кожи хвоста крыс, находящихся в комфортной среде.

На фиг. 4 приведен график влияния [Dh-Pro⁶]ДМ на изменения температуры тела крыс, находящихся в жаркой среде.

На фиг. 5 приведен график влияния [D-Pro⁶]ДМ на изменения температуры тела крыс, находящихся в холодной среде.

На фиг. 6 приведен график влияния [D-Pro⁶]ДМ на изменения температуры тела крыс, находящихся в комфортной среде.

Объектом исследования служили самцы нелинейных белых крыс массой 180-250 г.

Новые гептапептиды, а также препарат сравнения дерморфин (ДМ) вводили внутрибрюшинно в виде водного раствора из расчета 0.5 мг/кг.

Контрольные животные получали инъекцию дистиллированной воды.

Изучение анальгетического действия заявляемых препаратов проводили, используя комплекс тестов.

Тест "горячей пластины" - Hot plate (камера DS-37). Животных помещали в округлую пластиковую камеру, расположенную на поверхности горячей пластины T = 56±1^oC. Болевая реакция, возникающая при нанесении раздражения на лапы, проявляется у животного в виде отдергивания лап, их вылизывания, вокализации, прыжкообразных движений, вращения. Двигательные реакции такой сложности обеспечиваются на всех уровнях центральной нервной системы: от спинного мозга до коры больших полушарий. Латентный период избавления животного от болевого раздражителя оценивали по началу лизания задних лапок.

Тест "отдергивания хвоста" - Tail flick. Животное помещали в индивидуальную пластиковую камеру, хвост погружали на 5 см в воду с температурой 56±1^oC. Рефлекс отдергивания хвоста замыкается на уровне спинного мозга. В тесте фиксировали латентный период избавления от болевого раздражителя - период времени (сек), в течение которого животное выдергивало хвост из воды полностью.

Максимальное время предъявления болевого раздражителя в обоих тестах 30 секунд.

Исходную болевую чувствительность определяли как среднее арифметическое из показателей, зафиксированных на 30, 20 и 10 минут до инъекции. Латентный период избавления от болевого раздражителя фиксировали в течение 90 или 120 минут после инъекции с интервалом в 10 минут. Анальгетическую активность (A) оценивали по формуле
A = (t_о - t_к)/(30 - t_к)•100%,
где t_о - латентный период избавления у животных опытной группы;
t_к - латентный период избавления у животных контрольной группы;
30 - максимальное время (сек) предъявления болевого раздражителя.

Изучение терморегуляторных и сосудодвигательных эффектов заявляемых препаратов осуществляли, используя метод непрерывной термометрии.

На время опыта животных в индивидуальных пластиковых пеналах помещали в термокамеру с заданным температурным режимом. С помощью медно-константановых термопар осуществляли непрерывную регистрацию температур: воздуха в камере - T_ch, в прямой кишке (на глубине 6 см) - T_rt, кожи хвоста - T_ts. Хвост является основным органом теплообмена у крыс. Соответственно, T_ts является показателем состояния периферической сосудистой системы. Возрастание T_ts свидетельствует о расширении периферических кровеносных сосудов (реакция вазодилатации). Снижение T_ts свидетельствует о сужении периферических кровеносных сосудов (реакция вазоконстрикции).

Терморегуляторные эффекты заявляемых пептидов изучали в условиях трех основных температурных режимов:
а) холод (T_ch = 4 - 7^oC), когда постоянство температуры тела обеспечивается снижением процессов теплоотдачи (в частности, сужением периферических кровеносных сосудов) и усилением процессов теплопродукции:
б) комфортная (термонейтральная) зона (T_ch = 27 - 28^oC), когда процессы теплоотдачи и теплопродукции находятся в динамическом равновесии, и постоянство температуры тела обеспечивается уровнем основного обмена;
в) жаркая среда (T_ch = 32 - 33^oC), когда постоянство температуры тела обеспечивается снижением процессов теплопродукции и усилением процессов теплоотдачи (в частности, расширением периферических кровеносных сосудов).

Инъекции осуществляли после предварительной 60-ти минутной адаптации животных к условиям эксперимента (когда T_rt и T_ts каждого животного практически не изменялись на протяжении по крайней мере 30 минут). Исходную температуру тела/кожи хвоста (T_bas) определяли как среднее арифметическое из трех показателей, зафиксированных за 30, 20 и 10 минут до инъекции. В табл. 5-8, 12, 13 представлены средние (по группам) величины T_rt и T_ts. На фиг. 1-6 представлена динамика изменений T_rt и T_ts. По оси абсцисс - время (мин), по оси ординат - ΔT_rt/ΔT_ts, которые рассчитывали по формуле ΔT = T_i-T_bas, где T_i - величина T_rt/T_ts, зафиксированная в i-й момент времени.

Поведенческие эффекты заявляемых пептидов изучали, используя тесты "норковая камера" и "открытое поле", позволяющие количественно оценить ориентировочно-исследовательскую реакцию и двигательную активность животных.

"Норковая камера" (Hole board) представляет собой куб со стороной 400 мм. В полу камеры - 13 отверстий диаметром 25 мм. Эксперимент проводили в звукоизолированном помещении на фоне "белого шума", при освещении красным светом. Животное помещали в камеру и в течение 2-х минут визуально фиксировали:
- количество стоек - число подъемов на задние лапы;
- количество обследованных отверстий - погружение носа в отверстие до уровня глаз;
- количество умываний - касания мордочки передними лапами.

"Открытое поле" (Open field) представляет собой арену диаметром 80 см, со стенками высотой 40 см. Пол арены разделен на секторы двумя концентрическими окружностями и восемью диаметральными линиями. Эксперимент проводили в звукоизолированном помещении на фоне "белого шума", при освещении красным светом. Животное помещали в центр арены и в течение 2-х минут визуально фиксировали:
- латентный период выхода из центра арены (ЛП) - время (сек), прошедшее от момента помещения животного в центр арены до момента пересечения линии меньшей концентрической окружности;
- длину пробега (в условных единицах) - число пройденных секторов;
- число отходов от стенки арены (ОСА) - количество пересечений линии большей концентрической окружности;
- число выходов в центр арены (ВЦА) - количество пересечений линии меньшей окружности и центра арены;
- число стоек;
- число умываний.

Достоверность отличий между группами оценивали при помощи непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Ниже приведены примеры реализации изобретения. Использованы следующие сокращения:
ДМ - дерморфин;
[Dh-Pro⁶]ДМ - дерморфин с 3,4-дегидропролином в положении 6;
[D-Pro⁶]ДМ - дерморфин с D-пролином в положении 6;
[Dh-D-Pro⁶]ДМ - дерморфин с 3,4-D-дегидропролином в положении 6.

Пример 1. Тест Tail flick. Гептапептид [Dh-Pro⁶]ДМ вводили внутрибрюшинно (в/б) в дозе 0.5 мг/кг. Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что новый гептапептид обладает анальгетическим эффектом, достигающим значимого уровня через 40 мин после инъекции (отличия от контроля достоверны, P < 0.05). Эффект сохраняется на протяжении 20-30 мин, анальгезия достигает величины 22.9%.

В тесте Hot plate пептид [Dh-Pro⁶]ДМ также вызывает снижение болевой чувствительности. Анальгетический эффект в этом тесте сохраняется на протяжении 10-15 мин (отличия от контроля достоверны, P < 0.05) и выражен слабее (A = 7.3%) (табл. 2).

Для сравнения с новым гептапептидом использовали его природный предшественник - дерморфин (ДМ). ДМ вводили внутрибрюшинно (в/б) в дозах 0.5, 1 и 5 мг/кг. В тесте Tail flick эффективной оказалась лишь доза 5 мг/кг. Анальгезия достигает 23% и сохраняется на протяжении 60 минут. В дозах 0.5 и 1 мг/кг ДМ не оказывает существенного влияния на болевую чувствительность животных.

Таким образом, анальгетическая активность нового гептапептида оказалась в 10 раз выше, чем у препарата сравнения.

Пример 2. В тестах Hole board и Open field пептид [Dh-Pro⁶]ДМ вводили в/б в дозе 0.5 мг/кг за 20 мин до начала эксперимента.

В тесте Open field после введения нового гептапептида наблюдались возрастание ЛП выхода из центра арены и снижение длины пробега (отличия от контроля достоверны, P < 0.5) (табл. 3). Полученные данные свидетельствуют об угнетающем воздействии гептапептида на горизонтальный компонент ориентировочно-исследовательского поведения животных.

В тесте Hole board [Dh-Pro⁶]ДМ не оказывал существенного воздействия на двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение животных (табл. 4).

Для сравнения с новым гептапептидом использовали дерморфин. В тесте Open field ДМ, вводимый в/б в дозе 0.5 мг/кг, вызывает снижение: длины пробега (на 24.7%), количества выходов в центр арены (на 60%), числа стоек (на 45.9%), количества умываний (на 63.6%). Эти данные свидетельствуют о ярковыраженном угнетающем воздействии ДМ на двигательную активность, ориентировочно-исследовательское поведение и эмоциональное состояние животных. В тесте Hole board эффект ДМ выражен слабее: под влиянием пептида значимо снижается только количество обследованных отверстий (на 45.4%).

Таким образом, угнетающее воздействие нового гептапептида [Dh-Pro⁶]ДМ на ориентировочно-исследовательское поведение выражено значительно слабее, чем у препарата сравнения - дерморфина.

Пример 3. В тесте непрерывной термометрии пептид [Dh-Pro⁶]ДМ вводили внутрибрюшинно в дозе 0.5 мг/кг. Результаты исследований представлены на фиг. 1-4 и в табл. 5-8.

В холодной среде новый гептапептид вызывает снижение температуры тела, достигающее максимума падения (ΔT_rt = -1,6^oC) через 20 минут после инъекции (фиг. 1, табл. 5). Гипотермический эффект нового гептапептида сохраняется на протяжении по меньшей мере 120 мин (отличия от контроля достоверны, P < 0.01). На динамику температуры кожи хвоста в данных условиях новый гептапептид влияния не оказывает.

В комфортной зоне после введения [Dh-Pro⁶]ДМ также развивается гипотермия (фиг. 2, табл. 6). Однако выражена она слабее (ΔT_rt = -0,9^oC) и сохраняется на протяжении 100 мин после инъекции (отличия от контроля достоверны, P < 0.01). В этих экспериментальных условиях наблюдаются ярковыраженные изменения динамики температуры кожи хвоста (фиг. 3, табл. 7). Новый гептапептид вызывает быстрый рост T_ts, достигающий максимума (ΔT_ts = 4,6^oC) через 10 мин после инъекции (отличия от контроля достоверны, P < 0.01). Этот процесс свидетельствует о развитии реакции вазодилатации, которая сохраняется на протяжении 20 мин. Через 30 мин после инъекции T_ts в опытной группе снижается до контрольного уровня.

В жаркой среде после введения [Dh-Pro⁶]ДМ также развивается гипотермия (фиг. 4, табл. 8). При этом максимальное падение T_rt составляет - 0.4^oC. Гипотермический эффект нового гептапептида сохраняется на протяжении 40 мин после инъекции (отличия от контроля достоверны, P < 0.05). В данных условиях [Dh-Pro⁶]ДМ не оказывает влияния на динамику температуры кожи хвоста.

В качестве препарата сравнения использовали дерморфин (ДМ). ДМ, вводимый в/б в дозах 0.05, 0.5 и 5 мг/кг (наиболее эффективна доза 0.5 мг/кг), вызывает дозо- и температурозависимый терморегуляторный ответ.

В холодной среде - гипотермию (максимум ΔT_rt = -1,8^oC), сохраняющуюся на протяжении по меньшей мере 120 мин после инъекции. В данных условиях ДМ не оказывает существенного воздействия на динамику температуры кожи хвоста.

В комфортной зоне ДМ также вызывает гипотермию (максимум ΔT_rt = -0,7^oC), сохраняющуюся на протяжении по меньшей мере 120 мин после инъекции. В данных условиях ДМ вызывает двухфазную сосудистую реакцию. I фаза - реакция вазодилатации (максимум ΔT_ts = 2,5^oC) - через 25-30 мин сменяется II фазой - продолжительной (по меньшей мере, 60 мин) реакцией вазоконстрикции (максимум ΔT_ts = -0,8^oC).
В жаркой среде ДМ вызывает позднюю (через 50 мин после инъекции) гипертермию (максимум ΔT_rt = -0,3^oC), сохраняющуюся на протяжении по меньшей мере 70 мин. В данных условиях ДМ не оказывает существенного воздействия на динамику температуры кожи хвоста.

Итак, ДМ вызывает гипотермию, которая ярко выражена в холоде и ослабляется по мере повышения окружающей температуры, сменяясь гипертермией в жаре. При этом ДМ обладает сосудодвигательным эффектом, который проявляется в термонейтральной зоне. Таким образом, ДМ оказывает угнетающее воздействие на функциональное состояние системы терморегуляции и компенсаторные терморегуляторные вазомоторные реакции.

Терморегуляторные эффекты нового гептапептида [Dh-Pro⁶]ДМ в значительной степени отличаются от таковых у препарата сравнения. В отличие от препарата сравнения новый гептапептид [Dh-Pro⁶]ДМ вызывает только гипотермический ответ во всех трех температурных режимах. Кроме того, заявляемый пептид обладает ярковыраженным сосудорасширяющим эффектом, который значительно превосходит эффект препарата сравнения. При этом вторая фаза сосудистой реакции, характерной для ДМ, у заявляемого пептида отсутствует.

Пример 4. Тест Tail flick. Новый гептапептид [D-Pro⁶]ДМ вводили в/б в дозе 0.5 мг/кг. Данные, приведенные в табл. 9, свидетельствуют о том, что заявляемый пептид обладает анальгетическим эффектом. Анальгезия достигает значимого уровня через 20 минут после инъекции, сохраняется на протяжении 20-25 минут и составляет 16% (отличия от контроля достоверны, P < 0.05).

В качестве препарата сравнения использовали дерморфин. В данном тесте анальгетическая активность нового гептапептида [D-Pro⁶]ДМ оказалась практически в 10 раз выше анальгетической активности препарата сравнения.

Пример 5. В тестах Hole board и Open field пептид [D-Pro⁶]ДМ вводили в/б в дозе 0.5 мг/кг за 20 мин до начала эксперимента.

В тесте Open field после введения нового гептапептида наблюдалось возрастание количества стоек (отличия от контроля достоверны, P < 0.05), (табл. 10). Полученные результаты свидетельствуют о стимулирующем воздействии нового гептапептида на вертикальный компонент ориентировочно-исследовательского поведения животных в данных экспериментальных условиях.

В тесте Hole board [D-Pro⁶]ДМ вызывал снижение длины пробега и количества обследованных отверстий (отличия от контроля достоверны, P < 0.05), (табл. 11). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в данных экспериментальных условиях пептид оказывает угнетающее воздействие на двигательную активность и специфический видовой исследовательский компонент ориентировочно-исследовательского поведения животных.

Для сравнения с новым гептапептидом использовали дерморфин. В тесте Open field ДМ обладает ярковыраженным угнетающим воздействием на двигательную активность, ориентировочно-исследовательское поведение и эмоциональное состояние животных. В тесте Hole board эффект ДМ выражен слабее: под влиянием пептида значимо снижается только количество обследованных отверстий.

Таким образом, поведенческие эффекты нового гептапептида в значительной степени отличаются от эффектов дерморфина: в тесте Hole board угнетающее воздействие [D-Pro⁶]ДМ на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность выражено сильнее, чем у дерморфина. В тесте Open field эффекты дерморфина и [D-Pro⁶]ДМ имеют противоположную направленность: в отличие от дерморфина, новый гептапептид обладает стимулирующим воздействием на вертикальный компонент ориентировочно-исследовательского поведения, не оказывая влияния на двигательную активность и эмоциональное состояние животных.

Пример 6. В тесте непрерывной термометрии пептид [D-Pro⁶]ДМ вводили в/б в дозе 0.5 мг/кг. Результаты исследования представлены на фиг. 5, 6 и в табл. 12, 13.

В холодной среде заявляемый пептид вызывает гипотермию (максимум ΔT_rt = -1^oC), ) сохраняющуюся на протяжении 90 минут (отличия от контроля достоверны, P < 0.05) (фиг. 5, табл. 12).

В термонейтральной среде гептапептид [D-Pro⁶]ДМ вызывает слабовыраженную (максимум ΔT_rt = -0,2^oC) ) кратковременную (на протяжении 10 минут) гипотермию (отличия от контроля достоверны, P < 0.05) (фиг. 6, табл. 13).

В жаркой среде гептапептид [D-Pro⁶]ДМ не оказывает влияния на динамику температуры тела.

Ни в одной из трех экспериментальных ситуаций заявляемый пептид не вызывает изменений динамики температуры кожи хвоста.

В качестве препарата сравнения использовали дерморфин. Полученные данные свидетельствуют о том, что терморегуляторные эффекты нового гептапептида [D-Pro⁶]ДМ значительно ослаблены по сравнению с эффектами дерморфина.

Пример 7. Тест Tail flick. Новый гептапептид [Dh-D-Pro⁶]ДМ вводили в дозе 0.5 мг/кг. Данные, приведенные в табл. 14, свидетельствуют о том, что новый гептапептид обладает длительным ярковыраженным анальгетическим эффектом. Анальгезия достигает значимого уровня через 10 минут после инъекции и сохраняется на протяжении по меньшей мере 120 минут (отличия от контроля достоверны, P < 0.01). Величина анальгезии достигает 25%.

В качестве препарата сравнения использовали дерморфин. При внутрибрюшинном введении ДМ минимальная эффективная доза 5 мг/кг. При этом анальгетический эффект ДМ сохраняется на протяжении 60 минут.

Таким образом, новый гептапептид [Dh-D-Pro⁶] ДM в 10 раз эффективнее дерморфина и сохраняет анальгетическую активность как минимум в 2 раза дольше, чем дерморфин.

Дополнительно изучена терморегуляторная, сосудодвигательная активность [Dh-D-Pro⁶]ДМ и его способность влиять на поведенческую активность животных. Результаты сопоставимы с результатами, полученными при изучении нового гептапептида [Dh-Pro⁸]ДМ.

Таким образом, химическая модификация в аминокислотном остатке Pro природного гептапептида дерморфина существенно повышает его анальгетическую активность и изменяет соотношение ее уровня с уровнем терморегуляторной, сосудодвигательной активности, а также с уровнем его влияния на поведенческую активность исследуемых лабораторных животных.

Пример 8.

HCl•H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-3,4-dehydro-D-Pro-Ser-NH₂ синтезировали конденсацией фрагментами DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly и 2HCl•H-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe. Фрагменты синтезировали с применением тетрабутиламмонийных солей (ТБА) и пивалоил хлорида (PivCL). Для синтеза использовали производные D; L; DL аминокислот. Упаривание растворов проводили на вакуумном испарителе при 40^oC. Температуры плавления, определенные на столике для плавления Boetiys, даны без исправления. Контроль за синтезом и индивидуальность полученных соединений проверяли с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках с силикагелем фирмы Silufol (ЧСФР) при опрыскивании раствором нингидрина в системах растворителей:
1 - гексан: ацетон (3:2);
2 - этилацетат:ацетон:50% уксусная кислота (2:1:1);
3 - бензол:этанол (8:2);
4 - хлороформ:метанол:аммиак (7:2.5:0.5);
5 - хлороформ:метанол:аммиак (6:4:1);
6 - хлороформ:метанол:уксусная кислота (42:7:1);
7 - ацетон:бензол:уксусная кислота (2:1:1);
8 - хлороформ:метанол:аммиак (8:1.75:0.25);
9 - хлороформ:метанол (9:1);
10 - этанол:аммиак (7:3).

11 - изо-пропанол:муравьиная кислота:вода (20:1:5).

Далее по тексту в скобках после Rf указана система растворителей.

Все растворители абсолютировали соответствующим образом. Точки плавления не корректировали. Колоночную хроматографию проводили с использованием носителей Силикагель L-40/100 m и Silasorb 600 [LC] фирмы Chemapol (ЧСФР).

Принятые сокращения:
Ac - ацетат;
Вос - трет-бутилоксикарбонильная группа;
ОБТ - I-оксибензтриазол;
ДМФА - диметилформамид;
ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид;
PivCI - пивалоил хлорид;
ТБА - тетрабутиламмоний;
ТЭА - триэтиламин;
OSu - N-оксисукцинимидный эфир;
ДЦГК - N,N-дициклогексикарбодиимид;
OMe - метиловый эфир;
DiBoc - трет-бутилоксикарбонил;
ТСХ - тонкослойная хроматография.

I. Получение трипептида
HCl•H-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe.

DiBoc-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro
1. К 3,4-dehydro-DL-Pro 150 мг (1.326 ммоль) добавляли 2.83 мл (1.326 моль) 13% ТБА, упаривали 1 раз с этанолом, 1 раз с изо-пропанолом, 1 раз с бензолом, охлаждали до 0^oC.

2. К охлажденному раствору ТБА 3,4-dehydro-DL-Pro в 10 мл абс. этилацетата при охлаждении добавляли в сухом виде Di-Boc-Tyr-OSu 634.5 мг (1.326 моль), перемешивали 1 час при комнатной температуре на магнитной мешалке, за ходом реакции следили по ТСХ в системе (7).

По окончании реакции растворитель упаривали, добавляли воду, подкисляли NaHSO₄ (пятикратный избыток), до pH 3, экстрагировали 5 раз по 50 мл этилацетатом. Объединенные фракции этилацетата, промывали водой, 10% раствором KHSO₄, водой, сушили над MgSO₄, упаривали, высаждали из эфира гексаном (дважды). Осадок в виде порошка сушили в вакууме.

Выход 1.32 г (2.76 ммоль).

R_f = 0.382 (7).

DiBoc-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe.

DiBoc-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro 1,32 г (2.76 ммоль) растворяли в 20 мл ацетонитрила, добавляли избыток (1.3) N-гидроксисукцинимида 412.8 мг (3.59 ммоль), охлаждали до 0^oC и добавляли избыток (1.3) ДЦГК 810.88 мг (3.59 ммоль). Перемешивали на магнитной мешалке 1 час, охлаждали до 0^oC, добавляли избыток (1.3) HCl H-Ser-OMe 558.22 мг (3.59 ммоль) и избыток (1.3) ТЭА 0.5 мл (3.59 ммоль), перемешивали 1 час при охлаждении и двое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, добавляли 100 мл этилацетата, экстрагировали водой, 10% раствором KHSO₄, водой, 5% раствором NaHCO₃, водой, насыщ. раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили над MgSO₄, отфильтровывали, упаривали. Переосаждали дважды из ацетона гексаном. Полученный осадок сушили в вакууме.

Выход 1.38 г (2.38 ммоль) - 86.56%.

R_f = 0.238 (7), R_f = 0.812 (8).

Удаление Boc-защит с DiBoc-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe.

К 1.38 г (2.38 ммоль) DiBoc-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe добавляли 7.14 мл 1 н. HCl/CH₃COOH и 2% анизола (0.14 мл анизола). Выдерживали 45 минут при комнатной температуре, упаривали, высаждали из метанола эфиром.

Выход: 860 мг (1.93 ммоль). R_f = 0.512 (8).

II. Получение тетрапептида DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly
DiBoc-Tyr-D-Ala.

1. D-Ala избыток (1.3) - 1.52 г (17.0 ммоль) растворяли в 13 мл воды, 8.8 мл ацетонитрила, прибавляли избыток (1.3) ТЭА - 2.38 мл (17.0 ммоль). Охлаждали до -20^oC и прибавляли к раствору N 2.

2. DiBoc-Tyr - 5 г (13.1 ммоль) растворяли в 40 мл ацетонитрила, прибавляли избыток (1.1) ТЭА - 2.02 мл (14.4 ммоль). Охлаждали до -10^oC и прибавляли избыток (1.1) PivCI - 1.77 мл (14.4 ммоль). Реакционную смесь выдерживали 20 минут при -10^oC и затем прибавляли раствор N 1.

Реакционную смесь выдерживали на магнитной мешалке, постепенно повышая температуру до +10^oC, и 1 час при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, добавляли 10 мл H₂O, подкисляли 3-кратным избытком KHSO₄ до pH 3. Водный раствор экстрагировали 3 раза по 50 мл этилацетата. Объединенные фракции этилацетата промывали 10% раствором KHSO₄, водой, насыщенным раствором NaCl, сушили над MgSO₄ упаривали, высаждали из этилацетата гексаном, сушили в вакууме.

Выход: 4.8 г (10.6 ммоль) - 80.9%.

R_f = 0.363 (7), R_f = 0.571 (8), R_f = 0.512 (9).

Boc-Phe-Gly.

1. К 1.8 г Gly (24 ммоль) в 20 мл H₂O и 20 мл ацетонитрила добавляли 3.36 мл ТЭА (24 ммоль), охлаждали до -20^oC и добавляли к раствору N 2.

2. 5.3 г Boc-Phe (20 ммоль) растворяли в 70 мл ацетонитрила, добавляли 3.08 мл ТЭА (22 ммоль). Охлаждали до -20^oC и прибавляли 2.71 мл PivCI (22 ммоль). Смесь выдерживали при -10^oC 20 мин и затем прибавляли раствор N 1, выдерживали 1 час при -20^oC и 2 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, добавляли 10 мл воды, подкисляли 5-кратным избытком NaHSO₄, до pH 3 экстрагировали 3 раза по 50 мл этилацетатом. Фракции этилацетата объединяли, промывали водой, 10% раствором KHSO₄, водой, насыщенным раствором NaCl, сушили над MgSO₄. Отфильтрованный раствор упаривали, при упаривании выпадает осадок, заливали эфиром, отфильтровывали, сушили в вакууме.

Выход: 4.27 r (13.25 ммоль) - 66%.

R_f = 0.415 (3), R_f = 0.214 (7), R_f = 0.390 (1).

Удаление Boc-защиты с Boc-Phe-Gly.

К 2 г пептида (6.2 ммоль) добавляли 9.3 мл 1 н. раствора HCl/CH₃COOH и выдерживали 45 минут при комнатной температуре. Затем заливали эфиром, растирали (эфир меняют 3 раза), сушили в вакууме.

Выход 4.42 г (17.2 ммоль), R_f = 0.633 (10), R_f = 0.835 (5).

Обессоливание HCl•H-Phe-Gly.

Количество смолы Амберлист (АсО форма) брали в 2-кратном избытке - 58.5 мл (17.2 ммоль 2 = 34.4 ммоль).

К 4.42 г (17.2 ммоль) пептида прибавляли 58.5 мл смолы Амберлист (АсO форма) в 40% этаноле, перемешивали 20 минут на магнитной мешалке, переносили на стеклянный фильтр, отмывали 40% этанолом, упаривали. При упаривании выпадал осадок, который промывали на фильтре эфиром. Осадок сушили в вакууме.

Выход: 1.32 г (5.93 ммоль).

R_f = 0.701 (3), R_f = 0.687 (5), R_f = 0.013 (8), R_f = 0.375 (2).

DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly.

1. К 2.85 г H-Phe-Gly (12.82 ммоль) в 44 мл ацетонитрила и 6,5 мл воды добавляли 1.79 мл ТЭА (12.82 ммоль), охлаждали до -20^oC.

2. 4.83 г DiBoc-Tyr-D-Ala (10.68 ммоль) растворяли в 44 мл ацетонитрила, добавляли 1.64 мл ТЭА (избыток 1.1 - 11.75 ммоль), охлаждали до -20^oC и прибавляли 1.445 мл PivCI (11.75 ммоль). Смесь выдерживали при -10^oC 20 минут и охлаждали до -20^oC, прибавляли раствор N 1. Реакционную смесь перемешивали 1 час при -20^oC, 2 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, подкисляли водный раствор 5-ти кратным избытком NaHSO₄. Экстрагировали 5 раз этилацетатом по 60 мл, объединенные фракции этилацетата, промывали водой, 10% раствором KHSO₄, водой; сушили над MgSO₄, упаривали. Переосаждали из эфира, сушили в вакууме.

Выход: 5.71 г (8.69 ммоль). R_f = 0.352 (7).

III. Получение гептапептида.

DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe.

670 мг (1.02 ммоль) DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly, растворяли в ДМФА, прибавляли избыток (1.1) БТ 151.5 мг (1.12 ммоль), охлаждали до 0^oC, прибавляли избыток (1.1) ДЦГК 253.4 мг (1.12 ммоль), перемешивали 30 минут на магнитной мешалке, прибавляли избыток (1.2) - 546.6 мг (1.22 ммоль) 2HCl•H-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe и избыток (2.4) - 0.34 мл (2.45 ммоль) ТЭА в ДМФА. Реакционную смесь перемешивали 1 час при охлаждении и двое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, добавляли 100 мл этилацетата, экстрагировали водой, 10% раствором KHSO₄, водой, 5% раствором NaHCO₃, водой, насыщ. раствором NaCl. Сушили над MgSO₄. Отфильтровывали, упаривали. Переосаждали из этилацетата гексаном, откачивали в вакууме.

Выход: 410 мг (0.41 ммоль). T_пл = 142-145^oC.

R_f = 0.77 (6), R_f = 0.88 (8), R_f = 0.8 (9). R_f = 0.263 (10).

DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-NH₂.

410 мг (0.41 ммоль) полученного пептида заливали метанолом, насыщенным аммиаком и оставляли на двое суток при T = 37^oC. Затем реакционную смесь упаривали: 2 раза с этилацетатом, 2 раза с абс. метанолом; высаждали из абс. метанола эфиром.

Выход: 208.5 мг (0.212 ммоль). R_f = 0.693 (5), R_f = 0.088 (9).

Удаление Boc-защит с.

DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-NH₂.

К 208.5 мг (0.212 ммоль) пептида прибавляли 2% анизола, 0.64 мл 1 н. раствора HCl/CH₃COOH, выдерживали при T_комн минут, упаривали. Переосаждали из абс. метанола этилацетатом.

Выход: 190 мг (0.193 ммоль).

R_f = 0.786 (11), R_f = 0.926 (5), R_f = 0.202 (4), R_f = 0.057 (8).

Выделение
HCl•H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-3,4-dehydro-D-Pro-Ser-NH₂ из HCl•H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-NH₂ методом колоночной хроматографии.

120 мг полученного пептида растворяли в 1 мл метанола, сажали на 2 г силикагеля марки L-40/100, предварительно обработанного хлороформом, насыщенным аммиаком. Деление проводили на колонке диаметром 19 мм (носитель - Silasorb 600 [LC] ), приготовленной в гексане. При делении использовали ступенчатый градиент (хлороформ, насыщенный аммиаком: метанол). Выделенный пептид упаривали, растворяли в метаноле, добавляли HCl, высаждали абс. этилацетатом, осадок отфильтровывали, сушили в вакууме.

Выход: 40 мг; R_f = 0.233 (4).

Гептапептид может быть использован в медицине, а именно в фармакологии. Синтезированы новые физиологические активные гептапептиды общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-x-Ser-NH₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин. Для изменения физиологической активности известного природного гептапептида дерморфина общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂, предложено осуществлять химическую модификацию в 6-м аминокислотном остатке Pro. Новые соединения обладают анальгетической активностью, сочетающейся с терморегуляторной и/или с сосудодвигательной активностью, и/или влиянием на поведенческую активность испытуемых. 2 з.п. ф-лы, 14 табл., 6 ил.

1. Гептапептид общей формулы
H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH₂,
где X - D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин,
обладающий анальгетической активностью, сочетающейся с терморегуляторной и/или с сосудодвигательной активностью, и/или с влиянием на поведенческую активность испытуемого. 2. Способ получения физиологически активных гептапептидов путем химической модификации дерморфина общей формулы
H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂,
отличающийся тем, что химическую модификацию осуществляют в аминокислотном остатке Pro. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что химическую модификацию осуществляют путем замены аминокислотного остатка L-Pro на D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин.