СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ АКТИВНОСТИ СЫРЬЯ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ТРОМБОПЛАСТИНА ПОЛНОГО РАСТВОРИМОГО ДО И ВО ВРЕМЯ ЛИОФИЛИЗАЦИИ Российский патент 2001 года по МПК A61K35/30 C12N9/48 

Изобретение относится к медицине и касается сохранения активности полученного сырья для изготовления тромбопластина растворимого до и во время лиофилизации. Тромбопластин используется при определении активности протромбинового комплекса в одностадийном тесте Квика.

В качестве прототипа нами использован патент 1775897 Кулене В.В, с соавт. на "Способ получения диагностического агента для определения протромбинового времени" (1).

Существенным недостатком прототипа является то, что использование 0,005 М вероналового буфера, имеющего щелочную среду (pH 7,5-7,9), приводит к защелачиванию сырья. Согласно исследованиям Д. М. Зубаирова и соавторов (2) оптимальные значения проявления активности тромбопластина при pH 6,0-7,0; защелачивание среды приводит к снижению его активности. Авторами выбрана щелочная буферная система без подкисления сырья. Следовательно, дальнейшее защелачивание его путем использования вероналового буфера при хранении до лиофилизации и в процессе ее приведет к снижению активности. Использование лактозы или декстрана в качестве криопротектора также ведет к снижению активности сырья, так как по данным Н.Н. Старицыной (3) эти углеводы не являются наиболее эффективными криопротекторами.

Целью настоящего изобретения является сохранение активности сырья из серого вещества кадаверного головного мозга, используемого для изготовления тромбопластина растворимого, до и во время лиофилизации.

Поставленная цель достигается тем, что используют специальные добавки, сохраняющие активность сырья. Таковыми являются антиоксиданты, препятствующие биологическому окислению, криопротекторы, предотвращающие разрушение при низких температурах, и буферные системы, поддерживающие значения pH в пределах 6,0-7,0. Нами применен метабисульфит натрия, который, по данным (4), препятствует перекисному окислению липидов, входящих в состав сырья, следовательно, способствует сохранению его активности. В качестве криопротектора выбрана сахароза, эффективно сохраняющая сырье при замораживании, согласно исследованиям Старицыной Н.H. (2). Буферная система представлена буфером, содержащим лимонную кислоту - цитрат натрия, поддерживающим значения pH в вышеуказанных пределах. Полученное сырье смешивают с этими добавками и тестируют, проводя контроль pH и активности (в секундах) в тесте Квика с контрольной плазмой (смеси свежей донорской плазмы не менее 10 человек). Если за время хранения замороженного (-30±2^oC ) сырья до лиофилизации значения pH находятся в пределах 6,5-7,0, а активность не превышает 15 с, то сырье готово к сублимации. Такую же проверку проводят после лиофилизации.

Время хранения замороженного сырья до лиофилизации, в течении которого активность не снижается, увеличивается до 4 недель. Это важно при создании технологии изготовления тромбопластина растворимого в производстве. Применение криопротектора также позволяет сохранить активность сырья и во время лиофилизации.

ПРИМЕР ОПИСАНИЯ СПОСОБА
Высокоактивное сырье для изготовления тромбопластина растворимого получают из серого вещества кадаверного головного мозга. Гомогенат серого вещества двукратно замораживают при минус 40^oC и оттаивают при +36^oC, затем двукратно разводят равным объемом очищенной воды при +36^oC и центрифугируют при 600 G и температуре +5^oC в течение 30 минут, получая супернатант - сырье для изготовления тромбопластина растворимого с высокой тромбопластиновой активностью. К нему добавляют сахарозу для получения 2% конечного раствора. Растворяют метабисульфит натрия для получения 0,005 М раствора и добавляют буфер, содержащий лимонную кислоту - цитрат натрия с pH 6,0-6,5 в количестве 1 мл на 100 мл супернатанта. Проверяют pH и активность протромбинового комплекса с контрольной плазмой сразу после приготовления, затем через 1, 2, 3 и 4 недели хранения в замороженном (-30±2^oC) состоянии. Если полученные значения удовлетворяют требованиям (pH 6,5-7,0, а активность - не более 15 с), то смесь готова к сублимации. После лиофилизации проводят аналогичный контроль.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (проведены на базе лаборатории биохимии крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови)
Приготовлены 5 серий сырья для производства тромбопластина растворимого без использования консервирующих добавок. Результаты приведены в таблице 1. Они свидетельствуют о том, что хранение сырья, приготовленного без использования консервирующих добавок, приводит к значительному снижению его активности.

Разработанный способ сохранения активности сырья до и во время лиофилизации использован при изготовлении 7 серий реактива. Результаты приведены в таблицах 2 и 3. Они свидетельствуют о том, что использованные добавки сохраняют высокую активность, равную 14,5-15,0 с, и pH 6,5-7,0 в течение не менее 4 недель хранения и после лиофилизации.

Таким образом, разработанный нами способ позволил сохранить активность сырья в течение 4 недель в замороженном (-30±2^oC) состоянии и во время лиофилизации. Он найдет применение при создании технологии изготовления тромбопластина растворимого в научно-производственных объединениях и научно-исследовательских институтах. Тромбопластин растворимый удобен и прост при выполнении теста Квика.

ЛИТЕРАТУРА
1. А. С. N 1775897 (СССР) А 61 К 35/30, C 12 N 9/48 Способ получения диагностического агента для определения протромбинового времени / Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии. Кулене В.В., Стрейкувене И.К., Синкувене 1 Д.С., Герасимене Г.Б., Паулавичене Г.

2. 3убаиров Д.М., Свитенок Г.Ю., Ченборисова Г.Ш. Необратимая pH денатурация тканевого тромбопластина // Вопросы медицинской химии. -1991. - N 5. - С. 31-33.

3. Старицына Н.Н. Получение и изучение реактива для определения активированного парциального тромбопластинового времени на основе фосфолипидов сои: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - С-Пб., 1993. - 17.

4. Белоус А.М., Бондаренко В. А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. - Киев: Наукова Думка, 1982. - С. 132-133.

Изобретение относится к медицине и касается сохранения активности сырья для изготовления тромбопластина растворимого. Сущность изобретения: в сырье, полученное из гомогената серого вещества кадаверного головного мозга, вводят сахарозу в количестве, необходимом для получения 2% конечного раствора, растворяют метабисульфит натрия для получения 0,005 М раствора и добавляют буфер, содержащий лимонную кислоту, - цитрат натрия с рН 6,0-6,5 в количестве 1 мл на 100 мл супернатанта. Технический результат: данный способ позволяет увеличить срок хранения сырья для изготовления тромбопластина растворимого в замороженном (-30 ± 2°С) состоянии до 4 недель и предотвратить разрушение во время лиофилизации. 3 табл.

Способ сохранения активности сырья для изготовления тромбопластина, растворимого до и во время лиофилизации, отличающийся тем, что в полученное из серого вещества кадаверного головного мозга сырье вводят сахарозу в количестве, необходимом для получения 2% конечного раствора, растворяют метабисульфит натрия для получения 0,005 М раствора, добавляют буфер, содержащий лимонную кислоту - цитрат натрия с рН 6,0 - 6,5 в количестве 1 мл на 100 мл сырья и получают целевой продукт, сохраняющий высокую активность, равную 14,5 - 15,0 с, и рН 6,5 - 7,0 в течение 4 недель хранения в замороженном (-30±2^oC) состоянии и во время лиофилизации.