СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА СОХРАНЕНИЯ АКТИВНОСТИ СЫРЬЯ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ РЕАКТИВА ТРОМБОПЛАСТИНА ПОЛНОГО РАСТВОРИМОГО ДО И ВО ВРЕМЯ СУБЛИМАЦИИ Российский патент 2005 года по МПК A61K35/30 C12N9/48 

Изобретение относится к медицине и касается способа повышения качества условий сохранения активности сырья для изготовления реактива тромбопластина полного растворимого, используемого при определении протромбинового времени (ПВ, с) плазмы (крови), до и во время сублимации.

Отражая состояние внешнего пути свертывания крови, протромбиновое время широко используется в клинико-диагностических лабораториях для скринингового исследования свертывающей системы, контроля терапии антикоагулянтами непрямого действия, диагностики заболеваний печени, выявления дефицита витамина К. Принцип метода основан на активации коагуляционного каскада тканевым тромбопластином - аналогом тканевого фактора.

В качестве прототипа использован наш патент №2161975 на “Способ сохранения активности сырья для изготовления тромбопластина полного растворимого до и во время лиофилизации” (1).

Существенным недостатком прототипа является то, что необходимо использовать несколько защитных веществ, сохраняющих активность сырья. Таковыми являются антиоксиданты, криопротекторы, а также буферные системы. Приготовление и смешивание их с полученным сырьем, четырехкратное контролирование значений рН и активности (в секундах) с контрольной плазмой (смеси свежей плазмы не менее 10 доноров) являются процедурами длительными и трудоемкими, требующими наличия четырех веществ, а также приготовления буфера.

Целью настоящего изобретения является повышение качества и продолжительности сохранения сырья из серого вещества кадаверного головного мозга до 10 недель перед сублимационной сушкой и во время ее проведения.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве защитных веществ используют только одно вещество, ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол), который, по данным литературы (2, 3, 4, 5), стабилизирует коагуляционную активность тромбопластина и увеличивает устойчивость к термической денатурации при сублимационной сушке. Он также предотвращает окислительные модификации белковой и липидной части тромбопластина в процессе хранения. Следовательно, ионол выполняет функции антиоксиданта, криопротектора и буферной системы одновременно, что позволяет после смешивания сырья с этим защитным веществом тестировать сырье однократно, проводя контроль рН и активности (ПВ, с). Во время хранения сырья при (-40±2)°С до сублимации, значения рН находятся в пределах 6,5-7,4, а активность не превышает 14 с. Время хранения замороженного сырья, в течение которого активность не снижается, увеличивается до 10 недель. Это важно при создании производственной технологии изготовления биологического реактива тромбопластина растворимого.

ПРИМЕР ОПИСАНИЯ СПОСОБА

Высокоактивное сырье для изготовления тромбопластина растворимого получают из серого вещества кадаверного головного мозга согласно нашему патенту №2260111 на "Способ получения высокоактивного сырья для изготовления тромбопластина полного растворимого" (6). Гомогенат серого вещества двукратно замораживают при -40°С и оттаивают при +36°С, затем двукратно разводят равным объемом очищенной воды при +36°С и центрифугируют при 600G и температуре +5°С в течение 30 минут, получая супернатант - сырье для изготовления тромбопластина растворимого с высокой тромбопластиновой активностью. К нему добавляют ионол для приготовления 0,0001 М конечного раствора. Проверяют рН и активность (ПВ, с) с контрольной плазмой сразу после приготовления, затем по необходимости - через 4 и 10 недель хранения при (-40±2)°С. Если полученные значения удовлетворяют требованиям (рН - 6,4-7,4, а активность - не более 14 с), то смесь готова к сублимации. После сублимационной сушки проводят аналогичный контроль.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

проведены на базе лаборатории биохимии крови и НПО ГУ Кировского НИИ гематологии и переливания крови.

Приготовлено 5 серий реактива тромбопластина растворимого без использования защитных веществ и 7 серий с защитным веществом. Стабильность реактива с защитным веществом определяли методом ускоренной деградации при хранении в течение одного месяца при +37°С. Деградация в таких условиях приравнивается к 1 году хранения реактива при 4-8°С. Результаты приведены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1
Характеристики реактива, приготовленного без защитных веществ, при хранении№серииСроки исследований (недели)рНПВ(с)Исходные410после сублимацииисходные410после сублимации0104036,407,007,158,2516,518,019,521,00204037,658,058,108,6018,320,520,522,00404037,187,707,858,1015,018,521,922,50504037,227,857,908,3014,519,020,022,00704037,127,858,058,3515,018,019,520,0Хср7,117,697,818,3215,8618,8020,2821,50±m0,200,180,170,080,690,460,440,45

Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что хранение сырья, приготовленного без использования защитных веществ, вызвало его значительное защелачивание; значения рН изменились с 7,11 до 8,32. Такие изменения кислотно-щелочного баланса привели к недопустимому снижению активности сырья; значения ПВ (с) изменились с 15,86 до 21,50.

Таблица 2
Характеристики реактива, приготовленного с использованием защитного вещества, при хранении№серииСроки исследованийрНПВ(с)до сублимациипосле сублимациипосле деградациидо сублимациипосле сублимациипосле деградации3103036,456,506,6012,512,015,53203036,606,506,5512,512,016,04003036,556,606,6012,014,518,08103036,506,556,5512,514,015,58203036,606,556,6512,514,016,51004036,856,856,8013,514,017,01104036,856,906,9013,014,014,5Хср6,636,646,6612,6413,5016,14±m0,060,060,050,180,390,43

Результаты, приведенные в таблице 2, показывают изменения значений рН и активности (ПВ, с) 7 серий реактива тромбопластина растворимого, приготовленного с использованием в качестве защитного вещества ионола (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола). При его использовании значения рН практически не изменились и равнялись 6,63 и 6,64, что позволило сохранить высокую активность сырья, равную 12,64 и 13,50 в течение 10 недель хранения до сублимационной сушки и после проведения ее. После ускоренной деградации, приравниваемой к одному году хранения реактива, значения рН и активности (ПВ, с) изменились незначительно.

Таким образом, разработанный нами способ позволяет сохранять активность сырья до сублимационной сушки в течение 10 недель при (-40±2)°С, а также во время сублимации и при последующем хранении полученного реактива. Он найдет применение при создании производственной технологии изготовления реактива тромбопластина растворимого.

ЛИТЕРАТУРА

1. Патент №2161975 от 20.01.2001 г. Способ сохранения активности сырья для изготовления тромбопластина полного растворимого до и во время лиофилизации /ГУ КНИИГ и ПК, Репнякова Е.М., Тарасова Л.Н., Савиных Е.Ю., Гонин Л.Н., Решетникова Н.Р.

2. Вартанян Л.С., Гуревич С.М. Влияние ионола на метаболизм супероксидных радикалов в печени мышей /Вопросы медицинской химии. -1999.-т. 45.-вып.4.-с.314-320.

3. Самуилов В.Д., Барский Е.Л., Самуилов Ф.Д. Взаимодействие антиоксиданта 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола с фотосистемой 2 хлоропластов /Биохимия. -1995. -т. 60. -вып.11. -с.1853-1859.

4. Барский Е.Л., Кравцова Т.Р., Самуилов В.Д., Самуилов Я.Д. Действие антиоксидантов фенольной природы на фотосинтетический перенос электронов в хлоропластах /Биохимия. -1992. -т. 57. -вып.9. -с.1427-1431.

5. Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. -Казань: ФЭН. -2000 г. -с.49-51.

6. Патент №2260111 от 10.12.2000 г. Способ получения высокоактивного сырья для изготовления тромбопластина полного растворимого /ГУ КНИИГ и ПК, Тарасова Л.Н., Репнякова Е.М., Савиных Е.Ю., Решетникова Н.Р., Гонин Л.Н.

Изобретение относится к медицине и касается сохранения активности сырья для изготовления реактива тромбопластина полного растворимого. Способ повышения качества сохранения активности сырья до и во время сублимационной сушки заключается в том, что в сырье, полученное из гомогената серого вещества мозга, вводят ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) в количестве, необходимом для приготовления 0,0001 М конечного раствора. Добавление этого вещества к сырью обеспечивает сохранение его высокой активности, равной 12,5-16,0 секунд, позволяет увеличить срок его хранения при (-40±2)С° до 10 недель перед проведением сублимации и предотвратить снижение активности в процессе ее. 2 табл.

Способ повышения качества сохранения активности сырья для изготовления реактива тромбопластина растворимого до и во время сублимационной сушки, отличающийся тем, что в полученное из серого вещества кадаверного головного мозга сырье вводят ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) в количестве, необходимом для приготовления 0,0001 М конечного раствора, и получают целевой продукт, сохраняющий высокую активность, равную 12,5-16,0 с, при рН 6,4-7,4 в течение 10 недель хранения при (-40±2)°С и во время сублимационной сушки.