РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ ЧЕЛОВЕКА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2001 года по МПК C12N15/17 C12N15/62 C12N15/70 

Изобретение относится к генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано для создания лекарственных препаратов человеческого инсулина.

Инсулин синтезируется клетками островков Лангерганса поджелудочной железы в виде предшественника - препроинсулина, состоящего из 110 аминокислотных остатков (а. о.) с молекулярной массой 11981 Да. Первые 24 а. о. сигнального пептида отщепляются в процессе секреции с образованием проинсулина. В дальнейшем проинсулин подвергается ограниченному протеолизу с выщеплением C-пептида (35 а. о.), приводящему к образованию "зрелого" инсулина, состоящему из двух цепей, соединенных двумя дисульфидными связями. Цепь A состоит из 21, а цепь B - из 30 а. о. Аминокислотная последовательность препроинсулина с обозначением его цепей приведена ниже:
MALWMRLLPL LALLALWGPD PAAA FVNQHL CGSHLVEALY LVCGERGFFY TPKTRREAED LQVGQVELGG GPGAGSLQPL ALEGSLQKRG IVEQCCTSIC SLVQLENVCN (Сигнальный пептид: 1 - 24 а. о., B - цепь: 25-54 а. о., C-пептид: 57-87 а. о., A-цепь: 90-110 а. о. Дисульфидные связи: межцепочечные 31-96 и 43-109, внутрицепочечная 95-100 а. о.

Современным способом получения инсулина человека является технология с использованием рекомбинантных ДНК.

Наиболее близким аналогом изобретения является рекомбинантная плазмида pInsR, кодирующая гибридный белок, содержащий проинсулин человека. [Патент RU 2115729]. Эта плазмида сконструирована на основе плазмиды pKK223-3 (фирмы Pharmacia Biotech), имеющей ген β-лактамазы (ампициллинрезистентности) и tac-промотор. После добавления в вреду культивирования индуктора изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) tac-промотор запускает синтез гибридного белка с гена, встроенного между сайтами EcoRI и HindIII. Гибридный белок, кодируемый плазмидой pInsR, состоит из аминокислотной последовательности иммуноглобулинсвязывающего домена белка A Staphylococcus aureus, соединенного через аминокислотный линкер Гли-Сер-Арг с аминокислотной последовательностью проинсулина человека.

Недостатком такой системы экспрессии является необходимость использования индуктора ИПТГ, что усложняет технологию и удорожает себестоимость этапа культивирования. Кроме этого, наличие tac-промотора на векторе требует использования специальных штаммов E. coli, имеющих lacI^q мутацию и сверхэкспрессирующих lac-репрессор. Такие штаммы типа JM101, JM109 или XLI-Blue не вполне соответствуют требованиям, предъявляемым к штаммам-продуцентам, в частности по стабильности синтезируемых рекомбинантных белков. Более продуктивные штаммы Escherichia coli, например: BL21, не имеют lacI^q мутацию, но имеют lon- и ompT-мутации по генам протеаз, что позволяет получать непротеолизированные рекомбинантные белки в больших количествах.

Общим недостатком использования в штаммах-продуцентах плазмид, имеющих только маркер ампициллинрезистентности является недостаточная эффективность селекции. Это связано с тем, что фермент β-лактамаза, расщепляющий ампициллин, является секретируемым белком, то есть через некоторое время культивирования штамма с плазмидой β-лактамаза накапливается в культуральной среде. Это приводит к инактивации как имевшегося в среде, так и добавляемого вновь ампициллина. В результате в ферментере накапливаются клетки штамма, утратившие плазмиду и неспособные синтезировать рекомбинантный белок.

Сущность изобретения заключается в создании рекомбинантных плазмид, содержащих ген для синтеза в клетках Е. coli гибридного белка, составной частью которого является проинсулин человека. Эти рекомбинантные плазмиды отличаются от известных аналогичных плазмид рядом признаков:
1) наличием промоторов, обеспечивающих высокую конститутивную экспрессию гена гибридного белка. Это при прочих равных условиях позволяет избежать добавления в среду культивирования индуктора (в аналоге добавление ИПТГ) синтеза гибридного белка, что упрощает технологию и снижает себестоимость;
2) ген гибридного белка, составной частью которого является проинсулин человека, отличается от известных аналогичных тем, что предшествующая проинсулину человека нуклеотидная последовательность кодирует N-концевой фрагмент фактора некроза опухолей α человека и фрагмент Гли-Глн-Гли-Сер- Гли-Арг. N-концевой фрагмент фактора некроза опухолей α человека стабилизирует гибридный белок и увеличивает его накопление в клетках E. coli в процессе биосинтеза. Фрагмент Гли-Глн-Гли-Гли- Сер-Арг выполняет функцию "шарнирного" мостика, делая гибридный белок двухдоменным: домен фактора некроза опухолей α и домен проинсулина, что позволяет домену проинсулина формировать правильную конформацию, необходимую для биологической активности. Кроме этого, "шарнирный" мостик из глициновых и сериновых аминокислотных остатков делает более доступным аргининовый остаток для ферментативного расщепления гибридного белка трипсиноподобными протеазами. Это увеличивает эффективность технологического этапа превращения проинсулина в "зрелый" инсулин;
3) вариантом гена гибридного белка является дополнительная нуклеотидная последовательность, кодирующая синтез на N-конце гибридного белка (перед последовательностью фрагмента фактора некроза опухолей α) фрагмента, состоящего из семи гистидиновых остатков. (Гис-)₇-фрагмент позволит не только проводить очистку гибридного белка методами металлохелатной хроматографии, но удалять примеси фрагмента фактора некроза опухолей α от "зрелого" инсулина после этапа ферментативного расщепления гибридного белка;
4) наличием двух генов устойчивости к антибиотикам ампициллину и аминогликозидам: канамицину, неомицину и G-418. Устойчивость к аминогликозидам обусловливается цитоплазматическим ферментом аминогликозидфосфотрансферазой, который в отличие от β-лактамазы не секретируется в питательную среду при культивировании. Это обеспечивает лучший отбор клеток, сохранивших рекомбинантную плазмиду, и, как следствие, более высокий уровень синтеза гибридного белка и стабильность штамма-продуцента.

Для создания рекомбинантной плазмиды с промоторами, обеспечивающими высокую конститутивную экспрессию гена гибридного белка (с целью избежать необходимости добавлять индуктор в среду культивирования) и конструирования самого гена гибридного белка была использована плазмида pTNF329 [Шмелев В. А. и др., Молек. Генет. Микроб. Вирусол.- 1995.- N 1.-С. 9-14]. N-концевой фрагмент гена фактора некроза опухолей α человека с предшествующими промоторами A2 и A3 фага T7 и рибосомсвязывающим сайтом был амплифицирован 30 циклами (92^oC, 30 сек; 62^oC, 45 сек; 72^oC, 45 сек) с помощью Tag-полимеразы и праймеров: CAATTGTAGA- CAGCCTGATAAGTCG и GGATCCGCCTTGGCCCTTGAAGAG. Амплифицированный фрагмент размером 0,48 т.п.н. был обработан рестриктазами MunI и BamHI. Фрагмент ДНК, кодирующий проинсулин человека, был амплифицирован 30 циклами (92^oC, 30 сек; 65^oC, 30 сек; 72^oC, 30 сек) с помощью Tag-полимеразы и праймеров: GGATCCCGCTTTGTTAACCAACAC и AAGCTTAGTTGCAATAGTTC. Амплифицированный фрагмент размером 0,27 т.п.н. был обработан рестриктазами HindIII и BamHI. После рестрикции оба амплифицированных фрагмента были смешаны и лигированы с плазмидой pKK223-3, предварительно обработанной рестриктазами EcoRI и HindIII. После трансформации в штамм HB2151 E. coli отобраны рекомбинантные плазмиды, придающие клеткам устойчивость к ампициллину, содержащие вставку фрагмента ДНК размером 0,75 т.п.н. и кодирующие синтез гибридного белка с молекулярной массой 16,8 кДа по данным электрофореза в 15%-ном ПААГ-ДСН.

Полученная рекомбинантная плазмида pKT-INS характеризуется следующими признаками:
- размер 5,3 т.п.н.,
- содержит вслед за tac-промотором промоторы A2 и A3 фага T7,
- содержит между сайтами рестриктаз ClaI и HindIII ген, кодирующий синтез гибридного белка размером 154 а. о. с молекулярной массой 16,8 кДа, состоящего из N-концевого фрагмента фактора некроза опухолей α, соединенного через пептидный фрагмент Гли-Глн-Гли-Гли-Сер-Арг с аминокислотной последовательностью проинсулина человека,
- имеет характерные сайты рестрикции: EcoRI-сайт, находящийся между промоторами A2 и A3, KpnI-сайт, находящийся между промотором A3 и рибосомсвязывающим сайтом, ClaI-сайт между рибосомсвязывающим сайтом и фрагментом гена фактора некроза опухолей α, BamHI-сайт, находящийся между фрагментами генов фактора некроза опухолей α и проинсулина человека, 2 PstI-сайта в гене проинсулина, HindIII- сайт позади гена проинсулина человека;
- содержит ген гибридного белка с последовательностью N1
Для создания рекомбинантной плазмиды с вариантом гена, кодирующим синтез гибридного белка с семью гистидиновыми остатками на N-конце, плазмидную ДНК pKT-INS обрабатывали рестриктазой ClaI дефосфорилировали и затем лигировали с фосфорилированным олигонуклеотидным дуплексом
CGAATGAGCCACCATCATCACCATCATCA
TTACTCGGTGGTAGTAGTGGTAGTAGTGC.

После трансформации лигазной смеси в штамм E. coli HB2151 отобраны рекомбинантные клоны, устойчивые к ампициллину и синтезирующие гибридный белок. Плазмидная ДНК из этих клонов была выделена и наличие (Гис-)₇-фрагмента было подтверждено отсутствием ClaI-сайта и в ПЦР с праймерами CGAATGAGCCACCATCATCACCATCATCA и CAATTGAAGGGAATAAGGGCGACACG.

Полученная рекомбинантная плазмидная ДНК pKHT-INS, отличается от плазмиды pKT-INS следующими признаками:
- кодирует гибридный белок размером 164 а. о. с молекулярной массой 18,1 кДа, состоящий из N-концевого домена для металлохелатной хроматографии состава (Гис-)₇, N-концевого фрагмента фактора некроза опухолей α, соединенного через пептидный фрагмент Гли-Глн-Гли-Гли-Сер-Арг с аминокислотной последовательностью проинсулина человека,
- отсутствует между рибосомсвязывающим сайтом и геном гибридного белка ClaI-сайт, в который интегрирован синтетический фрагмент ДНК, кодирующий (Гис-)₇-домен.

- содержит ген гибридного белка с последовательностью N2
Для создания рекомбинантной плазмиды с двумя генами антибиотикорезистентности к ампициллину и канамицину использовали плазмиды pVE10 и pUC4K. Плазмида pVE10 является делеционной производной от pBR322, имеет размер 1,8 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), уникальные сайты EcoRI, ClaI, PstI и содержит участок начала репликации и ген β-лактамазы [Шмелев В. А. и др., Молек. Генет. Микроб. Вирусол. -1991. -N 10. -С.3-8]. Плазмида pUC4K [GenBank Accession Number X06404] имеет размер около 4 т.п.н. и содержит фрагмент Tn:: 903, фланкированный инвертированными повторами сайтов EcoRI, BamHI, SalI и PstI. В этом фрагменте находится ген аминогликозидфосфотрансферазы, придающий клеткам устойчивость к антибиотикам канамицину, неомицину и G-418. Ген аминогликозидфосфотрансферазы с собственным промотором был амплифицирован 30 циклами (92^oC, 30 сек; 60^oC, 45 сек; 72^oC, 45 сек) с помощью Tag-полимеразы и праймеров: TTCGAACAAAGCCACGTTGTGTCTC и GAATTCCGTCAAGTCAGCGTAATGC. Амплифицированный фрагмент размером 1 т.п.н. был обработан рестриктазами Bsp119I и EcoRI и лигирован с плазмидой pVE10, предварительно обработанной рестриктазами ClaI и EcoRI. После трансформации в штамм E. coli HB2151 отобраны рекомбинантные плазмиды, придающие клеткам устойчивость к ампициллину и канамицину. Полученная плазмида pAK1 имеет размер 2,8 т.п.н., ген β-лактамазы с уникальным сайтом PstI, ген аминогликозидфосфотрансферазы с уникальными сайтами XhoI, ClaI, SmaI, HindIII и уникальный сайт вне генов EcoRI.

Для переклонирования в эту плазмиду системы экспрессии с геном гибридного белка из плазмиды pKT-INS фрагмент ДНК был амплифицирован 30 циклами (92^oC, 30 сек; 62^oC, 45 сек; 72^oC, 45 сек) с помощью Tag-полимеразы и праймеров: CAATTGTAGACAGCCTGATAAGTCG и CAATTGAAGGGAATAAGGGCGACACG. Амплифицированный фрагмент размером 1,3 т.п.н. был обработан рестриктазой MunI и лигирован с плазмидой pAK1, предварительно обработанной рестриктазой EcoRI и дефосфорилированной. После трансформации в штамм E. coli HB2151 отобраны клоны рекомбинантной ДНК, придающей клеткам устойчивость к ампициллину и канамицину и содержащей не вырезающуюся вставку в EcoRI-сайт.

Полученная плазмида pVT-INS характеризуется следующими признаками:
- размер 4,12 т.п.н.;
- придает клеткам устойчивость к антибиотикам ампициллину, канамицину, неомицину и G-418;
- содержит промоторы A2 и A3 фага T7, обеспечивающие конститутивную экспрессию гена гибридного белка;
- содержит между сайтами рестриктаз ClaI и HindIII ген, кодирующий гибридный белок размером 154 а. о. с молекулярной массой 16,8 кДа, состоящий из N-концевого фрагмента фактора некроза опухолей, соединенного через пептидный фрагмент Гли-Глн-Гли-Гли-Сер-Арг с аминокислотной последовательностью проинсулина человека;
- имеет характерные сайты рестрикции:
3PstI-сайта, из которых 1 находится в гене β-лактамазы и 2 - в гене проинсулина;
2ClaI-сайта, из которых 1 находится в гене аминогликозидфосфотрансферазы и 1 - между рибосомсвязывающим сайтом и фрагментом гена фактора некроза опухолей α;
2HindIII-сайта, из которых 1 находится в гене аминогликозидфосфотрансферазы и 1 - позади гена проинсулина человека;
уникальные сайты - XhoI и SmaI, находящиеся в гене аминогликозидфосфотрансферазы,
EcoRI, находящийся между промоторами A2 и A3,
KpnI, находящийся между промотором A3 и рибосомсвязывающим сайтом, BamHI, находящийся между фрагментами генов фактора некроза опухолей α и проинсулина человека;
- содержит ген гибридного белка с последовательностью N1
Для создания рекомбинантной плазмиды с маркерами селекции по ампициллину и канамицину и вариантом гена, кодирующим синтез гибридного белка с семью гистидиновыми остатками на N-конце, плазмидную ДНК pKHT-INS использовали в ПЦР с Tag-полимеразой и праймерами: CAATTGTAGACAGCCTGATAAGTCG и CAATTGAAGGGAATAAGGGCGACACG. Амплифицированный фрагмент размером около 1,3 т.п.н. был обработан рестриктазой MunI и лигирован с плазмидой pAK1, предварительно обработанной рестриктазой EcoRI и дефосфорилированной. После трансформации в штамм E. coli HB2151 отобраны клоны рекомбинантной ДНК, придающей клеткам устойчивость к ампициллину и канамицину и содержащей не вырезающуюся вставку в EcoRI-сайт.

Полученная плазмида pVHT-INS отличается от pVT-INS следующими признаками:
- размер 4,15 т.п.н.;
- содержит между сайтами рестриктаз KpnI и HindIII участок связывания рибосом и ген, кодирующий гибридный белок размером 164 а. о. с молекулярной массой 18,1 кДа, состоящий из (Гис-)₇-фрагмента, N-концевого фрагмента фактора некроза опухолей, соединенного через пептидный фрагмент Гли-Глн-Гли-Гли-Сер-Арг с аминокислотной последовательностью проинсулина человека;
- отсутствует ClaI-сайт между рибосомсвязывающим сайтом и геном гибридного белка;
- содержит ген гибридного белка с последовательностью N2.

Полученные плазмиды pKT-INS, pKHT-INS, pVT-INS или pVHT-INS после трансформации в компетентные клетки штаммов E. coli обеспечивают высокий уровень биосинтеза гибридного белка, определяемый электрофорезом в 15%-ном ПААГ-ДСН. Трансформируемым штаммом может быть любой штамм E. coli, соответствующий требованиям к штаммам-продуцентам. Например: штаммы SG20050, имеющий lon-мутацию, или BL21, имеющий lon- и ompT-мутации по генам протеаз, и позволяющие получать непротеолизированные рекомбинантные белки в больших количествах.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для создания лекарственных препаратов человеческого инсулина. Плазмиды содержат промоторы, обеспечивающие высокую конститутивную экспрессию гена гибридного белка. Гибридный белок состоит из N-концевого фрагмента фактора некроза опухолей α, соединенного через пептидный фрагмент Гли-Глн-Гли-Гли-Сер-Арг с аминокислотной последовательностью проинсулина человека. Вариант гибридного белка содержит на N-конце (Гис)-фрагмент для удаления фрагмента ФНО α после ферментативного расщепления гибридного белка. Варианты плазмид содержат гены устойчивости к антибиотикам - ампициллину и аминогликозидам: канамицину, неомицину и G- 418 для лучшей селекции. Изобретение позволяет увеличить уровень синтеза гибридного белка и стабильность штамма-продуцента. 4 с.п. ф-лы.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pKT-INS размером 5,3 т.п.н., кодирующая гибридный белок размером 154 а.о. с молекулярной массой 16,8 кДа, состоящий из N-концевого фрагмента фактора некроза опухолей α, соединенного через пептидный фрагмент Гли-Глн-Гли-Гли-Сер-Арг с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, характеризующаяся следующими свойствами: сконструирована на основе плазмиды рКК223-3, содержит вслед за tac-промотором промоторы А2 и А3 фага Т7, имеет характерные сайты рестрикции: EcoR1-сайт, находящийся между промоторами А2 и А3, Крnl-сайт, находящийся между промотором А3 и рибосомсвязывающим сайтом, Clal-сайт между рибосомсвязывающим сайтом и фрагментом гена фактора некроза опухолей α, BamH1-сайт, находящийся между фрагментами генов фактора некроза опухолей α и проинсулина человека, 2-Pstl-сайта в гене проинсулина, Hindlll-сайт позади гена проинсулина человека, содержит между сайтами рестриктаз Clal и Hindlll ген гибридного белка с нуклеотидной последовательностью 1. 2. Рекомбинантная плазмидная ДНК рКНТ-INS, кодирующая гибридный белок размером 164 а.о. с молекулярной массой 18,1 кДа, состоящий из N-концевого домена состава (Гис-)₇, N-концевого фрагмента фактора некроза опухолей α, соединенного через пептидный фрагмент Гли-Глн-Гли-Гли-Сер-Арг с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, характеризующаяся следующими свойствами: сконструирована на основе рКК223-3, содержит вслед за tac-промотором промоторы А2 и А3 фага Т7, имеет характерные сайты рестрикции: EcoR1-сайт, находящийся между промоторами А2 и А3, Крnl-сайт, находящийся между промотором А3 и рибосомсвязывающим сайтом, BamH1-сайт, находящийся между фрагментом генов фактора некроза опухолей α и проинсулина человека, 2-Pstl-сайта в гене проинсулина, Hindlll-сайт позади гена проинсулина человека, между рибосомсвязывающим сайтом и геном гибридного белка интегрирован синтетический фрагмент ДНК, кодирующий (Гис-)₇-домен, содержит между сайтами рестриктаз Крnl и Hindlll рибосомсвязывающий сайт и ген гибридного белка с нуклеотидной последовательностью 2. 3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pVT-INS, кодирующая гибридный белок размером 154 а. о. с молекулярной массой 16,8 кДа, состоящий из N-концевого фрагмента фактора некроза опухолей α, соединенного через пептидный фрагмент Гли-Глн-Гли-Гли-Сер-Арг с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, характеризирующаяся следующими свойствами: сконструирована на основе плазмида pVE10, имеет размер 4,12 т.п.н., придает клеткам устойчивость к антибиотикам ампициллину, канамицину, неомицину и G-418, содержит промоторы А2 и А3 фага Т7, обеспечивающие конститутивную экспрессию гена гибридного белка, содержит между сайтами рестриктаз Clal и Hindlll ген, кодирующий гибридный белок с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, имеет характерные сайты рестрикции: 3 Pstl-сайта, из которых 1 находится в гене β-лактамазы и 2 - в гене проинсулина, 2 Clal-сайта, из которых 1 находится в гене аминогликозидфосфотрансферазы и 1 - между рибосомсвязывающим сайтом и фрагментом гена фактора некроза опухолей α, 2 Hindlll-сайта, из которых 1 находится в гене аминогликозидфосфотрансферазы и 1 - позади гена проинсулина человека, уникальные сайты - Xhol и Smal, находящиеся в гене аминогликозидфосфотрансферазы, EcoR1, находящийся между промоторами А2 и А3, Крnl, находящийся между промотором А3 и рибосомсвязывающим сайтом, BamHl, находящийся между фрагментами генов фактора некроза опухолей α и проинсулина человека, содержит ген гибридного белка с последовательностью 1. 4. Рекомбинантная плазмидная ДНК pVHT-INS, кодирующая гибридный белок размером 164 а. о. с молекулярной массой 18,1 кДа, состоящий из (Гис-)₇-фрагмента, N-концевого фрагмента фактора некроза опухолей α, соединенного через пептидный фрагмент Гли-Глн-Гли-Гли-Сер-Арг с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, характеризующаяся следующими свойствами: сконструирована на основе плазмиды pVE10, имеет размер 4,15 т.п.н., придает клеткам устойчивостью к антибиотикам: ампициллину, канамицину, неомицину и G-418, содержит промоторы А2 и А3 фага Т7, обеспечивающие конструированную экспрессию гена гибридного белка, содержит между сайтами рестриктаз Крnl и Hidlll участок связывания рибосом и ген, кодирующий гибридный белок, имеет характерные сайты рестрикции: 3 Pstl-сайта, из которых 1 находится в гене β-лактамазы и 2 - в гене проинсулина, Clal-сайт в гене аминогликозидфосфотрансферазы, 2 Hindlll-сайта, из которых 1 находится в гене аминогликозидфосфотрансферазы и 1 - позади гена проинсулина человека, уникальные сайты - Xhol и Smal, находящиеся в гене аминогликозидфосфотрансферазы, EcoR1, находящийся между промоторами А2 и А3, Крnl, находящийся между промотором А3 и рибосомсвязывающим сайтом, BamHl, находящийся между фрагментами генов фактора некроза опухолей α и проинсулина человека, содержит ген гибридного белка с последовательностью 2.