Рекомбинантная плазмидная ДНК рР1, определяющая синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека 1, способ ее конструирования и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека 1 Советский патент 1993 года по МПК C12N15/48 C12N1/21 

ел

с

Использование: генетическая инженерия и биотехнология. Сущность изобретения: в вектор pVR290 встраивают Hincll-EcoRI фрагмент области pol генома ВИЧ1, кодирующего обратную транскрип- тазу и часть эндонуклеазы-интегразы, выделенного из плазмиды рВНЮ, содержащей ДНК-копию вирусного генома. Плазмида определяет устойчивость к ампициллину, неконьюгативна. Использование данного изобретения позволяет получать с 1 л клеточной суспензии 45-65 мг гибридного белка, содержащего специфическую последовательность полипептида, кодируемого pol областью генома ВИЧ1.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм Е.coll, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК с фрагментами области pol генома ВИЧ1, определяющую синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами ВИЧ1.

Целью изобретения является получение рекомбинатной плазмидной ДНК, обеспечивающей высокий уровень продукции гибридного белка, обладающего антигенными свойствами ВИЧ1, способной наследоваться в штаммах бактерий Е.coll и создание таким образом штамма-продуцента этого белка.

Описание плазмиды.

- название - рР1

- размер - 7,3 т.п.н.

- состоит из Hindll - E.coR 1-фрагмента плазмиды рВН 10 размером 2,1 т.п.н., содержащего последовательность области ВИЧ1; Hindlll фрагмента плазмиды puR 290 размером 5,2 т.п.н. с геном бета-гелактозидаза, областью ori и геном устойчивости к ампициллину: и E.coRl-Hindlll III олигонуклеоти- даадаптора размером 12 нуклеотидов.

- уникальные сайты рестрикции BamHI, SalGl, Pstl

- плазмида определяет устойчивость клеток E.coli HB101 к ампициллину и синтез

00

сь VI о

4

в них гибридного белка, содержащего антигенные детерминанты области pol ВИЧ1.

- плазмида неконьюгативна.

Описание штамма E.coli HB101/pP1

Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидной формы 1,2x1,6x2,0 мкт, подвижные с перитрихи- альными жгутиками, грамотрицательныё, иеспорообразугощие.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептон- ном агаре, L-arape-колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, серые, край ровный, мутные. При росте на жидких сре- дах мясо-пептонном бульоне, L-бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физико-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах 4-45°С при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют глюкозу, фруктозу. Не усваивают ацетат. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Индол не образуют. Уреазная активность не обнаруживается. Устойчивость к антибиотикам.

Клетки устойчивы кампициллинузасчет наличия плазмиды рР1,.

П р и м е р 1. Конструирование плазми ДырР1. ;

Hindll-E.coRI фрагмент области pol re- нома ВИЧ1, кодирующий обратную транс- криптазу и часть эндонуклеазы-интегрэзы, выделяют из плазмиды рВНЮ, содержащий ДНК-копию вирусного генрма и встраивают в вектор рис 19 по сайтам для этих рестрик- таз. Для этого 10 мкг ДНК плазмиды рВНЮ инкубируют с 20д. Hindll и ЗОд.Е.соРИ в бу- фере, содержащем 100 мМ №CI, 10 mM MgCl2. Ю тМ трис-HCI рН7.5, 1 mM ДТТ в течение 2 ч при 37°С. Далее выделяют нужный фрагмент ДНК методом электроэлюции из 1 % агарозного геля. 2 мкг вектора риС19 инкубируют с 5 ед. Hindll и 5 ед.. E.coRI в тех же условиях,

Соединение смеси фрагментов ДНК плазмиды риС19 (0,5 мкг) и Hindtl - E.coRI фрагмента ВИЧ1 из плазмиды рВНЮ проводят с помощью ДНК-дигазы фага Т4 (30000 единиц/мл) из расчета 1 мкл фермен- та на 5 мкг ДНК (инкубацию ведут в.течение 10 ч при 12°С).

Полученный препарат используют для трансформации клеток E.coli HB101. Трансформацию проводят следующим обрэзом: 0,1 мл суспензии клеток E.coii HB101-вносят в 20 мл питательного L-бульона и выращивают до титра 3x108 клеток/мл. Клеткисоби- рают центрифугированием (5000 д, 10 мин, 0°С), ресуспендируют в 10 мл 75 mM раствора CaCl2 и выдерживают 30 мин при 0°С. Клетки повторно центрифугируют (5000, 10 мин, 4°С), затем ресуспендируют в 1 мл 75 mM CaCla (0°C) и 100 мкл такой суспензии используют для трансформации, Смесь соединенных фрагментов ДНК инкубируют с компонентными клетками (обработанными CaCI) в течение 1 ч при 0°С и 3 минуты при 42°С. После двенадцатикратного разбавления L-бульоном трансформированные клетки подращивают 1,5 ч и высевают на агаризованную среду L-бульона с ампицил- лином (30 мкг/мл). Плазмидную ДНК, выделенную из ампициллин-устойчивых колоний, выросших через 36 ч при 37°С, анализируют с помощью электрофореза. Отбирают клоны, молекулярный вес которых больше чем у исходного вектора риС19. Полученную плазмиду обозначают pRT3.

Клетки бактерий E.coli HB101, содержащие плазмидную ДНК pRT3, выращивают в 200 мл бульона до титра 1x109 клеток/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5000 д, 5 мин, 4°С) и ресуспендируют в 35 мл раствора, содержащего 8% сахарозы, 0,5% тритона Х100, 50 mM ЭДТА рН 8,0 и 10 mM трис-НCI рН 8,0. Далее добавляют 2,5 мл свежеприготовленного раствора лизоцима с концентрацией 10 мг/мл, быстро перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 3 мин. Полученный лизат центрифугируют (20000 д, 30 мин, 4°С) и ДНК из супернатанта осаждают равным объемом изопропанола. Образовавшийся осадок собирают центрифугированием (12000 д, 20 мин, 2°С) и ресуспендируют в 5 мл 10 mM трис-HCI, рН 8,0 буфера. Окончательную очистку плазмидной ДНК проводят методом равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCI с бромистым этидием (1 мкг/мл).

Для получения плазмиды рР1 фрагмент Hindlll-E.coRI плазмиды pRT3 переклонируют в вектор puR.290 по сайту Hindlll. С этой целью 10 мкг ДНК плазмиды инкубируют с 30 ед. эндонуклеазы E.coRI в буфере, содержащем 100 мМ NaCI, 10 mM MgMl2, 10 mM трис-HCI рН 7.5, 1 mM ДТТ, в течение 1 ч при 37°С. Затем добавляют 1/10 объема ЗМ ацетата Na и осаждают ДНК 2,5 объемами этилового спирта на ценрифуге (10000 д, 10 мин, 4°С). Осадок высушивают и растворяют в буфере 10 мМ трис-НCI рН 8,0 и 5мМ ЭДТА. Полученный препарат лигируют с 50 мМ адаптера E.coRI-Hindlll с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (30000 единиц/мл), из расчета 1 мкл фермента на 5 мкг ДНК (инкубацию вели в течение 10 ч при 12°С). Затем добавляют 40 ед. рестриктазы Hindlll и инкубируют в буфере, содержащем 50 mM

трис-HCI, рН 8,0, 50 mM CaCI, 10 тМ MgCl2, 1 тМ ДТТ. Реакцию проводят 1 ч при 37°С. Далее выделяют нужный фрагмент ДНК методом электроэлюции из 1% агарозного геля. 5 мкг ДНК вектора puR290 инкубируют с 10 ед. рестриктазы Hindlll в буфере, содержащем 50 тМ трис-HCI, рН 8,0,50 mM NaCl, 10 тМ MgCla, 1 тМ ДТТ. Реакцию проводят 1 ч при 37 град.С.

Соединение смеси фрагментов ДНК плазмиды puR290 (0,5 мкг) и Hindlll фрагмента из плазмиды рРТЗ проводят с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (30000 ед./мл) из расчета 1 мкл фермента на 5 мкг ДНК (инкубацию проводят в течение 10 ч при 12°С).

Полученную смесь используют для трансформации как описано ранее. Плаз- мидную ДНК, выделенную из ампициллин- устойчивых колоний, выросших через 36 ч при 37°С, анализируют с помощью электрофореза. Отбирают клоны, молекулярный вес которых был больше, чему исходного вектора puR290.

Для окончательного выбора нужной плазмиды проводят анализ способности выбранных плазмид синтезировать гибридные белки молекулярной массы 160 кД, содержащие вирусспецифические последовательности области pol.

Приме р 2. Анализ уровня синтеза гибридного белка, обладающего антигенными свойствами E.coli НВ101/рР1.

Анализ белков в лизатах клеток E.coli НВ101, содержащих гибридную плазмиду рР1 проводят следующим образом.

2 мл суспензии клеток E.coli HB101, содержащих плазмиду рР1, выросших в течение ночи из отдельной колонии до концентрации 2x109 клеток/мл в L-бульоне, содержащем 30 мкг/мл ампициллина, осаждают центрифугированием (12000 д, 1 мин) и ресуспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 50 тМ трис-PCI рН 7,8, 2,5% доде- цилсульфата натрия, 10% глицерина, 0,7% меркаптоэтанола и 0,1% бромфенолового синего. Полученные препараты кипятят 5 минут на водяной бане и 20 мкл анализируют методом электрофореза. В лизатах бактерий, содержащих плазмиду рР1, обнаружен дополнительный белок с молекулярной массой 160 кД. Антигенную активность белка молекулярной массой 160 кД демонстрируют с помощью метода имму- ноблотинга. Полученный гибридный белок обладает антигенной активностью ВИЧ1, . Уровень синтеза гибридного белка составляет не менее 5% от тотального клеточного белка.

Изобретение позволяет получать с 1 л

клеточной суспензии 45-65 мг белка, обла. дающего антигенными свойствами ВИЧ1.

При этом 1726 аминокислотных остатков (ак)

5 гибридного белка представлены: 1021 ак - бета-галактозидаза, 8 ак, кодируемых пол- илинкерной последовательностью векторной плазмиды puR290, 7 ак, кодируемых полилинкерной последовательностью век0 тора риС19, 687 ак, кодируемых фрагментом гена pol ВИЧ1, 3 ак олигонуклеотида-адап- тора и 2 ак, кодируемых полилинкером puR290.

П р и м е р 3. Демонстрация возможно5 сти использования целевого продукта для создания диагностикума на ВИЧ1.

Препараты белков, приготовленные по методике, изложенной в примере 2, разделяют методом электрофореза в ПААГ и ана0 лизируют методом иммуноблотинга с помощью сыворотки пациента, инфицированного ВИЧ1. В препарате белков, полученных из клеток, содержащих гибридную плазмиду рР-1, выявляют дополнительные

5 полосы белков, специфически реагирующие с антителами к ВИЧ1. В препарате, использовавшемся в качестве контроля, приготовленном из клеток, содержащих исходный вектор puR290,. также полосы не идентифи0 цируют.

Таким образом, плазмида рР1 детерминирует в клетках E.coli синтез белков, обладающих антигенными свойствами белков В1/1Ч1, поэтому данную плазмиду и штамм5 продуцент можно использовать для создания диагностикумов на выявление антител к ВИЧ1.

Формула изобретения 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

0 рР 1, определяющая синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами иммунодефицита человека Т размером 7,3 т.п.н. и содержащая:

- Hindll - E.coRI - фрагмент плазмиды 5 рВНЮ размером 2,1 т.п.н.;

- Hindi - Hindlll - фрагмент плазмиды puR290 размером 5,2 т.п.н.;

-уникальные сайты рестрикции BamHI, SalGI, Pstl;

0 - генетические маркеры - Ыа-ген устойчивости к а.мпициллину;

-гены;

- lac Z-pol-ген, обеспечивающий синтез гибридного белка, размером 1726 ак со сле- 5 дующей нуклеотидной и аминокислотной последовательностью

бета-галактозидаза I полилинкерная область puR290 ( полилинкер Мет...Трп Цис Apr Гли Сер Вал, Асп Лей Глн Про Сер Лей Гис Ала %

I/

АТГ...ТГГ ТГТ ЦГГ ГГА ТЦЦ ГТЦ ГАЦ ЦТГ

1 1020 ЦАГ ЦЦА АЈЦ ТТГ ЦАТ ГЦЦ

1030

риС19 -последовательность pol -линкер последовательность puR290.

Цис Apr Сер Тре Глу Иле Глу Фен Гли Иле Глн Ала Тир Apr

ТГЦ АГГ ТЦГ АЦТ ЦАГ АТТ...ГАА ТП ГГА

1039 1726 АТТ ЦАА ГЦТ ТАТ ЦГА ТГА

1730

рВНЮ размером 2,1 т.п.н, клонируют в вектор риС19, гидролизованный рестриктаза- ми Hindll и E.coRI, полученную гибридную плазмиду после обработки ферментом

E.coRI лигируют с синтетическим адаптером E.coRI-Hindlll, далее обрабатывают ре- стриктазойН1пйИГи Hindi II фрагмент клонируют в вектор puR290, обработанный рестриктазой Hlndlll штамм бактерий

Escherlchia coll трансформируют полученными рекомбинантными ДНК с последующим отбором клонов, содержащих целевую плазмиду.

3. Штамм бактерий Escherichla coll ГКВЫ рР1 - продуцент гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека 1,