ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ ПОГЛОЩАЕМЫЙ СОСТАВ, ОБЛАДАЮЩИЙ ЗАЩИТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПРОТИВ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЛИ НЕИОНИЗИРУЮЩЕГО ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ Российский патент 2001 года по МПК A61K35/78 

Настоящее изобретение касается использования остаточных фракций винограда после отжимания для получения профилактического поглощаемого состава, обладающего защитным действием против ионизирующих и неионизирующих электромагнитных излучений.

Образование свободных радикалов, в частности свободных радикалов кислорода, является на клеточном уровне нормальным физиологическим процессом, не имеющим обычно пагубных последствий в связи с тем, что человеческий организм снабжен защитными системами; эти защитные системы представляют собой либо ферментные системы, улавливающие свободные радикалы кислорода, такие как SOD (супероксиддисмутаза), или способные разлагать токсичные вторичные продукты (H₂O₂), такие как каталаза, либо неферментные системы, такие как витамин B или глутатион.

Бывает, однако, что уровень выработки свободных радикалов кислорода превышает возможности систем защиты и тогда они взаимодействуют с другими молекулами живых клеток, вследствие чего могут произойти глубокие повреждения целостности мембран, инактивация многочисленных ферментных систем и глубокие изменения структуры нуклеиновых кислот.

Такое перепроизводство свободных радикалов кислорода может произойти в результате:
- либо активации эндогенных механизмов, известных как генераторы свободных радикалов кислорода, таких как энергетический обмен на уровне дыхательных цепей, или активность макрофагов, особенно стимулируемая в случае воспаления,
- либо воздействия экзогенных факторов, таких как электромагнитные волны (ионизирующие или неионизирующие излучения) или гипероксигенация.

Среди механизмов, индуцируемых избыточной выработкой свободных радикалов кислорода, ученые рассматривают как наиболее важный перекисное окисление липидов, при котором в результате радикальных реакций разрушаются полиненасыщенные жирные кислоты, присутствующие в фосфолипидах мембран живых клеток; в результате молекулы этого типа являются главной мишенью для воздействия радикалов.

Экспериментально определили, что под действием свободных радикалов кислорода молекулы полиненасыщенных жирных кислот имеют тенденцию к окислению и выработке многочисленных продуктов разложения, среди которых наиболее важными являются альдегиды, особенно диальдегид малоновой кислоты. В результате этого катаболизма нарушаются целостность и стабильность полиненасыщенных жирных кислот, что приводит к глубоким нарушениям целостности клетки.

Обычно допускают, что эти явления вовлечены в механизмы различных патологий, таких как ревматоидный полиартрит, некоторые виды рака, некоторые нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона), церебральные и сердечные ишемии и, как правило, старение и гибель клеток.

Наряду с вышеупомянутыми классическими защитными системами (SOD, каталаза, витамин E, ...) в течение многих лет известно, что некоторые флавоноиды растительной природы являются отличными ловушками для свободных радикалов. Можно констатировать, что в этой группе наиболее интересными представляются процианидолы или проантоцианидины, которые соответствуют гидролизующимся таннинам, представляющим собой молекулу углевода, на которой этерифицирована галловая кислота или одно из ее производных и которые способны выделять цианидол при гидролизе в кислой среде.

В порядке увеличения степени их полимеризации процианидолы представляют собой мономеры, димеры, тримеры, тетрамеры, олигомеры и конденсированные процианидолы; среди мономеров наиболее распространенными являются эпигаллокатехин и эпигаллокатехин-галлат. В самом деле, констатируют, что эти соединения обладают очень высокой удельной активностью и, в частности, более активны, чем витамин E.

На основании этих общих сведений в японской заявке на патент 04/164030 был предложен профилактический состав для защиты от нарушений, связанных с радиоактивностью, таких, которые могут, например, возникать у пациентов, которые проходят радиотерапевтическое лечение, или работников, постоянно работающих на установках, испускающих радиоактивные излучения, которые могут быть поглощены оральным путем, активными компонентами которого являются предварительно очищенные мономеры эпигаллокатехина или эпигаллокатехин-галлата. В этой японской публикации указано, что этот профилактический состав может представлять собой смесь эпигаллокатехина и эпигаллокатехин-галлата в соотношении 1/3, полученную из листьев зеленого чая.

Однако, получение этого состава представляет неудобство, связанное с необходимостью проведения продолжительных и дорогих операций экстракции и очистки, которые являют особенно неудобными.

Согласно изобретению есть идея устранить эти неудобства за счет использования при получении поглощаемого профилактического состава, обладающего защитным действием по отношению к ионизирующим и неионизирующим излучениям, не состава на основе предварительно изолированных компонентов, а сырого экстракта остаточных фракций винограда после отжимания, то есть продукта, имеющегося в распоряжении в больших количествах и, следовательно, дешевого.

Согласно изобретению такой сырой экстракт может содержать косточки и/или кисти без ягод и/или кожицу. Он может быть получен также из остаточных жмыхов, образующихся при изготовлении масла из виноградных косточек.

Отмечают, что в процессе осуществления операций изготовления вина кисти винограда давят, то есть частично раздавливают, чтобы выделить сусло, которое содержит приблизительно 80% сока и 20% твердых продуктов, представляющих собой в основном косточки, кисти без ягод и кожицу. Это сусло помещают затем в бродильный чан, в котором происходят различные химические реакции мацерации и брожения, которые обеспечивают превращение винограда в вино. В ходе этих реакций часть компонентов, первоначально содержавшихся в твердых продуктах, диффундирует в сок. Остаточные твердые продукты затем отделяют от сока и прессуют таким образом, чтобы получить вино, называемое "из пресса", и остаток, именуемый выжимками.

Этот остаток может быть перегнан с целью получения водки или может быть использован также для питания животных.

Другая возможность применения более или менее сухих выжимок, образующихся при изготовлении вина, заключается в изготовлении масла из виноградных косточек путем прессования, в ходе которого жирную часть отделяют от жмыха.

Отмечают, что уже предложено использовать побочные продукты виноделия для получения после очистки лекарства, предназначенного для лечения заболеваний, связанных с венозным кровообращением: Endotelon^®.
Несмотря на различные вышеупомянутые возможности, большая часть выжимок, образующихся при изготовлении вина, и жмыхов, образующихся при изготовлении масла из виноградных косточек, в настоящее время используется с низкой рентабельностью.

Однако, различные исследования, проведенные ранее, показали, что виноградные косточки, присутствующие в этих отходах, богаты, в частности, процианидолами и содержат, в частности, значительные количества эпигаллокатехина и эпигаллокатехин-галлата, которые могут находиться в форме мономера, а также в форме димера, тримера и олигомера.

Согласно изобретению подтверждают, что эти процианидолы также, по меньшей мере частично, присутствуют в вышеупомянутых побочных продуктах виноделия, наряду с другими компонентами, такими как катехин, или, кроме того, галловая кислота или кофейная кислота.

Вследствие этого предлагают использовать сырой экстракт всех или части остаточных фракций винограда после отжимания для получения профилактического поглощаемого состава, обладающего защитным действием против ионизирующего и неионизирующего электромагнитного излучения.

Неожиданно обнаружили, что такой сырой экстракт обладает значительно более высокой эффективностью защиты липидов от повреждений, индуцированных излучением, чем эпигаллокатехин и эпигаллокатехин-галлат, взятые отдельно или даже в сочетании друг с другом.

Если учесть вышеизложенное, использование согласно настоящему изобретению обладает преимуществом, позволяющим искусственно поднять стоимость побочных продуктов, образующихся из винограда при изготовлении вина.

Изобретение касается также профилактического поглощаемого состава, обладающего защитным действием против ионизирующего и неионизирующего электромагнитного излучения.

Согласно изобретению этот профилактический состав отличается тем, что он представляет собой сырой экстракт всех или части остаточных фракций винограда после отжимания, содержащий в основном катехин, эпикатехин и галловую кислоту, при этом катехин и эпикатехин могут быть либо связаны с галловой кислотой, либо находиться в негаллоилированной форме, и эти компоненты находятся в форме мономеров или в форме гомогенных или гетерогенных олигомеров, имеющих различную степень полимеризации, и содержат 10-30% мономеров, 10-30% димеров, 10-30% тримеров и 30-60% тетрамеров.

Согласно другой характеристике изобретения состав содержит следовые количества кофейной кислоты.

В качестве неограничивающего примера такой сырой экстракт может быть получен способом, известным самим по себе, в соответствии с которым:
- измельчают препарат на основе виноградных косточек,
- полученный таким образом порошок подвергают первой экстракции ацетоном,
- полученный таким образом экстракт отделяют путем фильтрации,
- добавляют к нему хлорид натрия до насыщения,
- выпаривают ацетон,
- экстрагируют в дистиллированной воде,
- полученный раствор подвергают второй экстракции этилацетатом,
- отделяют органическую фазу и подвергают ее лиофилизации таким образом, чтобы получить сырой экстракт.

Надо отметить, что для облегчения измельчения и получения лучшей гомогенности используют для измельчения исходного препарата сухой лед.

Кроме того, надо отметить, что этот исходный препарат, вообще говоря, обладает высоким содержанием неполярных веществ, которые следует удалять, чтобы получить в конце процесса удовлетворительный состав.

С этой целью перед проведением второй экстракции полезно подвергнуть раствор промежуточной экстракции диэтиловым эфиром.

В качестве примера препарат на основе косточек бордосского винограда обрабатывают вышеупомянутым способом, используя для первой экстракции 70%-ный ацетон.

После лиофилизации таким образом получают состав, содержащий 34% катехина, 36% эпикатехина, 11,6% галловой кислоты и 0,007% кофейной кислоты.

Кроме того, констатируют, что этот состав содержит 19% мономеров, 18% димеров, 21% тримеров и 42% тетрамеров.

Вышеупомянутый сырой экстракт хорошо усваивается кишечником и быстро диффундирует в организме, поэтому ежедневный прием его внутрь ("per os") представляет собой регулярное дополнительное питание, позволяющее бороться против образования свободных радикалов кислорода, индуцированного воздействием излучения или окислительного стресса, превосходящего эндогенные защитные возможности организма.

Что касается рекомендаций по применению, то количество вводимого экстракта может изменяться от случая к случаю, но вообще взрослому человеку желательно принимать ежедневно от 20 мг до 3 г.

Нижняя граница этого интервала относится, к примеру, к лицам, регулярно подвергающимся воздействию слабых излучений, в то время как верхняя граница специально подобрана для лиц, подвергающихся воздействию интенсивного излучения, но в течение короткого времени.

Различные испытания позволяют доказать эффективность защиты сырым экстрактом согласно изобретению от повреждений, индуцируемых ионизирующими излучениями (рентгеновское излучение) и неионизирующими излучениями (УФ-C). Эффективность этого экстракта сначала изучают на водном растворе чистых полиненасыщенных жирных кислот после индуцирования окислительного стресса УФ-C-излучением (200 мкВт/см²; 24 часа). Таким образом можно добиться полной защиты этих молекул, начиная с концентрации экстракта в среде 2 мг/л.

Затем изучают влияние этого экстракта на повреждения, индуцируемые УФ-C излучением на мембранных липидах головного мозга и печени мышей. Там также получают доказательство полной эффективности защиты этим экстрактом, начиная с концентрации 4 мг/л.

На третьем этапе изучают воздействие УФ-C и рентгеновского излучений на культуру фибробластов человека, а также защитное действие, оказываемое сырым экстрактом согласно изобретению. Изучение разрушения клеток после облучения УФ-C-излучением (200 мкВт/см²; 1 час) показывает, что защитное действие, оказываемое этим экстрактом на культуру клеток, зависит от дозы и составляет более 50% при концентрации экстракта 40 мг/л.

Для рентгеновского излучения принимают во внимание жизнеспособность клеток. Этот показатель оценивают путем счета клеток, а также путем исследования пролиферативной способности клеток в культуре после облучения рентгеновским излучением (30 Гр при мощности поглощенной дозы 2 Гр/мин). Это позволяет констатировать, что, начиная с концентрации сырого экстракта в среде 20 мг/л, число погибших клеток значительно снижается. Кроме того, блокада пролиферации клеток, облученных в отсутствии экстракта, в значительной степени снимается у клеток, облученных в присутствии этого экстракта.

Наконец, изучали влияние экстракта согласно изобретению на гемопоэтическую систему после тотального облучения крыс-самцов рентгеновским излучением (3 сеанса по 5 Гр). До этого группе крыс в корм добавляли экстракт из расчета 60 мг/день. Через 6 дней после последнего облучения животных анестезировали и брали кровь из сонной артерии. Анализ крови проводили для каждого объекта индивидуально.

Перед облучением у животных, которым вводили препарат согласно изобретению, не наблюдалось никакого токсического воздействия.

Результаты этого эксперимента показывают, что наблюдается уменьшение всех показателей крови (эритроцитов, тромбоцитов, гематокрита, гемоглобина, полинейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов) у облученных крыс, не прошедших предварительной обработки, а у животных, предварительно откармливавшихся сырым экстрактом согласно изобретению, наблюдается отчетливое улучшение.

В качестве примера считают тромбоциты у контрольных животных, облученных животных и облученных животных, предварительно обработанных экстрактом согласно изобретению. Таким образом, получают следующие результаты:
- контрольные животные (327,5±103,5)·10⁹/л
- облученные животные (152,66±149,93)·10⁹/л
- обработанные и затем облученные животные (277,66±178,54)·10⁹/л
Эти результаты ясно показывают эффективность применения экстракта согласно изобретению in vivo.

Чтобы продемонстрировать преимущество сырого экстракта согласно изобретению по сравнению с взятыми отдельно эпигаллокатехином и эпигаллокатехин-галлатом, в соответствии с японской заявкой на патент 04/164030, облучают УФ-C-излучением (200 мкВт/см²) в течение 15 часов препарат микросом из печени павианов в присутствии эпигаллокатехина (ЭГК), эпигаллокатехин-галлата (ЭГКГ) или сырого экстракта согласно изобретению (1). Вводимые добавки рассчитывают таким образом, чтобы всегда иметь одно и то же количество эпикатехина, а именно 1,45 мг/л.

Затем осуществляют количественное определение остаточных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) (20:4 n-6 и 22:6 n-3), а также диальдегида малоновой кислоты (ДАМК), который является продуктом их разложения.

Это испытание позволило прийти к результатам, представленным в табл. 1.

Эти результаты свидетельствуют о том, что облучение микросом приводит к разрушению полиненасыщенных жирных кислот и к увеличению образования диальдегида малоновой кислоты.

Оказывается, что экстракт согласно изобретению в значительной степени защищает микросомы от этих повреждений, что не наблюдается в случае отдельно взятых эпигаллокатехина и эпигаллокатехин-галлата.

Затем проводят то же самое испытание, облучая препарат микросом из печени павиана с более низкой концентрацией протеинов в присутствии сырого экстракта из виноградных косточек согласно изобретению и смеси, составленной из 1/4 эпигаллокатехина и 3/4 эпигаллокатехин-галлата.

Вводимые добавки также рассчитывают таким образом, чтобы во всех случаях иметь концентрацию эпикатехина 1,45 мг/л.

Анализы, проведенные аналогично вышеупомянутому испытанию, позволяют прийти к результатам, представленным в табл. 2.

Это испытание позволило еще раз доказать, что экстракт согласно изобретению позволяет защитить микросомы от повреждений, индуцируемых УФ-C-излучением, в то время как смесь эпигаллокатехин/эпигаллокатехин-галлат оказывается полностью неэффективной при использованных дозах.

Изобретение относится к области медицины. Использование всего или части сырого экстракта из остаточных фракций винограда после выжимания для получения поглощаемого профилактического состава, обладающего защитным действием против ионизирующего или неионизирующего электромагнитного излучения. Изобретение позволяет получить сырье для поглощения излучения без проведения длительной экстракции и очистки. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Применение сырого экстракта остаточных фракций винограда после выжимки для получения поглощаемой профилактической композиции, оказывающей защитное действие в отношении ионизирующих или неионизирующих электромагнитных излучений. 2. Поглощаемая профилактическая композиция, оказывающая защитное действие в отношении ионизирующих или неионизирующих электромагнитных излучений, отличающаяся тем, что она состоит из целого или части сырого экстракта, полученного из остаточных фракций винограда после выжимки и содержащего в основном катехин, эпикатехин и галловую кислоту, при этом катехин и эпикатехин могут либо связаны с галловой кислотой, либо находиться в негаллоилированной форме и эти соединения находятся в форме мономеров или в форме гомогенных или гетерогенных олигомеров с различной степенью полимеризации и тем, кроме того она содержит 10 - 30% мономеров, 10 - 30% димеров, 10 - 30% тримеров и 30 - 60% тетрамеров. 3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что она содержит следовые количества кофейной кислоты.

Приоритет по признакам:
13.10.95 - признаки по пп. 1 - 3, кроме признаков "ионизирующее или неионизирующее электромагнитное излучение", которые относятся к приоритету 08.10.96.