БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ ДОБАВКА К ПИЩЕ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2003 года по МПК A23L1/30 

Изобретение относится к пищевой и фармацевтической промышленности, а именно к пищевым добавкам на основе растительного сырья, обладающих биологической активностью и предназначенных для повышения устойчивости организма к воздействию неблагоприятных внешних факторов.

Интенсивное воздействие химически и структурно разнообразных факторов загрязнения окружающей среды, включая пестициды, токсические химические отходы, прямой и вторичный сигаретный дым, выхлопные газы, озона, радиации, а также разнообразных видов стресса вызывают сходные токсические эффекты на человеческое здоровье. В многочисленных исследованиях было показано, что эти факторы способствуют образованию огромного количества свободных радикалов, что является результатом оксидативного разрушения липидов, белков и ДНК, активизации прокарциногенеза, ингибирование клеточной и антиоксидантной систем защиты, истощение сульфгидрильных групп, обеспечивающих активность ферментов, изменение гомеостаза кальция, изменение экспрессии генов и индукции аномальных белков, что вносит существенный вклад в патофизиологию заболеваний человека (Florence, Т.М. "The role of free radicals in disease." Aust N Z J Ophthalmol 23(1): 3-7.

Известно, что антиоксиданты - ловушки свободных радикалов - являются ингибиторами как стадии инициирования образования свободных радикалов, так и всех дальнейших стадий развития свободнорадикальных процессов, трансформации биомолекул, развития вторичных новообразований и защищают клетки от оксидативного повреждения на всех уровнях (Halliwell, В., М. A. Murcia, et al. "Free-Radicals and Antioxidants in Food and in-Vivo - What They Do and How They Work." Crit Rev Food Sci Nutr -1995, 35(1-2): 7-20.

Одним из наиболее широко применяемых видов антиоксидантов, считающихся одной из самых важных пищевых добавок десятилетия, являются комплексы олигомерных процианидинов (ОПЦ), относящихся к классу растительных полифенольных соединений (Bagchi, Bagchi et al. "Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and disease prevention." Toxicology" - 2000, 148 (2-3): р.187-97). В основе данных комплексов лежат две мономерные единицы - катехин и (-)-эпикатехин и их производные. Благодаря способности этих соединений образовывать полимерные структуры, состоящие из 2 и более субединиц, и образуются комплексы ОПЦ. Важность ОПЦ для здоровья человека настолько велика и применение ОПЦ в различных пищевых продуктах так широко распространено, что для регулирования качества поставляемых на рынок пищевых добавок с КОПЦ был создан специальный комитет по стандартатизации экстрактов из виноградных косточек. Показано, что эффективность олигомерного процианидинового комплекса зависит от присутствия в достаточном количестве фракции низкомолекулярных процианидинов, а также высокомолекулярных процианидинов со степенью полимеризации 15-18 мономерных единиц, являющихся водорастворимыми. Вполне очевидно, что поиск новых пищевых добавок растительного происхождения, содержащих ОПЦ комплекс, имеет важное практическое значение.

Известен профилактический состав, представляющий собой смесь эпигаллокатехина и эпигаллокатехина-галлата, полученную из листьев зеленого чая (JP-patent 04164030, опубл. 09.06.1992). Состав используют для защиты от нарушений в организме, связанных с радиоактивностью. Однако получение данного состава связано со значительными технологическими трудностями.

Известна поглощаемая профилактическая композиция на основе комплекса ОПЦ, состоящая из целого или части сырого экстракта, полученного из остаточных фракций винограда после выжимки, содержащая в основном катехин, эпикатехин и галловую кислоту (п. РФ 2162703). Композицию используют против ионизирующего и неионизирующего электромагнитного излучения. Композицию получают путем предварительной экстракции ацетоном измельченного в порошок сырья, отделения полученного экстракта путем фильтрации, добавления к нему хлорида натрия до насыщения, выпариванием ацетона, экстрагированием полученного осадка водой, повторной экстракцией этилацетатом и после отделения органической фазы ее подвергают лиофилизации для получения сырого экстракта. Однако композицию применяют только против ионизирующего и неионизирующего излучения.

Известна пищевая добавка, содержащая ОПЦ комплекс, полученная из косточек винограда путем, как правило, водно-спиртовой экстракции (Bagchi, Bagchi et al.. "Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and disease prevention." Toxicology" - 2000, 148 (2-3): р.187-197).

Наиболее близкой к заявляемой является пищевая добавка, представляющая собой стандартизованный ОПЦ комплекс из коры сосны (Pinus maritima) с торговым названием "Пикногенол" производства компании Stryka Botanicals (USA). Согласно литературным данным это единственный ОПЦ комплекс на рынке, который имеет стабильный состав и биологическую активность (Packer, L., G. Rimbach, et al. "Antioxidant activity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine (Pinus maritima) bark, pycnogenol." Free Radio Biol Med -1999, 27 (5-6): р.704-724). Комплекс получают водным извлечением размолотой в порошок коры сосны с последующим доэкстрагированием этилацетатом. Затем водный экстракт подвергают лиофилизации, а этилацетатный экстракт упаривают при пониженной температуре и полученные сухие остатки объединяют. Однако использование известной добавки ограничивается экзотичностью используемого для ее получения сырья: сосна (Pinus maritima) произрастает только на севере Канады и плохо поддается разведению.

Задачей изобретения является расширение ассортимента биологически активных пищевых добавок растительного происхождения, содержащих комплекс ОПЦ и обладающих антирадикальной активностью.

Поставленная задача решается биологически активной пищевой добавкой растительного происхождения, содержащей комплекс олигомерных процианидинов, которая представляет собой жидкий экстракт косточек, и/или жома, и/или жмыха калины (Viburnum), полученный экстракцией водой или водно-этанольным экстрагентом при концентрации этанола не выше 70%.

Поставленная задача решается также биологически активной пищевой добавкой растительного происхождения, содержащей комплекс олигомерных процианидинов, которая представляет собой сухой экстракт косточек, и/или жома, и/или жмыха калины (Viburnum).

Калина (Viburnum), используемая для получения пищевых добавок, представляет собой крупный ветвистый древовидный кустарник или деревце семейства жимолостных распространена на всей европейской территории, в Сибири, горных районах Кавказа и Крыма, в Восточном Казахстане.

Плоды калины (Fructus Viburni) обладают противоспазматическим действием, понижают кровяное давление и повышают диурез. Известно использование настоев и отваров из плодов калины при простуде, осипшем голосе, кашле. Плоды входят в состав различных лекарственных сборов (ГФ XI изд., ст.40, М., Медицина, 1989 г.).

Известно использование плодов калины в качестве источника для получения жирорастворимых витаминов, содержащихся в косточках (п. РФ 2075953), жом же калины и жмых являются отходом и практического применения не имеет.

Проведенные нами исследования показали, что и сухой и жидкий экстракты косточек, или жома, или жмыха калины (Viburnum), содержат комплекс ОПЦ, обладающий антирадикальной активностью. Пищевые добавки на основе таких экстрактов повышают биологическую ценность пищевых продуктов, расширяют их функциональные возможности и расширяют ассортимент пищевых добавок, обладающих антирадикальной активностью.

Согласно изобретению сырьем для экстракции служат косточки калины, жом и жмых, содержащие дополнительно кисти без ягод и/или кожицу. Основным компонентом заявляемых жома и жмыха являются косточки калины, однако жом и жмых, как правило, содержат дополнительно кожицу ягод и гребни (кисти без ягод), которые так же содержат ОПЦ, однако в меньших количествах и таким образом не только не мешают, но и несколько увеличивают выход биологически активных веществ.

Экстракцию косточек, и/или жома, и/или жмыха калины для получения пищевой добавки, представляющей собой жидкий экстракт, осуществляют стандартным способом, например, методом реперокляции, используя для этого воду или водно-этанольную смесь с концентрацией спирта до 70%.

Экстракция смесью, содержащей различную концентрацию этанола, показала, что во всех случаях за исключением водной экстракции, происходит сравнимое по количественным характеристикам извлечение полифенольной фракции, отвечающей за биологическую активность. Водная экстракция характеризуется большим извлечением фенольных кислот, в то время как увеличение концентрации этанола приводит к увеличению концентрации высокомолекулярных процианидинов, нерастворимых в воде. И хотя известно, что высокомолекулярные процианидины не способны проникать через стенку кишечника, они проявляют свою активность в просвете тонкого кишечника, ингибируя свободно-радикальные процессы и оказывая ингибирующее воздействие на окислительно-восстановительные процессы.

Экстракция смесью с содержанием этанола выше 70% нецелесообразна из-за существенного перераспределения экстрагируемых веществ в сторону высокомолекулярных процианидинов и уменьшения количественного содержания в экстракте высокобиодоступной фракции низкомолекулярных водорастворимых ОПЦ.

В таблице 1 приведена антирадикальная активность пищевых добавок, представляющих собой жидкий экстракт жома калины (Viburnum) в зависимости от концентрации этанола.

Выход экстракта составляет 1 литр на 1 кг исходного сырья. Соотношение сырья и экстрагента не влияет на свойства полученного экстракта, оказывая влияние только на технологичность процесса. Как правило, экстракцию осуществляют при соотношении сырье:экстрагент, равным 1:1. При этом при использовании 40% этанола 1 г получаемого экстракта содержит 256 мг сухих веществ, из которых 103 мг являются полифенольными соединениями, обладающими биологической активностью. Содержание водорастворимой фракции при этом составляет 30 мг. В состав полученного экстракта по данным хроматографического анализа входят феноловые кислоты, мономерные катехины, низкомолекулярные олигомерные процианидины со степенью полимеризации от 2 до 4 и высоко молекулярные процианидины со степенью полимеризации от 5 и выше.

Для получения биологически активной пищевой добавки, являющейся сухим экстрактом косточек, и/или жома, и/или жмыха калины (Viburnum), осуществляют водную или водно-органическую или органическую экстракцию измельченного сырья с последующим выделением экстрактивных веществ любыми приемлемыми для этого методами, например, путем лиофилизации или упаривания при пониженной температуре в вакууме. Как правило, составы жидкого и сухого экстрактов совпадают.

В качестве экстрагента используют воду и органические растворители, разрешенные к применению в пищевой промышленности, а именно, этанол, этилацетат и другие, если технология их удаления из полученного экстракта удовлетворяет предъявляемым требованиям к конечному продукту.

Поскольку известно, что в пищевой добавке, содержащей комплекс ОПЦ, его водорастворимая фракция обладает наибольшей биодоступностью, именно ее выделяют из экстракта и анализируют для подтверждения биоактивности пищевой добавки.

Выделение водорастворимой фракции осуществляют следующим способом. Исходный экстракт упаривают на роторном испарителе до 1/2 объема для удаления спирта, выпавший осадок удаляют центрифугированием, а оставшийся раствор доводят дистиллированной водой до первоначального объема.

В качестве препарата сравнения антирадикальной активности заявляемых пищевых добавок нами был использован комплекс ОПЦ, полученный из коры сосны (Pinus maritima) с торговым названием "Пикногенол" производства компании Stryka Botanicals (USА) - прототип. Для сравнительного анализа был приготовлен водный раствор пикногенола со средним для растительных извлечений содержанием сухих веществ - 7 мг/мл.

Для количественного определения содержания полифенолов, к классу которых относятся феноловые кислоты, катехины и проантоцианидины - основные составляющие ОПЦ комплекса, ответственные за биоэффект - используют колориметрический метод с реактивом Фолина-Чикалтео, являющегося официальным методом, принятым в ISO. Метод основан на способности полифенольных соединений, содержащих гидроксильные группы, взаимодействуя с реагентом образовывать синий хромофор, интенсивность которого напрямую связана с количеством полифенольных соединений. Данный метод позволяет определять в смеси веществ количественно ту часть, которая обладает способностью выступать в качестве восстановителя-антиоксиданта, к которыму относятся комплексы ОПЦ.

Известно, что феноловые кислоты и мономерные катехины в значительном количестве присутсвуют в других растениях, употребляемых в пищу, ягодах и фруктах, и поэтому основная ценность полученных пищевых добавок, содержащих комплекс ОПЦ, состоит в содержании процианидинов, состоящих из двух или более мономеров (по определению комитета по стандартизации экстрактов из виноградных косточек от 13 марта, 1999: С. Santos-Buelga and A. Scalbert (2000). "Proanthocyanidins and tannin-like compounds - nature, occurrence, dietary intake and effects on nutrition and health". Journal of Agricultural and Food Chemistry - 2000, 80(7): 1094-1117). В связи с этим для оценки качества пищевых добавок с комплексом ОПЦ, полученных из калины (Viburnum) и из "Пигногенола", из суммарного экстракта отделяют феноловые кислоты и мономерные катехины путем фракционирования.

Фракционирование ОПЦ проводят по методу, описанному в работе Sun В. с соавторами (Sun, В. S. , С. Leandro, et al. "Separation of grape and wine proanthocyanidins according to their degree of polymerization." Journal of Agricultural and Food Chemistry - 1998, 46(4): 1390-1396). Для этого 7 мг соответствующего ОПЦ растворяют в 5 мл дистиллированной воды и доводят рН раствора до 7 титрованием 0, 1 N едким натром. Затем образец пропускают через два предварительно подготовленных и соединенных для увеличения экстракционной емкости патрона Sep Pak С₁₈ (waters, USA). Экстракционную колонку после нанесения образца элюируют 10 мл воды (рН 7) для удаления феноловых кислот и объединяют с образцом, собранным после нанесения (фракция I). После просушивания экстракционных патронов в токе азота, патроны элюируют сначала 20 мл этилацетата для элюирования мономерных катехинов, низкомолекулярных процианидинов (n<5) и других небольших фенольных молекул (фракции II+III), а затем 10 мл метанола для элюирования полимерных проциандинов (n≥5) (фракция IV). Далее для разделения мономерных катехинов и олигомерных процианидинов фракцию II+III упаривают досуха в ваккуме при температуре ниже 25^oС и наносят на те же экстракционные патроны, предварительно промытые дистиллированной водой. После высушивания патронов в токе азота разделение мономерных катехинов и олигомерных процианидинов проводят последовательным элюированием 20 мл диэтилового эфира (мономерные катехины фракция - II) и 10 мл метанола (олигомерные процианидины - фракция III).

Полноту разделения контролируют по содержанию мономерных катехинов во фракциях I, II, III методом ВЭЖХ (Ding, М., Н. Yang, et al. "Rapid, direct determination of polyphenols in tea by reversed-phase column liquid chromatography. " J. Chromatogr A -1999, 849 (2): p.637-640). В работе используют хроматограф LKB (Bromma, Sweden), состоящий из ВЭЖХ насоса LKB 2150, быстрого спектрального детектора LKB 2140, оснащенного диодной регистрирующей решеткой в диапазоне 190-370 нм, и станцией для обработки данный Wallac 1224 с установленным пакетом прикладных программ Wavescan Software (Sweden) и Nelson Chromatography Software, вер. 2.60, для получения и обработки данных с быстрого спектрального детектора. Регистрацию ведут в диапазоне 270-280 нм. Хроматографию проводят на колонке 5 мкм Lichrosorb RP18 (250•4 мм) (LKB, Sweden), которую элюируют в изократном режиме системой растворителей метанол:вода:уксусная кислота (30:70:01) об/об, скорость элюирования 0,6 мл/мин.

Суммарное содержание полифенольных соединений (к классу которых относятся вещества, входящие в комплекс ОПЦ), во фракциях определяют с помощью метода Фолина-Чикалтео, описанного в работе (V.L. Singleton, R. Orthofer, R. M. Lamuela-Raventos "Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent" in Meth. Enzymol, Academic Press Inc. , San-Diego, Vol. 299, 152-178, 1999). Суммарное количество полифенолов выражают в мг-экв. галловой кислоты (ГК), которое определяют по калибровочной кривой в диапазоне 0,7-20 мкг галловой кислоты на пробу. Для определения в аликвоту из фракции объемом 200 мкл добавляют 100 мкл реактива Фолина (кислотный эквивалент соответствовал 1 N) и 400 мкл 20% раствора карбоната натрия и объем пробы доводят до 2 мл дистиллированной водой. Реакционную смесь инкубируют при 70^oС в течение 10 мин и после охлаждения и центрифугирования для удаления образовавшейся взвеси замеряют абсорбцию при 700 нм (Ultraspek XXX спектрофотометр, LKB, Sweden) против бланка, содержащего реагенты и воду вместо образца. В случае, если полученная величина абсорбции выходит за пределы калибровочного графика, образец разводят и измерение повторяют. Все измерения проводят не менее 3 раз. В нашем случае 1 мг ОПЦ был равен 0,95±0,013 мг ГК.

В результате фракционирования получают фракции, содержащие:
A) Фенольные кислоты.

Б) Мономерные катехины.

B) Низкомолекулярные олигомеры, включающие процианидины В1-В4, тримеры, тетрамеры.

Г) Высокомолекулярные олигомеры (n≥5) и полимеры.

Идентификацию соединений во фракциях проводят на основании их УФ-спектров поглощения, полученных с помощью хроматографического детектора "Диодная решетка", сравнении с истинными стандартами для катехина и (-)-эпикатехина. Идентификацию процианидинов В1-В4, тримеров и тетрамеров осуществляют на основании их УФ-спектров и масс-спектрометрии лазерной десорбцией (MFLDI-TOF), собранных при хроматографии пиков по методике, описанной в работе (Krueger, С.G., N.С. Dopke, et al. "Matrix-assisted laser desorption/ionization rime-of-flight mass spectrometry of polygalloyl polyflavan-3-ols in grape seed extract." J. Agric Food Chem - 2000, 48(5): p.1663-1667). ВЭЖХ профиль фракции II+III, содержащий мономерные катехины и низкомолекулярные процианидины, приведен на чертеже.

Антирадикальную активность полученных фракций определяют по их способности восстанавливать стабильный радикал 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат (ABTS^.+), которую оценивают по снижению величины абсорбции при длине волны 734 нм (Re, R., N. Pellegrini, et al. "Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. "Free Radic Biol Med - 1999, 26 (9-10): p. 1231-123 7). Количественно антирадикальную активность полученных фракций выражают в ТЭАС (Тролоксовый эквивалент антирадикальной способности). За одну единицу ТЭАС принимают антирадикальную активность 1 мкМ Тролокса (водорастворимого синтетического аналога витамина Е). Для расчета величин ТЭАС полученных фракций строят калибровочный график в диапазоне от 1.25 до 40 нМ (0,3125 до 10 мкг) Тролокса.

В таблице 2 представлены результаты определения антирадикальной активности отдельных фракций экстракта из жома калины, косточек калины и пикногенола. Данные по косточкам калины приведены в скобках. Из результатов видно, что пищевая добавка, содержащая ОПЦ комплекс, полученный как из жома, так и из косточек калины, обладает биологической активностью и значительно превосходит по антирадикальной активности препарат сравнения пикногенол, причем как по относительной активности (ТЕАС/мг) суммарной добавки (258 против 39,72), так и по активности отдельных фракций.

Данные результаты свидетельствуют о перспективности данного вида пищевых добавок из растительного сырья, содержащих ОПЦ комплекс, как обладающих высокими активностными характеристиками.

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к производству биологически активных добавок к пище. Биологически активная добавка представляет собой жидкий или сухой экстракты косточек, и/или жома, и/или жмыха калины. Изобретение позволяет повысить устойчивость организма к воздействию неблагоприятных факторов. 2 с.п. ф-лы, 2 табл., 1 ил.

1. Биологически активная пищевая добавка растительного происхождения, содержащая комплекс олигомерных процианидинов, отличающаяся тем, что добавка представляет собой жидкий экстракт косточек, и/или жома, и/или жмыха калины (Viburnum), полученный экстракцией водой или водно-этанольным экстрагентом при концентрации этанола не выше 70%. 2. Биологически активная пищевая добавка растительного происхождения, содержащая комплекс олигомерных процианидинов, отличающаяся тем, что добавка представляет собой сухой экстракт косточек, и/или жома, и/или жмыха калины (Viburnum).