ЭКСТРАКТ КАЛИНЫ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2004 года по МПК A23L1/30 A61K35/78 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается экстракта отходов переработки калины, содержащего комплекс олигомерных процианидинов, обладающих антирадикальнной активностью и использующихся в качестве биологически активной пищевой добавки.

Интенсивное воздействие химически и структурно разнообразных факторов загрязнения окружающей среды, включая пестициды, токсические химические отходы, прямой и вторичный сигаретный дым, выхлопные газы, озона, радиации, а также разнообразных видов стресса вызывают сходные токсические эффекты на человеческое здоровье. В многочисленных исследованиях было показано, что эти вредные факторы способствуют образованию огромного количества свободных радикалов, приводящих к оксидативному разрушению липидов, белков и ДНК, активизации прокарциногенеза, ингибированию клеточной и антиоксидантной систем защиты, истощению сульфгидрильных групп, обеспечивающих активность ферментов, изменению гомеостаза кальция, изменению экспрессии генов и индукции аномальных белков, что вносит существенный вклад в патофизиологию заболеваний человека (Florence Т.М. "The role of free radicals in disease." Aust N Z J Ophthalmol 23(1):3-7).

В то же время антиоксиданты - ловушки свободных радикалов - являются ингибиторами как стадии инициирования образования свободных радикалов, так и всех дальнейших стадий развития свободнорадикальных процессов, трансформации биомолекул, развития вторичных новообразований и защищают клетки от оксидативного повреждения на всех уровнях (Halliwell В., М. A. Murcia, et al. "Free-Radicals and Antioxidants in Food and in-Vivo - What They Do and How They Work." Crit Rev Food Sci Nutr - 1995, 35(1-2): 7-20).

Одним из наиболее широко применяемых видов антиоксидантов, считающихся одной из самых важных пищевых добавок десятилетия, является комплекс олигомерных процианидинов (ОПЦ), получаемый из растительного сырья. В основе данного комплекса лежат две мономерные единицы - катехин и (-)-эпикатехин и их производные. Благодаря способности этих соединений образовывать полимерные структуры, состоящие из 2 и более субъединиц, и образуются комплексы ОПЦ. Важность ОПЦ для здоровья человека настолько велика и применение ОПЦ в различных пищевых продуктах так широко распространено, что для регулирования качества поставляемых на рынок ОПЦ был создан специальный комитет по стандартизации экстрактов из виноградных косточек, из которых комплекс впервые был выделен и которые на сегодня являются основным промышленным источником их получения. Вполне очевидно, что в мире постоянно ведется поиск новых источников промышленного получения ОПЦ.

Известен экстракт остаточных фракций винограда после выжимки, состоящий в основном из катехина, эпикатехина и галловой кислоты, обладающий защитным действием против ионизирующего или неионизирующего электромагнитного излучения, полученный экстракцией органическими растворителями остаточных фракций винограда после выжимки (п. РФ 2162703)
Известен сухой экстракт кустарника леспедецы двухцветной, обладающий антиоксидантной активностью, полученный путем трехкратной экстракции органическим растворителем одеревеневших побегов и/или коры дальневосточного кустарника леспедецы двухцветной с последующим упариванием и высушиванием в вакууме полученного экстракта (п. РФ 2133621).

Известен сухой экстракт комплекса ОПЦ из земляных орехов, полученный экстракцией водным раствором хлорида натрия, отделением экстракта от примесей, обработкой водного раствора экстракта этилацетатом, затем избытком хлороформа до выделения осадка, содержащего ОПЦ, и последующей очисткой комплекса осаждением его из этилацетатного раствора хлороформом (п. США 3436707).

Известен сухой экстракт комплекса ОПЦ из зеленых листьев "гинго билоба" путем экстракции измельченных листьев водным ацетоном при нагревании, концентрирования полученного раствора, фильтрации, подщелачивания для осаждения ОПЦ, отделения осадка ОПЦ, подкисления фильтрата, экстракции кетоном в присутствии сульфата аммония и последующей сушкой кетоновой фазы, что позволяет получить выход ОПЦ до 35%.

Известен сухой экстракт листьев Аронии черноплодной, содержащий ОПЦ и обладающий антиоксидантной активностью, полученный экстракцией криопорошка листьев Аронии черноплодной, собранных перед началом и в период цветения, кипящим водным спиртом с последующим отделением водно-спиртовых извлечений, концентрированием их до водного раствора, фильтрацией, очисткой фильтрата петролейным или диэтиловым эфиром, экстракцией водного остатка смесью диэтилацетата и спирта и последующим получением сухого остатка (п. РФ 2171111).

Таким образом, экстракты, содержащие комплекс ОПЦ, получают, как правило, из такого растительного сырья, которое либо не имеет широкого распространения на территории России, либо совсем не встречается либо требует специального выращивания, особой обработки и глубокой очистки, что приводит к получению сухого экстракта.

Наиболее близким к заявляемому является экстракт стандартизованного ОПЦ комплекса из коры сосны (Pinus maritima) с торговым названием "Пикногенол" производства компании Stryka Botanicals (USA), получаемый путем водного извлечения размолотой в порошок коры сосны с последующим доэкстрагированием этилацетатом. Затем водный экстракт подвергают лиофилизации, а этилацетатный экстракт упаривают при пониженной температуре и полученные сухие остатки объединяют. Согласно литературным данным это единственный ОПЦ комплекс на рынке, который имеет стабильный состав и высокую биологическую активность (Packer L., G. Rimbach, et al. "Antioxidant activity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine (Pinus maritima) bark, pycnogenol." Free Radic Biol Med - 1999, 27 (5-6): р 704-724). Однако используемая для получения экстракта ОПЦ сосна произрастает в основном в Канаде и плохо приживается в других районах мира, что в какой-то степени ограничивает использование полученного экстракта.

Технической задачей изобретения является расширение ассортимента экстрактов растительного происхождения, содержащих комплекс ОПЦ и обладающих повышенной антирадикальной активностью, из более доступных сырьевых источников.

Поставленная задача решается экстрактом калины, обладающим антирадикальной активностью, полученным экстракцией косточек, и/или отжима, и/или жмыха калины (Viburnum) водой или водно-этанольной смесью с содержанием спирта не более 70 мас.%.

Калина (Viburnum) представляет собой крупный ветвистый древовидный кустарник или деревце семейства жимолостных. Распространена на всей европейской территории, в Сибири, горных районах Кавказа и Крыма, в Восточном Казахстане.

Плоды калины (Fructus Viburni) обладают противоспазматическим действием, понижают кровяное давление и повышают диурез. Известно использование плодов калины для приготовления настоев и отваров, которые используют при простуде, осипшем голосе, кашле. Плоды входят в состав различных лекарственных сборов (ГФ XI изд., ст.40, М.: Медицина, 1989 г.).

Сок калины входит в состав киселей, компотов, желе, мармелада, а из плодов калины получают жирорастворимые витамины, содержащиеся в косточках (п. РФ 2075953).

Отжим и жмых калины являются отходом и об их свойствах и практическом применении сведений не обнаружено.

Проведенные нами исследования показали, что водный или водно-этанольный экстракты косточек, и/или отжима, и/или жмыха калины содержат комплекс ОПЦ, обладающий высокой антирадикальной активностью за счет повышенного содержания в них высокобиодоступной водорастворимой фракции.

Основным источником комплекса ОПЦ, отвечающего за антирадикальную активность экстракта, служат косточки калины, которые являются и основным компонентом как отжима, так и жмыха калины. Однако отделение косточек от отжима или жмыха, которые являются отходом и далее не используется, - операция трудоемкая и не обязательная, поскольку последние, состоящие дополнительно, как правило, из кистей без ягод и/или кожицы, также содержат другие биологически активные полифенолы и не только не мешают, но и несколько увеличивают выход биологически активных веществ. Таким образом, косточки, отжим и жмых калины являются взаимозаменяемым источником для получения экстракта, содержащего комплекс ОПЦ.

Экстракт получают следующим образом.

Сырье - косточки, и/или отжим, и/или жмых калины (Viburnum) - помещают в емкость, заливают экстрагентом - водой или водно-этанольной смесью и проводят экстракцию.

Экстракцию можно осуществить и любым другим известным приемом, например методом реперколяции. Как правило, используют водно-спиртовую смесь с концентрацией спирта не выше 70 мас.%, так как при повышении концентрации спирта в экстракте повышается содержание высокомолекулярных процианидинов и уменьшается количество высокобиодоступной фракции низкомолекулярных водорастворимых ОПЦ, что приводит к снижению антирадикальной активности экстракта.

Выход экстракта составляет 1 литр на 1 кг исходного сырья, при этом 1 г экстракта содержит 250 мг сухих веществ, из которых 103 мг являются полифенольными соединениями, обладающими биологической активностью. При этом водорастворимая фракция, являющаяся наиболее биодоступной, составляет в полученном экстракте около 30 мг, что превышает ее содержание в "Пигногеноле". В состав полученного экстракта по данным хроматографического анализа входят феноловые кислоты, мономерные катехины, низкомолекулярные олигомерные процианидины со степенью полимеризации от 2 до 4 и высокомолекулярные процианидины со степенью полимеризации от 5 и выше.

Поскольку известно, что именно водорастворимая фракция ОПЦ комплекса обладает наибольшей биодоступностью, ее выделяют из экстракта и анализируют.

Выделение водорастворимой фракции осуществляют следующим способом. Исходный экстракт упаривают на роторном испарителе до 1/2 объема для удаления спирта, выпавший осадок удаляют центрифугированием, а оставшийся раствор доводят дистиллированной водой до первоначального объема.

В качестве препарата сравнения антирадикальной активности нами был использован "Пикногенол" - экстракт комплекса ОПЦ, полученный из коры сосны-прототип. Для сравнительного анализа приготовили водный раствор Пикногенола со средним для растительных извлечений содержанием сухих веществ - 7 мг/мл.

Для количественного определения содержания полифенолов, к классу которых относятся феноловые кислоты, катехины и проантоцианидины, используют колориметрический метод с реактивом Фолина-Чикалтео, являющийся официальным методом, принятым в ISO. Метод основан на способности полифенольных соединений, содержащих гидроксильные группы, взаимодействуя с реагентом, образовывать синий хромофор, интенсивность которого напрямую связана с количеством полифенольных соединений. Данный метод позволяет определять в смеси веществ количественно ту часть, которая обладает способностью выступать в качестве восстановителя-антиоксиданта, т.е. определять комплексы ОПЦ.

Известно, что феноловые кислоты и мономерные катехины в значительном количестве присутствуют в других растениях, употребляемых в пищу, ягодах и фруктах, и поэтому основная ценность полученного из косточек, или отжима, или жмыха калины экстракта состоит в содержании олигомерных процианидинов, которыми по определению комитета по стандартизации экстрактов из виноградных косточек от 13 марта, 1999 являются процианидины состоящие из двух или более мономеров (С. Santos-Buelga and A. Scalbert "Proanthocyanidins and tannin-like compounds - nature, occurrence, dietary intake and effects on nutrition and health". Journal of Agricultural and Food Chemistry - 2000, 80(7): 1094-1117). В связи с этим для оценки качества препаратов с комплексом ОПЦ, полученных из косточек, или отжима, или жмыха калины и из прототипа - "Пигногенола", из суммарного экстракта отделяют феноловые кислоты и мономерные катехины путем фракционирования.

Фракционирование ОПЦ проводят по методу, описанному в работе Sun. В. с соавторами (Sun В. S. , С. Leandro, et al. "Separation of grape and wine proanthocyanidins according to their degree of polymerization." Journal of Agricultural and Food Chemistry - 1998, 46(4):1390-1396). Для этого 7 мг соответствующего ОПЦ (прототип и по заявляемому способу) растворяют в 5 мл дистиллированной воды и доводят рН раствора до 7 титрованием 0,1 Н едким натром. Затем образец пропускают через два предварительно подготовленных и соединенных для увеличения экстракционной емкости патрона Sep Pak C₁₈ (500 mg сорбента в каждом) (Waters, USA). Экстракционную колонку после нанесения образца элюируют 10 мл воды (рН 7) для удаления феноловых кислот и объединяют с образцом, собранным после нанесения (Фракция I). После просушивания экстракционных патронов в токе азота патроны элюируют сначала 20 мл этилацетата для элюирования мономерных катехинов, низкомолекулярных процианидинов (n<5) и других небольших фенольных молекул (Фракции II+III), а затем 10 мл метанола для элюирования полимерных проциандинов (n≥5) (Фракция IV). Далее для разделения мономерных катехинов и олигомерных процианидинов Фракцию II+III упаривают досуха в ваккуме при температуре ниже 25^oС, диспергируют в 10 мл дистиллированной воды и наносят на те же экстракционные патроны, предварительно промытые дистиллированной водой. После высушивания патронов в токе азота разделение мономерных катехинов и олигомерных процианидинов проводят последовательным элюированием 20 мл диэтилового эфира (мономерные катехины Фракция - II) и 10 мл метанола (Олигомерные процианидины - Фракция III).

Полноту разделения контролируют по содержанию мономерных катехинов во Фракциях I, II, III методом ВЭЖХ (Ding М., Н. Yang, et al. "Rapid, direct determination of polyphenols in tea by reversed-phase column liquid chromatography. " J Chromatogr A - 1999, 849(2): p. 637-640). В работе используют хроматограф LKB (Bromma, Sweden), состоящий из ВЭЖХ насоса LKB 2150, быстрого спектрального детектора LKB 2140, оснащенного диодной регистрирующей решеткой в диапазоне 190-370 нм и станцией для обработки данных Wallac 1224 с установленным пакетом прикладных программ Wavescan Software (Sweden) и Nelson Chromatography Software, вер. 2,60 для получения и обработки данных с быстрого спектрального детектора. Регистрацию ведут в диапазоне 270-280 нм. Хроматографию проводят на колонке 5 мкм Lichrosorb RP18 (250•4 мм) (LKB, Sweden), которую элюируют в изократном режиме системой растворителей метанол:вода:уксусная кислота (30:70:01) об/об, скорость элюирования 0,6 мл/мин.

Суммарное содержание полифенольных соединений, к классу которых относятся и вещества, входящие в комплекс ОПЦ, во фракциях определяют с помощью метода Фолина-Чикалтео, описанного в работе V.L. Singleton, R.Orthofer, R.M. Lamuela-Raventos "Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent" in Meth. Enzymol, Academic Press Inc. , San-Diego, Vol. 299, 152-178, 1999. Суммарное количество полифенолов выражают в мг-экв галловой кислоты (ГК), которое определяют по калибровочной кривой в диапазоне 0,7-20 мкг галловой кислоты на пробу. Для определения в аликвоту из фракции объемом 200 мкл добавляют 100 мкл реактива Фолина (кислотный эквивалент соответствовал 1 Н) и 400 мкл 20% раствора карбоната натрия и объем пробы доводят до 2 мл дистиллированной водой. Реакционную смесь инкубируют при 70^oС в течение 10 мин и после охлаждения и центрифугирования для удаления образовавшейся взвеси замеряют абсорбцию при 700 нм (Ultraspek II спектрофотометр, LKB, Sweden) против бланка, содержащего реагенты и воду вместо образца. В случае, если полученная величина абсорбции выходит за пределы калибровочного графика, образец разводят и измерение повторяют. Все измерения проводят не менее 3 раз. В нашем случае 1 мг ОПЦ был равен 0,95±0,013 мг ГК.

В результате фракционирования получают фракции, содержащие:
A) Фенольные кислоты;
Б) Мономерные катехины;
B) Низкомолекулярные олигомеры, включающие процианидины В1-В4, тримеры, тетрамеры;
Г) Высокомолекулярные олигомеры (n≥5) и полимеры.

Идентификацию соединений во фракциях проводят на основании их УФ спектров поглощения, полученных с помощью хроматографического детектора "Диодная решетка", в сравнении с истинными стандартами для катехина и (-)-эпикатехина. Идентификацию Процианидинов В1-В4, тримеров и тетрамеров осуществляют на основании их УФ спектров и масс-спектрометрии лазерной десорбцией (MFLDI-TOF), собранных при хроматографии пиков по методике, описанной в работе (Krueger С. G., N.С. Dopke, et al. "Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry of polygalloyl polyflavan-3-ols in grape seed extract." J Agric Food Chem - 2000, 48(5): р 1663-1667). ВЭЖХ профиль Фракции II+III, содержащий мономерные катеины и низкомолекулярные процианидины, приведен на чертеже.

Антирадикальную активность полученных фракций определяют по их способности восстанавливать стабильный радикал 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат (ABST^·+, которую оценивают по снижению величины абсорбции при длине волны 734 нм (Re, R., N. Pellegrini, et al. "Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay", - Free Radic Biol Med - 1999, 26(9-10): p 1231-1237). Количественно антирадикальную активность полученных фракций выражают в ТЭАС (Тролоксовый эквивалент антирадикальной способности). За одну единицу ТЭАС принимают антирадикальную активность 1 мкМ Тролокса (водорастворимого синтетического аналога витамина Е). Для расчета величин ТЭАС полученных фракций строят калибровочный график в диапазоне от 1,25 до 40 нМ (0,3125 до 10 мкг) Тролокса.

В таблице представлены результаты определения антирадикальной активности отдельных фракций экстракта из отжима калины, косточек калины и Пикногенола. Данные по косточкам калины приведены в скобках. Из результатов видно, что экстракт, полученный как из косточек калины, так и из отжима, значительно превосходит по антирадикальной активности препарат сравнения Пикногенол, причем как по относительной активности (ТЕАС/мг) суммарного препарата - 258,09 против 39,79, так и по активности отдельных фракций.

Данные результаты свидетельствуют, что экстракт калины, полученный из отходов переработки калины (Viburnum) - косточек, отжима или жмыха, содержит легко получаемый комплекс ОПЦ, обладает высокими активностными антирадикальными характеристиками, позволяющими использовать его в качестве, например, биологически активной добавки к пище.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в химической, биологической или химико-фармацевтической промышленности для получения комплекса олигомерных процианидинов, обладающих высокой антирадикальной активностью. Экстракт отходов переработки калины (Viburnum): косточек, и/или отжима, и/или жмыха содержит комплекс олигомерных процианидинов, получен путем экстракции косточек, и/или отжима, и/или жмыха калины водой или водно-этанольной смесью с содержанием спирта не более 70 мас.%. Изобретение позволяет расширить ассортимент экстрактов растительного происхождения, содержащих комплекс олигомерных процианидинов и обладающих повышенной антирадикальной активностью. 1 ил., 1 табл.

Экстракт калины, обладающий антирадикальной активностью, полученный экстракцией косточек, и/или отжима, и/или жмыха Калины (Viburnum) водой или водно-этанольной смесью с содержанием спирта не более 70 мас.%.