СПОСОБ ЭЛЮЦИИ ПАТОГЕНА С ИММОБИЛИЗОВАННОЙ МАГНИТНОЙ МАТРИЦЫ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/53 G01N33/569 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для элюирования сконцентрированного на магнитной матрице патогена из объектов окружающей среды с последующим его исследованием серологическими методами: реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции агглютинации латекса (РАЛ).

Существуют разнообразные способы элюции микробных клеток с иммобилизованной матрицы. Например, использование буфера DETAC HaBEAD® и наборов CELLection. DETACHaBEAD® - буфер, содержащий поликлональные антитела, специфичные к Fab-фрагментам моноклональных антител, конъюгированных на Dynabeads (http://www.biochemmack.ru/product/magnetic/micro/). После инкубации с буфером DETACHaBEAD® частицы оказываются связанными с поликлональными антителами, а клетки высвобождаются. Они остаются жизнеспособными и экспрессия поверхностных маркеров не нарушается. Набор CELLection включает CELLection Dynabeads®, имеющие специфические антитела, конъюгированные с микрочастицами через нуклеиновую кислоту, и ферментативный буфер, расщепляющий ДНК-мостик. Использование набора CELLection позволяет удалить микрочастицы. Целевые клетки, выделенные с помощью набора CELLection, пригодны для цитометрического анализа и культивирования. Но данные элюирующие растворы подходят только для частиц, выпускаемых компанией Invitrogen (Dynal) (Норвегия).

Известен способ элюции, предложенный Матвеевой И.Н. с соавт. (2010). Разработчики данного способа рекомендуют использовать в качестве элюирующего буфера 0,1 М глицин HCl, pH 2,4 с последующей немедленной нейтрализацией 1 М раствором NaOH. Данный способ подходит только для хроматографического метода элюирования специфических антител с колонки с иммуносорбентом.

Для элюции белков-мишеней с микрочастиц могут быть использованы мягкие методы элюции. Так, белки можно элюировать буферами с низкими pH, такими как 0,12 М цитрат натрия (pH 2-3) в течение 2-х мин. Это обеспечит целостность белка при возвращении к физиологическим значениям pH. Ионная сила (концентрация солей), выбор элюирующего раствора и pH буфера для лизиса могут сильно повлиять на целостность антигена-мишени. Главную роль играет выбор элюента. Он зависит от многих факторов, таких как локализация активных центров антигена, необходимость сохранить ассоциацию субъединиц и другие белок-белковые взаимодействия. Так, например, буферы со слегка щелочным pH и низкой ионной силой обычно способствуют солюбилизации белков, а высокие концентрации солей и низкий pH могут вызвать денатурацию антигена и выпадение его в осадок из раствора. Неионные детергенты (например, Твин, Тритон Х-100, NP-40) обычно сохраняют нековалентные белок-белковые взаимодействия, а ионные детергенты (например, SDS или дезоксихолат натрия) обычно имеют денатурирующий эффект на белок-белковые взаимодействия и могут также повлиять на способность антител распознавать белок-мишень.

Для сохранения целостности антигена при подборе элюирующих растворов и условий элюции необходимо исследовать и оптимизировать большое количество параметров: состав и свойства самой матрицы, pH, молярность, объем элюирующих растворов, температурные и временные параметры инкубации.

Цель изобретения - разработать способ элюции патогена после его селективного концентрирования на магноиммуносорбенте (МИС) для последующего исследования серологическими методами и возможности повторного применения МИС (с сохранением его функциональной активности).

Первоначально была применена элюция раствором свободного лиганда с такой же степенью сродства к веществу, как у лиганда на сорбенте. Данная элюция может быть успешно осуществлена за счет многократного превышения концентрации свободного лиганда по сравнению с иммобилизованным. Для элюции использовались иммуноглобулины, выделенные из гипериммунных туляремийных, бруцеллезных и чумных сывороток, но в концентрации, в два раза превышающей концентрацию иммуноглобулинов, используемую для иммобилизации магнитной матрицы. В результате получен положительный эффект, но метод конкурентной элюции дорог, поскольку он связан со значительным расходом очищенного биологического препарата иммуноглобулинов.

Для реализации эксперимента применяли различные группы элюирующих реагентов (ферменты, детергенты, кислоты, щелочи, буферные растворы и прочие компоненты), отобрав те из них, которые отвечали определенным исследователями требованиям:

- отсутствие ложноположительных реакций с самим элюирующим реагентом;

- качественная элюция (максимальная чувствительность РНГА с элюированным патогеном);

- возможность многократного использования МИС после элюирования.

Из ферментов лучшие результаты получены при применении 1% пепсина, чувствительность в РНГА и РАЛ, при работе с МИС туляремийным, бруцеллезным и чумным, составила 1,25×10⁶ - 6,25×10⁵ м.к./мл. Из детергентов наилучшие результаты получены с 2% раствором Твин 20, чувствительность РНГА и РАЛ составила 1,25×10⁶ - 3,125×10⁵ м.к./мл. При использовании щелочей наилучшие результаты получены с 0,03 М раствором калия едкого, при этом чувствительность реакций составила 1,25×10⁶ - 3,125×10⁵ м.к./мл. Получены хорошие результаты с 60% раствором ацетонитрила, pH 8,5 и ТРИС-ЭДТА буфером, pH 8,9 и 0,1 М Трис (оксиметиламинометан).

Технический результат изобретения достигается тем, что в качестве эффективного элюирующего раствора, позволяющего проводить качественную элюцию (максимальная чувствительность РНГА с элюированным патогеном) и многократно использовать МИС после элюирования с отсутствием ложноположительных реакций с самим реактивом, используют 0,1 М Трис (оксиметиламинометан).

Способ осуществляется следующим образом. 0,1 мл 10% взвеси МИС туляремийного, чумного или бруцеллезного инкубируют с микробными взвесями возбудителей туляремии, бруцеллеза или чумы в концентрации 1×10⁷ м.к./мл в течение 30 мин, удаляют надосадок, далее МИС инкубируют с 0,5 мл элюирующего раствора в течение 10 мин, pH элюата возвращают к физиологическому значению, проводят постановку РНГА и РАЛ. В таблице 1 представлены показатели элюции.

Таблица 1 Показатели элюции патогенов после инкубации с МИС Элюент МИС pH Ложно-положительные результаты Чувствит. в РНГА, м.к./мл, после элюции Чувствит. в РАЛ, м.к./мл, после элюции Воспроизводимость Возможность многократного использования Воспроизводимость 1% пепсин туляремийный 4 нет 1,25×10⁶ 6,25×10⁵ 85% да 87% бруцеллезный 6,25×10⁵ 1,25×10⁶ 84% 85% чумной 1,25×10⁶ 6,25×10⁵ 82% 80% 2% раствор Твин 20 туляремийный 5,6 нет 1,25×10⁶ 1,25×10⁶ 89% да 90% бруцеллезный 3,125×10⁵ 1,25×10⁶ 88% 89% чумной 1,25×10⁶ 3,125×10⁵ 86% 87% 0,03 М КОН туляремийный 11,4 нет 3,125×10⁵ 6,25×10⁵ 90% да 92% бруцеллезный 6,25×10⁵ 1,25×10⁶ 89% 90% чумной 6,25×10⁵ 6,25×10⁵ 88% 89% 60% раствор ацетонитрила туляремийный 8,5 нет 1,25×10⁶ 1,25×10⁶ 93% да 91% бруцеллезный 6,25×10⁵ 1,56×10⁵ 91% 90% чумной 1,25×10⁶ 1,25×10⁶ 89% 89% ТРИС-ЭДТА буфер туляремийный 8,9 нет 6,25×10⁵ 6,25×10⁵ 90% да 92% бруцеллезный 1,25×10⁶ 1,25×10⁶ 90% 91% чумной 6,25×10⁵ 1,25×10⁶ 90% 90% 0,1 М Трис (оксиметиламинометан) туляремийный 9,7 нет 3,125×10⁵ 6,25×10⁵ 94% да 95% бруцеллезный 1,25×10⁶ 1,25×10⁶ 92% 94% чумной 1,25×10⁶ 6,25×10⁵ 91% 92%

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ элюции сконцентрированного на магнитной иммобилизованной матрице патогена с целью эффективной индикации возбудителей туляремии, бруцеллеза или чумы в РНГА и РАЛ и возможности повторного применения МИС.

Возможность практического применения заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Элюция возбудителя туляремии с МИС и его контроль в РНГА и РАЛ

Для элюции 0,1 мл 10% взвеси МИС туляремийного инкубировали со взвесью туляремийного микроба в концентрации 1×10⁷ м.к./мл в течение 30 мин, удаляли надосадок, далее МИС инкубировали с 0,5 мл элюирующего раствора (0,1 М Трис) в течение 10 мин, pH элюата возвращали к физиологическому значению, проводили постановку РНГА и РАЛ. Чувствительность в РНГА и РАЛ после элюции составила 3,125×10⁵ м.к./мл и 6,25×10⁵ м.к./мл, соответственно. Апробирована возможность повторного применения МИС туляремийного после элюции и отмывки. Получены положительные результаты, т.е. иммуноглобулины с магнитной матрицы не десорбировались.

Пример 2. Элюция возбудителя чумы с МИС и его контроль в РНГА и РАЛ

Получали аналогично примеру 1, используя, вместо туляремийного МИС чумной и соответствующий антиген. Чувствительность в РНГА и РАЛ после элюции составила 1,25×10⁶ м.к./мл и 6,25×10⁵ м.к./мл, соответственно.

Пример 3. Элюция возбудителя бруцеллеза с МИС и его контроль в РНГА и РАЛ

Получали аналогично примеру 1, используя вместо туляремийного МИС бруцеллезный и соответствующий антиген. Чувствительность в РНГА и РАЛ после элюции составила 1,25×10⁶ м.к./мл.

Литература

1. http://www.biochemmack.ru/product/magnetic/micro/).

2. Матвеева, И.Н. Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота / И.Н. Матвеева, И.И. Кочиш, Н.А. Бондарева, С.В. Кузнецова, Н.К. Еремец, Л.С. Люлькова, И.А. Бараковский, Д.А. Салов, Е.В. Рахманина // Патент РФ №2392331, опубликован 20.06.2010, Бюл. №17.

Изобретение относится к медицине, в частности к элюированию сконцентрированного на магнитной матрице патогена. Способ элюции осуществляется следующим образом: 0,1 мл 10% взвеси магнитно-иммунного сорбента (МИС) туляремийного, чумного или бруцеллезного инкубируют с микробными взвесями возбудителей туляремии, бруцеллеза или чумы в течение 30 мин, удаляют надосадок, далее МИС инкубируют с 0,5 мл элюирующего раствора в течение 10 мин, pH элюата возвращают к физиологическому значению, проводят постановку реакции непрямой гемагглютинации или реакции агглютинации латекса. Технический результат: способ позволяет качественно элюировать патоген с магнитной иммобилизованной матрицы для последующего исследования в серологических реакциях и сохранять функциональную активность антитела на магнитной матрице для повторного использования. 3 пр., 1 табл.

Способ элюции патогена с иммобилизованной магнитной матрицы, заключающийся в том, что в качестве элюента используют 0,1 М трис (оксиметиламинометан), при этом 0,1 мл магноиммуносорбента (МИС) инкубируют с патогеном в течение 30 мин, удаляют надосадок, далее МИС инкубируют с 0,5 мл элюирующего раствора в течение 10 мин, pH элюата возвращают к физиологическому значению, проводят постановку реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) или реакции агглютинации латекса (РАЛ) и обеспечивают возможность повторного применения МИС.