СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/552 G01N33/553 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления специфической реакции антиген-антитело в диагностике с помощью иммуноферментного анализа и реакции иммунофлуоресценции.

Известен способ получения иммуносорбента на основе полисахарида целлюлозы, который включает ковалентную иммобилизацию иммуноглобулинов. Недостатками способа являются: низкий уровень специфичности сорбента, нестабильность при хранении, подверженность воздействию микроорганизмов (Шаханина К.Л. Приготовление различных иммуносорбентов и их использование для выделения антигенов и антител. Ж. Вопросы медицинской химии, №6. 1976, с.127-136).

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения иммуносорбента (Патент РФ №2102134, В 01 J 20/10. Способ получения иммуносорбента, Авторы: Брыкалов А.В., Жарникова И.В. Опубл. 20.01.98 г. Бюллетень №2).

Способ включает модифицирование аэросила 0,2-0,4% раствором декстрана и окисление продукта перхлоратом натрия.

Недостатком указанного способа является низкий уровень специфической емкости иммуносорбента, отсутствие магнитных свойств, длительность процесса получения.

Цель изобретения - повышение специфической емкости, чувствительности иммуносорбента, обладающего магнитными свойствами.

Цель достигается тем, что для увеличения специфической емкости, чувствительности иммуносорбента проводят модифицирование кремнеземного носителя - аэросила 3-4% раствором хитозана в 3% растворе уксусной кислоты с последующим модифицированием сорбента бензохиноном. Для придания сорбенту магнитных свойств в процессе синтеза вводят 10-12% от массы сорбента магнетита (Fe₃O₄).

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводится активирование носителя органическим полимером хитозаном, представляющим собой полимер с неразветвленной цепью β-1,4-соединенных 2-амино-2-дезокси-2 глюкозных остатков. При последующем модифицировании сорбента раствором бензохинона получаемый продукт активирован функциональными группами, способными к взаимодействию с чумными и туляремийными иммуноглобулинами.

Возможность практического осуществления предлагаемого способа с использованием полной совокупности заявляемых признаков иллюстрируются примерами.

Пример 1. К 5 г аэросила А-380 добавляли 2,5% раствор хитозана в 3% растворе уксусной кислоты и далее магнетит (Fe₃O₄) в количестве 0,5 г. Полученную смесь выдерживали 1 час при температуре 25°С. Затем полученный продукт высушивали при 100-120°С в течение 15 мин. К сорбенту в последующем добавляли 40 мл фосфатного буфера с рН 8,0, содержащего 12 мг бензохинона, инкубировали смесь в течение 15 мин. Затем сорбент отмывали 100 мл дистиллированной воды. К 0,02 г магносорбента приливали 1 мл чумных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 5 мг/мл. Смесь оставляли при 24°С в течение 1,5 часов, далее надосадочную жидкость удаляли, а носитель трижды промывали 0,9% раствором хлорида натрия. Длительность получения магноиммуносорбента составляет 3 часа.

Результаты определения специфической емкости и специфичности иммуносорбентов проводили методом иммунофлуоресценции, иммуноферментного анализа. Для этого к 5 мл 10% суспензии иммуносорбента приливали 1 мл чумного микроба в концентрации 10³ микробных тел/мл и инкубировали смесь 1 час при 24°С. Сорбент отмывали 50 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Вносили 0,5 мл иммуноглобулинов чумных люминесцирующих в рабочем разведении и инкубировали 30 мин. Отмывали сорбент 0,9% раствором хлорида натрия и проводили регистрацию результатов в люминесцирующем микроскопе Люмам Р-2 по общепринятой DASS - системе. Параллельно с опытной пробой измеряли люминесценцию контрольной пробы (иммуносорбент без контакта с чумным микробом).

Специфическая емкость иммуносорбента, измеренная методом иммунофлуоресценции, составляет 10³ м.т./мл чумного микроба.

Пример 2. Способ получения магноиммуносорбента осуществляли по методике примера 1, но для модифицирования аэросила использовали 3% раствор хитозана в 3% растворе уксусной кислоты. Специфическая емкость составляет 14 у.е./мг. Чувствительность метода составляет 10² м.т./мл чумного микроба.

Пример 3. Способ получения магноиммуносорбента осуществляли по методике примера 1, но для модифицирования аэросила использули 4% раствор хитозана в 3% уксусной кислоты. Специфическая емкость составляет 14 у.е./мг. Чувствительность метода составляет 10² м.т./мл (мл чумного микроба).

Пример 4. Способ получения магноиммуносорбента осуществляет по методике примера 1, но для модифицирования аэросила использовали 4,5% раствор хитозана в 3% растворе уксусной кислоты. Специфическая емкость составляет 14 у.е./мг. Чувствительность метода составляет 10² м.т/мл чумного микроба.

Пример 5. Способ получения магноиммуносорбента осуществляли по методике примера 1, но на последнем этапе синтеза к 0,02 г активированного носителя приливали 1 мл туляремийных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 4 мг/мл. Специфическая емкость иммуносорбента составляет 14 у.е., чувствительность метода составляет 10 м.т./мл.

Сопоставление предлагаемого способа и прототипа представлено в таблице 1.

В отличие от прототипа предлагаемый способ получения иммуносорбента повышает специфическую емкость препарата в 1,4 раза, увеличивает чувствительность на порядок и сокращается длительность получения иммуносорбента в 1,5 раза.

Как показали экспериментальные испытания, для модифицирования аэросила оптимален раствор хитозана с концентрацией 3-4%. При увеличении концентрации полисахарида до 4,5% не наблюдается увеличения специфической емкости магносорбента, тогда как уменьшение концентрации модификатора до 2,5% снижает специфическую емкость иммуносорбента.

Преимущество и положительный эффект способа получения магноиммуносорбента объясняется тем, что в процессе получения органокремнеземного сорбента осуществляется активирование его поверхности хитозаном, При последующем модифицировании поверхности сорбента бензохиноном образуются активные функциональные группы, которые взаимодействуют с молекулами лиганда белковой природы: иммуноглобулинами чумными и туляремийными. Магноиммуносорбенты, полученные по предлагаемому способу, обеспечивают повышения специфической емкости, чувствительности. Кроме того, в отличие от прототипа сорбенты имеют в составе магнитосоставляющий компонент. Это повышает эффективность их использования для концентрирования и идентификации патогенных микроорганизмов. Применение для этих целей магносорбентов исключает необходимость предварительного концентрирования микроорганизмов на мембранных фильтрах, ускоряет манипуляции на всех этапах исследования.

Таблица 1 Способ получения иммуносорбентаСпособ получения иммуносорбента (лиганд - иммуноглобулин чумной)Модификатор - хитозан, %, растворСпецифическая емкость по флуоресценции в у.е./мгЧувствительность, м.т./млДлительность синтеза им-та, часИзвестный способ-1010⁴-10³4,5Предлагаемый способ2,5
3,0
4,0
4,510
14
14
1410³
10²
10²
10²-
-
3
-

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению иммуносорбентов. Сущность способа: при получении иммуносорбента с магнитными свойствами, предусматривающем ковалентное связывание лиганда белковой природы с модифицированным носителем, в качестве носителя используют аэросил, модифицированный 3-4% раствором хитозана в 3% растворе уксусной кислоты и активированный бензохиноном. Получение иммуносорбентов предлагаемым способом обеспечивает повышение специфической емкости и чувствительности. 1 табл.

Способ получения иммуносорбента с магнитными свойствами, предусматривающий ковалентное связывание лиганда белковой природы с модифицированным носителем, отличающийся тем, что в качестве носителя используют аэросил, модифицированный 3-4% раствором хитозана в 3% растворе уксусной кислоты и активированный бензохиноном.