СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАГНОИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2006 года по МПК G01N33/543 

Изобретение относится к иммунохимии, микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в получении биомагноиммуносорбентов для высокочувствительных серологических тест-систем, основанных на реакции антиген - антитело при обнаружении бактериальных антигенов с высокой стабильностью, демонстративностью, воспроизводимостью и чувствительностью регистрируемых результатов.

Перспективными для применения в методах иммуноанализа являются твердофазные носители, в том числе биологические сорбенты с магнитными свойствами.

Основными требованиями к таким сорбентам являются их инертность по отношению к биологическом препаратам, стабильность свойств, механическая прочность, достаточная сорбционная емкость при иммобилизации лигандов, невысокая неспецифическая емкость. Более прочное присоединение лигандов к поверхности сорбентов обеспечивается ковалентной связью, которая формируется за счет предварительной активации поверхности сорбентов альдегидами (Ефременко В.И., Пушкарь В.Г. и др. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов // ЖМЭИ. - 1989. - №12. - С.100-104; Ефременко В.И., Кальной С.М. Способ получения сорбентов: Пат. РФ №2070439, С 16 В 01 J 20/30, оп. 20.12.96, Бюл. №35. - С.151).

Иммунологические свойства тест-системы во многом зависят от выбора носителя, на котором иммобилизованы антитела (Владимцева И.В. Научно-методические аспекты приготовления и использования магнитоуправляемых иммобилизованных микробиологических систем: Дис.... д-ра биол. наук (03.00.23 - биотехнолгия). - Ставрополь, 2002. - 304 с.).

Известны разные способы получения сорбентов и биоиммуносорбентов с магнитными свойствами.

Например, способ эмульсионной полимеризации, в соответствии с которым в реагирующую смесь сомономеров - полиакриламида и катализатора вносят магнитный порошок и лиганд (иммуноглобулины). При этом происходит механическое включение частиц магнитного порошка и биологически активного вещества (иммуноглобулинов) в ячеистую структуру полиакриламидного геля (Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н. Иммуноферментный анализ антигенного материала, фиксированного на магнитных полиакриламидных сорбентах // Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций. Тезисы докладов Всесоюзной научно - практической конференции (26-27 мая 1986 г.). - Ставрополь, 1986. - Ч II. - С.50-53).

Недостатком этого способа является повышенный расход иммуноглобулинов с концентрацией 40 мг/мл по белку. Это повышает стоимость препарата и ограничивает возможности организации промышленного производства препаратов.

Известен способ получения магносорбента путем предварительной обработки магнитного порошка с приданием ему коррозионной стойкости и гидрофильности с последующим проведением эмульсионной полимеризации смеси сомономеров - полиакриламида и катализатора с обработанным магнитным порошком. Подготовленный магносорбент активируют 5%-ным глутаровым альдегидом в течение 20±2 ч и иммобилизуют специфическими иммуноглобулинами в растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБ) при инкубации в течение 20±2 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп магноиммуносорбенты (МИС) дополнительно обрабатывают раствором альбумина в течение 1-3 ч (Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Хорошенький А.Г., Климова И.М., Бинатова В.В., Пушкарь В.Г. Способ получения магносорбентов: Пат. РФ №2068703, А 61 К 39/385, С 12 N 11/00 // G 01 N 33/53, оп. 10.11.96; Бюл. №31).

Недостатками этого способа являются многостадийность и длительность процесса получения магноиммуносорбента, использование дорогостоящих и токсичных реактивов, что ухудшает экологические условия производства и ограничивает возможности организации промышленного производства препаратов.

Известно, что в качестве носителей можно использовать магносорбенты (МС), приготовленные на основе алюмосиликата и магнитного порошка (И.В.Жарникова, Е.Н.Афанасьев, И.С.Тюменцева и др. Способ получения иммуносорбента (Варианты): Пат. РФ №2138813, G 01 N 33/543, А 61 К 39/385 // G 01 N 33/569, С 12 N 11/14, от 27.09.99, Бюл. №27). Тест-системы, изготовленные на их основе, имеют большие преимущества перед традиционными твердофазными иммуноферментными тест-системами за счет повышения чувствительности и сокращения времени постановки реакций (И.В.Жарникова, А.В.Брыкалов, И.С.Тюменцева. Использование композиционных иммуносорбентов в иммуноферментном анализе (ИФА) для экспресс-диагностики возбудителей ООИ // Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний: Материалы межгосударственной науч. - практич. конф., посвящ. 100-летию открытия возбудителя чумы. - Ставрополь, 1994. - С.41-42.).

Недостатком такого типа иммуносорбентов является значительная дисперсность их носителей по размерам и форме, что затрудняет соблюдение строго стандартных условий при постановке реакций в опытных и контрольных объемах.

В 1998 г. японский исследователь Т.Matsunaga (Matsunaga Т. Механизм образования ультратонких магнитных частиц в магнитных бактериях и их использование // Ouo. Butsuri. - 1998. - V.67, №10. - P.1138-1141.) описал механизм образования ультратонких магнитных частиц в бактериях. Эти частицы были упорядочены в цепи, покрыты клеточной мембраной, хорошо диспергированы и имели диаметр 50-100 нм. Использование магнитного материала бактериального происхождения весьма перспективно, поскольку он может быть легко получен, обладает высокими гидрофильными свойствами и прекрасной возможностью модификации с целью иммобилизации биологических лигандов.

Известен метод получения магнитных эритроцитов за счет их гипотонической обработки коллоидно-дисперсным раствором ферромагнитных ультрачастиц оксида железа размером 20-40 Å. (Данилов Ю.Н., Рудченко С.А., Самохин Г.П., Орехов А.Н. Концентрирование магнитных носителей на основе эритроцитов в сосудистом русле // Бюл. эксп.биол. и мед. - 1985. - №12. - С.701-702; Данилов Ю.Н., Самохин Г.П., Смирнов М.Д., Смирнов В.Н. Способ получения магнитоуправляемых эритроцитов для направленного транспорта лекарств: А.с. СССР №1362476, А 61 К 9/50, 1987).

Недостатком такого типа магнитных эритроцитов является нарушение целостности их мембран при введении магнитного материала, сложность методики придания им магнитных свойств, неизвестная у них величина магнитного момента и их изначально терапевтическое предназначение.

Известен способ получения функциональных магнитных латексов (Лукин Ю.В., Егоров В.В., Зубов В.П., Грицкова И.А., Киселев Е.М., Воронов С.А., Пучин В.А. Способ синтеза функциональных магнитных латексов: А.с. СССР №1249024, оп. 10.08.86, Бюл. №29). Для этого синтез магнитных латексов проводят в присутствии коллоидно-дисперсных ферромагнитных частиц оксида железа Fe₃O₄ переменной валентностью размером 100-250 Å (10-25 нм), стабилизированных олеатом натрия. За счет осмотического насыщения частиц латексов коллоидными растворами оксида железа происходит приобретение последними магнитных свойств.

Недостатком такого способа приготовления МИС является то, что увеличение содержания магнитного материала до 0,33% вес. приводит к значительному увеличению диаметра микросфер от 0,13 до 0,5 мкм и расширению зон распределения частиц по размерам. При более высокой концентрации коллоидно-дисперсных ферромагнитных частиц оксида железа начинают образовываться частицы латексов неправильной формы с различной степенью их наполнения ферромагнитным материалом (Лукин Ю.В., Бахарев В.Н., Зайченко А.С., Воронов С.А., Зубов В.П., Грицкова И.А., Праведников А.Н. Полиакролеиновые латексы: синтез, введение наполнителей и механизм формирования // Доклады академии наук. - 1985. - Т.285, №1. - С.159-161).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения биомагносорбента (Кальной С.М., Гончаров В.И. "Способ получения биомагеносорбента": Патент РФ №2092854, С1 6 G 01 N 33/554, 1997, от 10.10.97 // Бюл. №28. - С.359), в котором ферромагнетик синтезируют в предварительно сублимированном биологическом материале (эритроциты, микробные клетки) за счет последовательных жидкостных обработок концентрированными растворами соли сульфата желез () и водного раствора аммиака, соответственно 25-37%-ного и 15-20%-ного с экспозицией в каждом из них в течение 30-50 ч и с сублимацией материала после каждой жидкостной обработки, проводимой в нормальных условиях с соблюдением соотношения носителя и обрабатывающей жидкости 1:1-2.

Основным недостатком этого способа является необходимость использования сложного и энергоемкого биотехнологического оборудования с соблюдением точных соотношений ингредиентов, используемых для синтеза ферромагнетика, и отсутствие указаний о возможности использования полученных авторами биомагносорбентов в качестве носителей специфических иммуноглобулиновых лигандов для использования в иммуноферментном анализе (ИФА).

Целью изобретения является упрощение технологии получения биомагноиммуносорбента на основе биоматериала (биологических клеток: эритроцитов барана, микробных клеток - грамположительных и -отрицательных) с лигированием на нем специфических антител для обнаружения антигенов особо опасных инфекций (ООИ) в ИФА.

Технический результат изобретения заключается в повышении стабильности, воспроизводимости, демонстративности и чувствительности результатов реакций серологических тест-систем на основе биоматериала (биологических клеток) с магнитными свойствами и фиксированными на них видоспецифическими иммуноглобулиновыми молекулами (антителами), то есть биомагноиммуносорбентами (БМИС), и иммуноферментными (пероксидазными) конъюгатами в ИФА.

Указанный технический результат достигается тем, что предлагаемый способ включает получение магнитного биоматериала (магнитных клеток), содержащих оксид железа (магнетит), лигирование на их поверхности компетентных видоспецифических иммуноглобулинов из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл и постановку серологической иммуноферментной реакции - ИФА с биомагноиммуносорбентом на основе магнитных эритроцитов, клеток вакцинных штаммов чумного, сибиреязвенного микробов, кишечной палочки и Вас. cereus, содержащих магнетит. В ИФА использовали иммунопероксидазный конъюгат, а реакцию выполняли по типу двойного антительного "сэндвича".

Магнитный биоматериал (магнитные клетки) получали разными способами:

а) за счет образования оксида железа в клеточных структурах путем последовательной обработки их 10-40%-ных суспензий 25-35%-ными растворами сульфата железа (II) в течение 48±2 ч и 20-25%-ным водным раствором аммиака в течение 48±2 ч с соотношением объемов клеток и ингредиентов 1:1, 1:2 и лиофильным высушиванием суспензий перед и после каждой жидкостной обработки;

б) за счет образования оксида железа в клеточных структурах путем последовательной обработки их 10-40%-ных суспензий 25-35%-ными растворами сульфата железа (II) в течение 72±2 ч и 20-25%-ным водным раствором аммиака в течение 72±2 ч при нормальных условиях, в том числе с повторением циклов обработки при тех же условиях для увеличения магнитного момента носителей;

в) за счет образования оксида железа в клеточных структурах путем обработки их 10-40%-ных суспензий 25-35%-ными растворами сульфата железа (II) в течение 0.5 ч и 20-25%-ным водным раствором аммиака в течение 0.5 ч на водяной бане при 100°С, в том числе с повторением циклов обработки при тех же условиях для увеличения магнитного момента носителей.

Магнитные свойства эритроцитам и микробным клеткам придавались за счет образования в них и в основном на поверхности их мембран оксида железа Fe₃O₄ (магнетита), с переменной валентностью и магнитными свойствами. Наряду с другими пористыми сорбентами, к которым относится оксид железа (Неймарк И.Е. Синтетичесие минеральные адсорбенты и носители катализаторов. - Киев: Наукова думка, 1982. - 216 с.), последний обладает развитой поверхностью, высокой пористостью, прочностью, стабилен и хорошо адсорбирует биомакромолекулы. При электронной микроскопии эритроциты частицы магнетита нанометрических размеров расположены на внешней и внутренней сторонах мембраны. Доказательством высокой эффективности адсорбции биомакромолекул поверхностью магнитных клеток (эритроцитов и бактерий) явилась возможность их окрашивания люминесцирующими сыворотками с оценкой свечения на (+++). Магнитные клетки, содержащие оксид железа, имеют увеличенные на 40-50% линейные размеры (при этом их объем увеличивается около 3,4 раза), становятся магнитоуправляемыми, обладают хорошей кинетической и агрегативной устойчивостью. По величине дисперсной фазы суспензии магнитных клеток относятся к коллоидно-дисперсной группе (величина частиц >1 и <100 мкм - дисперсоиды), имеют одинаковые размеры и однородную форму дисперсной фазы (Адамов А.К., Агафонов В.И. Суспензионные антигены, антитела и иммуносорбенты. - М.: Медицина, 1969. - 176 с.).

По отношению к наиболее близкому аналогу (прототипу), в качестве которого выбран "Способ получения биомагносорбентов" (Кальной С.М., Гончаров В.И. Способ получения биомагносорбентов: Патент РФ №2092854 С1 6 G 01 N 33/554, 1997, от 10.10.97 // Бюл. №28. - С.359), заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

В патенте RU №2092854 (ближайший аналог) раскрыт способ введения ферромагнетика в биоматериал, содержащий 15%-ную суспензию эритроцитов или микробных клеток чумного вакцинного штамма Y.pestis EV (грамотрицательных).

В заявляемом способе в качестве биоматериала использовали 10-40%-ные суспензии эритроцитов, грамположительных и -отрицательных микробных клеток.

Экспозицию биоматериала в растворах ингредиентов проводили в течение 30-50 ч при комнатной температуре.

В заявляемом способе биоматериал экспозировали в каждом из ингредиентов в течение 0,5 ч при 100°С, 48±2 ч или 72±2 ч.

Соотношение объемов биоматериала и пропитывающих его растворов в описании ближайшего аналога составляет 1:1 или 1:2.

В заявляемом способе соотношение объемов биоматериала и пропитывающих его растворов составляет 1:4 или 1:5.

Кроме того, в описании ближайшего аналога не раскрыта конечная цель получения биомагносорбентов, а в заявляемом способе показано назначение магнитного биоматериала путем его активирования 5%-ным глутаровым альдегидом в течение 4 ч и обработкой видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл в течение 24±2 ч для использования в ИФА.

Синтез ферромагнитного материала в эритроцитах барана и микробных клетках с заведомо известными размерами (1-5 мкм) и формой (сферической, овальной) приводит к получению монодисперсных и сходных по размерам и форме магносорбентов с развитой пористой поверхностью, что позволяет иммуноглобулинам более равномерно распределяться на их поверхностях (при получении диагностикумов), а суспензии носителей равномерно в количественном отношении распределять по емкостям в рядах опытных и контрольных проб, что соответственно приводит к стандартизации условий как получения БМИС, так и выполнения реакций, повышает чувствительность, воспроизводимость, демонстративность, снижает уровень колебания фоновых значений результатов реакций. Увеличение содержания магнитного материала в клетках (эритроцитах барана и бактериях) до 4,0% вес. не приводит к значительному увеличению их размеров и объема.

Предлагаемый способ способствует повышению воспроизводимости, стабильности, демонстративности и чувствительности результатов реакций серологических тест-систем на основе биомагноиммуносорбентов в ИФА с иммуноферментными конъюгатами, выполняемыми по типу двойного антительного "сэндвича". Магнитный биоматериал обладает высокой пористостью, прочностью, стабильностью, хорошими адсорбционными свойствами в отношении биомакромолекул. Оксид железа на мембранах увеличивает удельную поверхность эритроцитов и микробных клеток в 4-5 раз, что было установлено при сканировании образцов в электронном микроскопе. Микробные клетки, имеющие линейные размеры в 4-5 раз меньше, чем у эритроцитов барана (4,5-5 мкм), способствуют образованию ими более плотных суспензий из расчета числа частиц в единице объема, что может иметь преимущества при детекции макромолекул. Магнитные свойства у полученных на основе эритроцитов и микробных клеток 10%-ных суспензий определяли при работе с постоянным магнитом с известным градиентом и массой, концентрировавшим частицы во флаконе объемом 10 мл или в стандартной пробирке в объеме 5 мл в течение 10-15 сек. Биомагносорбенты проявили 100%-ный эффект их удерживания в магнитной ловушке при пропускании через нее проточной воды в течение 24 ч (Ефременко В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. - Ставрополь: "Ставрополье", 1996. - 131 с.). Кроме того, магнитометрами измеряли величину магнитного момента у магнитных эритроцитов и микробных клеток в слабых и сильных магнитных полях (Илионин К.К., Леонтьев Д.М., Набебина Л.И., Орешников В.В., Спиркин С.Н., Цветков В.И., Шаповалов В.Д. Справочник по электроизмерительным приборам: Под ред К.К.Илионина. - 3-е изд.. - Л.: Энергоатомиздат, Ленингр. отд-ние, 1983. - 784 с.).

Возможность практического использования заявляемого способа подтверждается примерами конкретного получения магнитного биоматериала (магнитных эритроцитов и бактерий) для последующего приготовления биомагноиммуносорбентов и обнаружения бактериальных антигенов ООИ.

Пример 1. Магнитные эритроциты барана получали за счет образования оксида железа в клетках после его синтеза путем последовательной обработки 10%-ной суспензии клеток 1,5-кратным объемом 35%-ного раствора соли сульфата железа (II) (FeSO₄×7H₂O) в течение 48±2 ч и затем 1,5-кратным объемом 25%-ного водного раствора аммиака (NH₄OH) в течение 48±2 ч с лиофильным высушиванием суспензий перед и после каждой жидкостной обработки. Установленные соотношения объемов клеток и ингредиентов (1:1-2) подобраны для того, чтобы лиофильно высушиваемые образцы биоматериалов не содержали большого количества продуктов химических реакций, происходящих при старении золя железа и образовании магнетита, и остающихся в среде суспензии с эритроцитами.

Чумные, туляремийные и бруцеллезные биомагноиммуносорбенты готовили на основе полученных магнитных эритроцитов барана путем сенсибилизации их 10%-ных суспензий видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл в течение 24±2 ч. Предварительно поверхность магнитных эритроцитов активировали 5%-ным раствором глютарового альдегида в течение 4 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп биомагноиммуносорбенты (БМИС) дополнительно обрабатывали раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 3 ч. После каждой обработки (глютаровым альдегидом, видоспецифиескими иммуноглобулинами, БСА) БМИС 5-ти кратно промывали 10-ти кратным объемом 0,01 ФСБ, рН 7,2-7,4.

Методика постановки реакции.

Образцы, содержавшие суспензии микробных клеток чумного вакцинного штамма Yersinia pestis EV с концентрацией 1×10⁶, обеззараживали 1%-ным формалином при 56°С в течение 30 мин. Образцы с суспензиями клеток возбудителей туляремии 1×10⁶ и бруцеллеза 1×10⁶ обеззараживали кипячением в течение 30-40 мин, исследовали в иммуноферментных тест-системах с пероксидазным конъюгатом по типу двойного антительного "сэндвича". В качестве емкостей использовали флаконы емкостью 10 мл, а при постановке реакции использовали постоянные магниты. В ряды опытных и контрольных емкостей вносили по 0,1 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ) рН 7,2-7,4 с 0,05% твин-20. К содержимому первых опытных емкостей соответственно добавляли по 0,1 мл обеззараженной взвеси микробных клеток чумного, бруцеллезного или туляремийного микробов. Исследуемый материал титровали с коэффициентом 1:2, из последних емкостей избыточный объем 0,1 мл удаляли. В опытные и контрольные ряды емкостей вносили по 0,1 мл 0,5-1,0%-ной суспензий чумного, бруцеллезного или туляремийного эритроцитарных БМИС (диагностикумов), суспендированных в 0,01 М ФСБ рН 7,2-7,4 с 0,05% твин - 20.

Опытные и контрольные образцы инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Несвязавшиеся с эритроцитарными БМИС антигены отделяли путем 5-ти кратного промывания 10-ти кратными объемами 0,01 М ФСБ рН 7,2-7,4 с 0,05% твин-20.

В ряды опытных и контрольных емкостей вносили чумной, бруцеллезный или туляремийный иммуноглобулиновые пероксидазные конъюгаты в рабочем разведении (соответственно 1:300; 1:400; 1:300) в объеме 0,1 мл на 0,01 М ФСБ рН 7,2-7,4 с 0,05% твин-20 и 1,0% БСА. Опытные и контрольные образцы инкубировали при 37°С. Иммуноферментные конъюгаты, несвязавшиеся с антигенами сорбированными на эритроцитарных БМИС, отделяли путем 5-ти кратного промывания 10-ти кратным объемом 0,01 М ФСБ рН 7,2-7,4 с 0,05% твин-20.

Во все емкости вносили по 0,1 мл субстрат-индикаторной смеси, представляющей раствор, содержащий 10 мл цитратного буфера рН 5,0, 5 мг орто-фенилендиамина и 0,05% перекиси водорода. Все образцы инкубировали при комнатной температуре без доступа света в течение 5-10 мин. Реакцию останавливали внесением в каждую емкость 50 мкл 2,0 М раствора серной кислоты. Учет результатов проводили на приборе "Мультискан" при длине волны 492 нм. Положительным результатом ИФА считалось превышение оптической плотности опытных образцов над оптической плотностью отрицательного контроля в 2 и более раз.

Чувствительность метода составляла 1×10³-1×10⁴ м.к./мл для взвесей чумного микроба, 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - туляремии и 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - бруцеллеза.

Пример 2. Магнитные клетки Вас. cereus (грамположительные) получали за счет образования оксида железа в клетках после его синтеза путем последовательной обработки 10%-ной суспензии клеток 1,5-кратным объемом 25%-ного раствора соли сульфата железа (II) (FeSO₄×7H₂O) в течение 48±2 ч и затем 1,5-кратным объемом 25%-ного водного раствора аммиака (NH₄OH) в течение 48±2 ч с лиофильным высушиванием суспензий перед и после каждой жидкостной обработки.

Чумные, туляремийные и бруцеллезные магноиммуносорбенты готовили на основе полученных магнитных клеток Вас. cereus путем сенсибилизации в течение 24±2 ч их 10%-ных суспензий видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл. Предварительно поверхность магнитных клеток Вас. cereus активировали 5%-ным раствором глютарового альдегида в течение 4 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп биомагноиммуносорбенты (БМИС) дополнительно обрабатывали раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 3 ч. После каждой обработки (глютаровым альдегидом, видоспецифическими иммуноглобулинами, БСА) БМИС 5-ти кратно промывали 10-ти кратным объемом 0,01 ФСБ рН 7,2-7,4.

Методика постановки реакции.

Постановка ИФА аналогична методике, описанной в примере 1.

Учет результатов ИФА проводили аналогично примеру 1.

Чувствительность метода составляла 1×10³-1×10⁴ м.к./мл для взвесей чумного микроба, 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - туляремии и 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - бруцеллеза.

Пример 3. Магнитные эритроциты получали за счет образования оксида железа в клетках после его синтеза путем последовательной обработки 10%-ной суспензии эритроцитов 5-ти кратным объемом 25%-ного раствора соли сульфата железа (II) (FeSO₄×7H₂O) в течение 72±2 ч и затем после удаления избытка раствора соли 4-х кратным объемом 20%-ного водного раствора аммиака (NH₄OH) в течение 72±2 ч.

Чумные, туляремийные и бруцеллезные магноиммуносорбенты готовили на основе полученных магнитных эритроцитов путем сенсибилизации в течение 24±2 ч их 10%-ных суспензий видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл. Предварительно поверхность магнитных эритроцитов активировали 5%-ным раствором глютарового альдегида в течение 4 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп биомагноиммуносорбенты (БМИС) дополнительно обрабатывали раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 3 ч. После каждой обработки (глютаровым альдегидом, видоспецифиескими иммуноглобулинами, БСА) БМИС 5-ти кратно промывали 10-ти кратным объемом 0,01 ФСБ рН 7,2-7,4.

Методика постановки реакции.

Постановка ИФА аналогична методике, описанной в примере 1.

Учет результатов ИФА проводили аналогично примеру 1.

Чувствительность метода составляла 1×10³-1×10⁴ м.к./мл для взвесей чумного микроба, 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - туляремии и 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - бруцеллеза.

Пример 4. Магнитные клетки Вас.anthracis СТИ (грамположительные) получали за счет образования оксида железа в клетках после его синтеза путем последовательной обработки 15%-ной суспензии клеток Вас.anthracis СТИ 5-ти кратным объемом 35%-ного раствора соли сульфата железа (II) (FeSO₄×7H₂O) в течение 72±2 ч и затем после удаления избытка раствора соли 4-х кратным объемом 20%-ного водного раствора аммиака (NH₄OH) в течение 72±2 ч.

Чумные, туляремийные и бруцеллезные магноиммуносорбенты готовили на основе полученных магнитных клеток Вас.anthracis СТИ путем сенсибилизации в течение 24±2 ч их 10%-ных суспензий видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл. Предварительно поверхность магнитных клеток Вас.anthracis СТИ активировали 5%-ным раствором глютарового альдегида в течение 4 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп биомагноиммуносорбенты (БМИС) дополнительно обрабатывали раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 3 ч. После каждой обработки (глютаровым альдегидом, видоспецифическими иммуноглобулинами, БСА) БМИС 5-ти кратно промывали 10-ти кратным объемом 0,01 ФСБ рН 7,2-7,4.

Методика постановки реакции.

Постановка ИФА аналогична методике, описанной в примере 1.

Учет результатов ИФА проводили аналогично примеру 1.

Чувствительность метода составляла 1×10³-1×10⁴ м.к./мл для взвесей чумного микроба, 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - туляремии и 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - бруцеллеза.

Пример 5. Магнитные клетки кишечной палочки Escherichia coli KS 1223 (грамотрицательные) получали за счет образования в них оксида железа после его синтеза путем последовательной обработки 10%-ной суспензии клеток 5-ти кратным объемом 35%-ного раствора соли сульфата железа (II) (FeSO₄×7H₂O) в течение 72±2 ч и затем после удаления избытка раствора соли 4-х кратным 25%-ным водным раствором аммиака (NH₄OH) в течение 72±2 ч. Использование высокой концентрации раствора соли сульфата железа (II) (35%), при нормальных условиях обработки в течение 72±2 ч, позволяло получать клетки с достаточным для практических целей магнитным моментом, так как начальный этап выполнения данной методики связан только с осмотическим проникновением в структуры клеток ионов вышеуказанной соли и отсутствием химических реакций. Экспериментально было показано, что сокращение времени обработки клеток менее 48±2 ч приводит к уменьшению у них магнитного момента.

Чумные, туляремийные и бруцеллезные БМИС готовили на основе полученных магнитных клеток кишечной палочки путем сенсибилизации в течение 24±2 ч ее 10%-ной суспензии видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл. Предварительно поверхность магнитных клеток кишечной палочки активировали 5% раствором глютарового альдегида в течение 4 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп БМИС дополнительно обрабатывали раствором БСА в течение 3 ч. После каждой обработки (глютаровым альдегидом, видоспецифическими иммуноглобулинами, БСА) БМИС 5-ти кратно промывали 10-ти кратным объемом 0,01 ФСБ рН 7,2-7,4.

Методика постановки реакции.

Постановка ИФА аналогична методике, описанной в примере 1.

Учет результатов ИФА проводили аналогично примеру 1.

Чувствительность метода составляла 1×10³-1×10⁴ м.к./мл для взвесей чумного микроба, 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - туляремии и 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - бруцеллеза.

Пример 6. Магнитные клетки чумного вакцинного штамма Y.pestis EV (грамотрицательные) получали за счет образования в них оксида железа после его синтеза за счет повторной, двукратной и последовательной обработки 10%-ной суспензии клеток чумного вакцинного штамма каждым из ингредиентов: 4-х кратным объемом 25%-ного раствора соли сульфата железа (II) (FeSO₄×7H₂O) в течение 72±2 ч и затем после удаления избытка раствора соли 5-ти кратным объемом 20%-ного водного раствора аммиака (NH₄OH) в течение 72±2 ч.

Чумные, туляремийные и бруцеллезные БМИС готовили на основе полученных магнитных клеток чумного вакцинного штамма путем сенсибилизации в течение 24±2 ч 10%-ной суспензии этих клеток видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл. Предварительно поверхность магнитных клеток чумного вакцинного штамма активировали 5%-ным раствором глютарового альдегида в течение 4 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп БМИС дополнительно обрабатывали раствором БСА в течение 3 ч. После каждой обработки (глютаровым альдегидом, видоспецифиескими иммуноглобулинами, БСА) БМИС 5-ти кратно промывали 10-ти кратным объемом 0,01 ФСБ рН 7,2-7,4.

Методика постановки реакции.

Постановка ИФА аналогична методике, описанной в примере 1.

Учет результатов ИФА проводили аналогично примеру 1.

Чувствительность метода составляла 1×10³-1×10⁴ м.к./мл для взвесей чумного микроба, 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - туляремии и 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - бруцеллеза.

Пример 7. Магнитные клетки Вас.cereus (грамположительные) получали за счет образования в них оксида железа после его синтеза за счет повторной, двукратной и последовательной обработки 20%-ной суспензии клеток Вас. cereus каждым из ингредиентов: 4-х кратным объемом 35%-ного раствора соли сульфата железа (II) (FeSO₄×7H₂O) в течение 72±2 ч и затем после удаления избытка раствора соли 5-ти кратным объемом 20%-ного водного раствора аммиака (NH₄OH) в течение 72±2 ч.

Чумные, туляремийные и бруцеллезные БМИС готовили на основе полученных магнитных клеток Вас. cereus путем сенсибилизации в течение 24±2 ч 10%-ной суспензии этих клеток видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл. Предварительно поверхность магнитных клеток Вас. cereus активировали 5%-ным раствором глютарового альдегида в течение 4 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп БМИС дополнительно обрабатывали раствором БСА в течение 3 ч. После каждой обработки (глютаровым альдегидом, видоспецифическими иммуноглобулинами, БСА) БМИС 5-ти кратно промывали 10-ти кратным объемом 0,01 ФСБ рН 7,2-7,4.

Методика постановки реакции.

Постановка ИФА аналогична методике, описанной в примере 1.

Учет результатов ИФА проводили аналогично примеру 1.

Чувствительность метода составляла 1×10³-1×10⁴ м.к./мл для взвесей чумного микроба, 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - туляремии и 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - бруцеллеза.

Пример 8. Магнитные клетки (грамположительные) сибиреязвенного вакцинного штамма Вас. anthracis СТИ получали за счет образования в них оксида железа после его синтеза за счет последовательной обработки 10%-ной суспензии клеток сибиреязвенного вакцинного штамма каждым из ингредиентов: 4-х кратным объемом 25%-ного раствора соли сульфата железа (II) (FeSO₄×7H₂O) в течение 0,5 ч при 100°С и затем после удаления избытка раствора соли 4-х кратным объемом 20%-ного водного раствора аммиака (NH₄OH) в течение 0,5 ч на водяной бане при 100°С.

Чумные, туляремийные и бруцеллезные БМИС готовили на основе полученных магнитных клеток сибиреязвенного вакцинного штамма путем сенсибилизации в течение 24±2 ч 10%-ной суспензии этих клеток видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл. Предварительно поверхность магнитных клеток Вас.anthracis СТИ активировали 5%-ным раствором глютарового альдегида в течение 4 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп БМИС дополнительно обрабатывали раствором БСА в течение 3 ч. После каждой обработки (глютаровым альдегидом, видоспецифическими иммуноглобулинами, БСА) БМИС 5-ти кратно промывали 10-ти кратным объемом 0,01 ФСБ рН 7,2-7,4.

Методика постановки реакции.

Постановка ИФА аналогична методике, описанной в примере 1.

Учет результатов ИФА проводили аналогично примеру 1.

Чувствительность метода составляла 1×10³-1×10⁴ м.к./мл для взвесей чумного микроба, 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - туляремии и 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - бруцеллеза.

Пример 9. Магнитные клетки Bacillus cereus (грамположительные) получали за счет образования в них оксида железа после его синтеза за счет повторной, двукратной и последовательной обработки 40%-ной суспензии клеток Вас. cereus каждым из ингредиентов: 4-кратным объемом 25%-ного раствора соли сульфата железа (II) (FeSO₄×7H₂O) в течение 0,5 ч при 100°С на водяной бане и затем после удаления избытка раствора соли 5-ти кратным объемом 20%-ного водного раствора аммиака (NH₄ОН) в течение 0,5 ч на водяной бане при 100°С.

Чумные, туляремийные и бруцеллезные БМИС готовили на основе полученных магнитных клеток Вас. cereus путем сенсибилизации в течение 24±2 ч 10%-ной суспензии этих клеток видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл. Предварительно поверхность магнитных клеток кишечной палочки активировали 5%-ным раствором глутарового альдегида в течение 4 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп БМИС дополнительно обрабатывали раствором БСА в течение 3 ч. После каждой обработки (глютаровым альдегидом, видоспецифиескими иммуноглобулинами, БСА) БМИС 5-ти кратно промывали 10-ти кратным объемом 0,01 ФСБ рН 7,2-7,4.

Методика постановки реакции.

Постановка ИФА аналогична методике, описанной в примере 1.

Учет результатов ИФА проводили аналогично примеру 1.

Чувствительность метода составляла 1×10³-1×10⁴ м.к./мл для взвесей чумного микроба, 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - туляремии и 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - бруцеллеза.

В каждом случае постановки ИФА оптическая плотность опытных образцов превышала оптическую плотность отрицательного контроля в 6-8 раз, что доказывает демонстративность реакций с использованием разработанных БМИС. Чумные, туляремийные и бруцеллезные жидкие БМИС хранили в холодильнике при 4-8°С в течение 2 лет (срок наблюдения) с проверкой их качества каждые 6 месяцев. Препараты оставались стабильными без утраты специфической активности в течение всего срока наблюдения, в то время, как не фиксированные на твердой матрице иммуноглобулины теряли специфическую активность при тех же условиях хранения в течение 7-14 суток. Это доказывает стабильность препаратов.

Чувствительность метода, выполненного с БМИС на основе различных носителей, составляла: 1×10³-1×10⁴ м.к./мл для взвесей чумного микроба; 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - туляремии; 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - бруцеллеза. При этом показаны высокая демонстративность, воспроизводимость и стабильность результатов реакций. Это было обусловлено значительно меньшим колебанием (на 40-60%) фоновых значений результатов иммуноферментных реакций.

Как показали результаты экспериментальных исследований, экспозиция в каждом из растворов ингредиентов менее 48±2 ч не приводит к образованию частиц с удовлетворительным магнитным моментом для использования в ИФА. Увеличение времени экспозиции биологических клеток, в растворах ингредиентов более 72±2 ч не улучшает магнитные качества носителей.

Снижение концентраций растворов ингредиентов при обработке эритроцитов барана, грамположительных и -отрицательных микробных клеток ниже 25% для FeSO₄×7H₂O и ниже 20% для NH₄OH приводит к уменьшению магнитного момента у носителей. Увеличение концентрации раствора соли сульфата железа (II) выше 35% требует увеличения температуры раствора, что усложняет технологию, а 37%-ный раствор соли сульфата железа (II) в нормальных условиях часто образует осадок соли.

Нагревание 10-40%-ной суспензии эритроцитов или микробных клеток в каждом из растворов ингредиентов в течение 0,5 ч при 100°С приводит к увеличению скорости протекания химических реакций, образованию магнетита и проявлению магнитных свойств у клеток.

Соотношения объемов суспензии клеток и обрабатывающих жидкостей составляет 1:4-1:5 и является существенным условием получения носителей с хорошо выраженным магнитным моментом, высокой механической прочностью, стабильностью и инертностью в отношении разводящей жидкости и биоматериала при исключении сублимационного высушивания. Скорость и направление осмотического перемещения молекул растворов у внешней и внутренней сторон мембран клеток за счет экспериментально подобранных соотношений объемов ингредиентов и клеток обрабатываемых суспензий способствуют наиболее эффективному проникновению ионов в клетки и образованию магнетита. После экспозиции клеток в растворе соли железа избыток последнего удаляется, а к осадку седиментировавших клеток добавляется 4-5-кратный объем раствора аммиака для максимального взаимодействия ионов соли железа, находящихся в заведомо меньшем количестве в клетке и движущихся из клетки, с ионами аммиака, которые за счет осмотического давления попадают в клетки. Центрифугирование клеток после экспозиции в растворе соли железа для уплотнения их осадка с удалением супернатанта и последующей обработкой 4-5-кратным объемом раствора аммиака не приводило к увеличению магнитного момента у носителей.

Представленные в описании примеры 1-9 выполнены с БМИС, полученных на основе магнитных эритроцитов барана, грамположительных и -отрицательных клеток бактерий, а при снабжении носителей магнитной меткой и лигировании антител в примерах показаны все признаки заявляемого способа.

Таким образом, заявляемый способ практически осуществим и имеет преимущество перед прототипом, так как обеспечивает упрощение биотехнологии получения серологической тест-системы для обнаружения бактериальных антигенов с высокой чувствительностью и большей воспроизводимостью, стабильностью и демонстративностью регистрируемых результатов реакций.

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в иммунологии и микробиологии. Сублимированные 10-40%-ные суспензии клеток обрабатывают однократно или двукратно 25-35%-ным раствором сульфата железа. После повторной сублимации обрабатывают 20-25%-ным водным раствором аммиака. Затем активируют полученные магнитные клетки 5%-ным глютаровым альдегидом в течение 4 ч. Обрабатывают их видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл в течение 24±2 ч. Использование изобретения позволяет определять чумные микробы, туляремию, бруцеллез при концентрации 10³-10⁴ м.к./мл, полученные биомагноиммуносорбенты хранятся в течение 2 лет при 4-8°С без потери специфической активности. 5 н.п. ф-лы.

1. Способ получения биомагноиммуносорбента, включающий получение магнитных клеток, выбранных из группы эритроцитов барана, грамположительных или грамотрицательных клеток бактерий, путем последовательной обработки сублимированных 10-40%-ных суспензий клеток 25-35%-ным раствором сульфата железа (II) в течение (48±2) ч и после повторной сублимации 20-25%-ным водным раствором аммиака в течение (48±2) ч с последующим активированием полученных магнитных клеток 5%-ным глютаровым альдегидом в течение 4 ч и обработкой их видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл в течение (24±2) ч.2. Способ получения биомагноиммуносорбента, включающий получение магнитных клеток, выбранных из группы эритроцитов барана, грамположительных или грамотрицательных клеток бактерий, путем последовательной обработки в нормальных условиях 10-40%-ных суспензий клеток 25-35%-ным раствором сульфата железа (II) с соотношением объема клеток и раствора сульфата железа (II) 1:4-1:5 в течение (72±2) ч и затем 20-25%-ным водным раствором аммиака с таким же соотношением объемов в течение (72±2) ч с последующим активированием полученных магнитных клеток 5%-ным глютаровым альдегидом в течение 4 ч и обработкой их видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл в течение (24±2) ч.3. Способ получения биомагноиммуносорбента, включающий получение магнитных клеток, выбранных из группы эритроцитов барана, грамположительных или грамотрицательных клеток бактерий, путем последовательной обработки в нормальных условиях 10-40%-ных суспензий клеток 25-35%-ным раствором сульфата железа (II) с соотношением объема клеток и раствора сульфата железа (II) 1:4-1:5 в течение (72±2) ч, затем 20-25%-ным водным раствором аммиака с таким же соотношением объемов в течение (72±2) ч, повторением обработки суспензии клеток в каждом из ингредиентов по (72±2) ч с последующим активированием полученных магнитных клеток 5%-ным глютаровым альдегидом в течение 4 ч и обработкой их видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл в течение (24±2) ч.4. Способ получения биомагноиммуносорбента, включающий получение магнитных клеток, выбранных из группы эритроцитов барана, грамположительных или грамотрицательных клеток бактерий, путем последовательной обработки при 100°С 10-40%-ных суспензий клеток 25-35%-ным раствором сульфата железа (II) с соотношением объема клеток и раствора сульфата железа (II) 1:4-1:5 в течение 0,5 ч и затем 20-25%-ным водным раствором аммиака с таким же соотношением объемов в течение 0,5 ч с последующим активированием полученных магнитных клеток 5%-ным глютаровым альдегидом в течение 4 ч и обработкой их видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл в течение (24±2) ч.5. Способ получения биомагноиммуносорбента, включающий получение магнитных клеток, выбранных из группы эритроцитов барана, грамположительных или грамотрицательных клеток бактерий, путем последовательной обработки при 100°С 10-40%-ных суспензий клеток 25-35%-ным раствором сульфата железа (II) с соотношением объема клеток и раствора сульфата железа (II) 1:4-1:5 в течение 0,5 ч, затем 20-25%-ным водным раствором аммиака с таким же соотношением объемов в течение 0,5 ч, повторением обработки суспензии клеток в каждом из ингредиентов при 100°С с последующим активированием полученных магнитных клеток 5%-ным глютаровым альдегидом в течение 4 ч и обработкой их видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл в течение (24±2) ч.