АНТИДИАБЕТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2001 года по МПК A61K38/05 A61P3/10 

Изобретение относится к области медицины, в частности, к новым противодиабетическим средствам.

Известно применение инсулина, его аналогов и различных пероральных лекарственных форм при сахарном диабете (1-4). Интенсивное лечение инсулином позволяет снизить риск развития диабетических осложнений, однако длительная хроническая передозировка инсулина приводит к гиперлипидемии, увеличивая риск атеросклероза в 12 раз. Инсулин уменьшает способность β-клеток к регенерации (7).

Предложено сочетанное применение никотинамида и витамина E (5). Данная комбинированная фармакотерапия способствует снижению потребности в инсулине, более быстрому достижению компенсации и увеличению продолжительности периода ремиссии.

Известно применение производных дегидроэпиандростерона для улучшения функционирования β-клеток поджелудочной железы при диабете (6).

Общим недостатком выше названных препаратов является то, что их необходимо применять постоянно, что они лишь снижают риск развития осложнений, влияют только на отдельные звенья патогенеза сахарного диабета, не оказывая комплексного воздействия (10).

Целью настоящего изобретения является расширение ассортимента эффективных антидиабетических средств за счет препаратов, оказывающих воздействие на комплекс патогенетических звеньев заболевания.

Поставленная цель достигается применением тимогена (L-глутамил-L-триптофана).

Заявляемый препарат широко используется в качестве иммуностимулятора при многих заболеваниях (9).

Исследования проводились на белых беспородных крысах самках и самцах с массой тела 100-200 г и белых беспородных мышах-самцах с массой тела 17-23 г. Сахарный диабет воспроизводился общепризнанным методом аллоксановой модели (J. S. Dunn, 1943). Для этого аллоксан вводился животным подкожно однократно после 24-часового голодания в дозах 130,0-150,0 мг/кг для крыс и 300 мг/кг для мышей. При профилактическом применении испытуемый препарат вводился животным опытных групп подкожно однократно в дозе 10,0 мкг/кг за 40 минут до введения аллоксана. При лечебном применении тимоген вводился в дозе 10 мкг/кг ежедневно 1 раз в сутки подкожно в течение 8 дней, начиная с 48 часов после введения аллоксана. Интактные животные не получали ни аллоксана, ни тимогена.

При клиническом применении тимоген вводился больным сахарным диабетом интраназально в виде стерильного 0,01% раствора по 10-20 мкг (3-5 капель) ежедневно 1 раз в сутки в течение 7-12 дней.

Оценка антидиабетической активности препарата осуществлялась по следующим показателям: летальность животных; масса тела животных; концентрация глюкозы в крови у людей и животных; функциональная проба "глюкозная нагрузка" у животных; состояние перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты (ПОЛ-АОЗ) у животных; световая микроскопия островков поджелудочной железы с морфометрией у животных.

При остром отравлении животных аллоксаном, который используется в мировой экспериментальной биологии и медицине для моделирования сахарного диабета, а также при клиническом применении тимоген оказывает выраженное положительное действие.

Антидиабетическое действие тимогена имеет комплексный характер и выражается в усилении гипогликемического эффекта инсулина у интактных животных; предупреждении гибели, уменьшении степени потери массы тела животных после отравления аллоксаном; снижении гипергликемии у животных и человека; защите при функциональной нагрузке глюкозой, снижении ПОЛ, активации АОЗ, защите бета-клеток от повреждения аллоксаном у животных.

Примеры выполнения, подтверждающие заявляемое, приведены ниже.

Пример 1. Определение способности усиливать действие инсулина.

Опыт проводился на белых мышах. За основу была взята методика стандартизации инсулина по "судорожной" реакции (8). В каждой из 2-х групп было по 20 животных. Первой группе был введен тимоген, однократно подкожно, в дозе 10 мкг/кг, второй группе - одинаковое по объему количество 0,9% раствора натрия хлорида. Через 72 часа животным обеих групп был введен инсулин в дозе 0,6 ЕД/кг. Животные были помещены в термостат с температурой 37^oC. Время наблюдения составило 90 минут.

Установлено, что в интактной группе в результате гипогликемической комы летальность после введения инсулина составила 65%, в то время как в группе с тимогеном - 100%.

Таким образом, тимоген усиливает гипогликемическое действие инсулина.

Пример 2. Изучение влияния тимогена на летальность животных при остром токсическом действии аллоксана.

Опыт на крысах-самках. Аллоксан вводился в дозе 130 мг/кг. Опытной группе животных за 40 минут до аллоксана однократно подкожно вводился тимоген в дозе 10 мкг/кг. В каждой из 3-х групп по 18 животных. В течение 7 дней оценивалась летальность животных.

Из таблицы 1 видно, что за 7-дневный период наблюдений аллоксан вызывал более 60% летальности. В дальнейшем гибель животных в контрольной группе не наблюдали. Профилактическое введение тимогена полностью предупредило смертность от токсического действия аллоксана.

Опыт на крысах-самцах проведен по той же схеме.

В результате опыта установлено, что летальность в интактной группе отсутствовала (0%), в контрольной группе с применением аллоксана (130 мг/кг) составила 8,7%, а в опытной группе с применением тимогена за 40 минут до введения аллоксана также не отмечено гибели животных (0%).

Таким образом, установлено, что используемый тимоген на модели аллоксанового диабета при однократном превентивном применении в дозе 10 мкг/кг полностью исключает гибель животных от острого отравления аллоксаном.

Пример 3. Влияние тимогена на динамику массы тела животных при экспериментальном аллоксановом диабете.

Опыт на крысах-самцах. В каждой из 3 групп было по 23 животных. Тимоген вводился за 40 минут до аллоксана.

В таблице 2 приведены результаты взвешивания крыс в процессе наблюдений. Интактные животные в течение 11 дней равномерно росли и дали среднесуточный прирост 0,74% или по 1,16 г в сутки. Однократное введение аллоксана принципиально изменило динамику роста. До 7-го дня крысы ежедневно теряли массу тела. Максимум потери достиг 8,76% или 14,0 г на 1 животное. К этому дню разница в массе тела по отношению к интактным животным составила 13,56%. С 8-го дня после введения аллоксана потеря массы тела прекратилась. Но и к 11-му дню наблюдений исходная масса тела не была еще достигнута на 5,07% и разница с интактными животными составила 13,25%.

Введение тимогена резко уменьшило потери массы тела как по степени отрицательного токсигенного действия аллоксана, так и по его продолжительности. Максимум снижения массы тела (на 3,73%) пришелся на 3-й день. Затем животные начали прибавлять массу тела, и на 7-й день (пик аллоксанового снижения) масса составила 99,07% от исходной. Это на 7,83% больше по сравнению с контролем и на 5,10% меньше, чем у интактных крыс. На 9-й день животные достигли своей исходной массы (100,25%). Через 11 суток разница с контролем составила 9,85%, а с интактной группой уменьшилась до 3,40%.

Таким образом, в опытах на белых крысах показано, что заявляемый препарат оказывает комплексное действие при остром отравлении аллоксаном. Тимоген в дозе 10 мкг/кг, введенный за 40 минут до инъекции аллоксана в дозе 130 мг/кг, на 60% снижает летальность, предупреждает максимальную потерю массы тела на 5,03%, способствует ее полному восстановлению и дальнейшему росту.

Пример 4. Влияние тимогена на динамику глюкозы.

Профилактическое применение тимогена (однократно за 40 минут до аллоксана).

Опыт на крысах-самцах. В каждой из 3 групп было по 23 животных.

В таблице 3 и на фиг. 1 представлена динамика содержания глюкозы в крови крыс-самцов на протяжении 11 суток наблюдений.

У интактных самцов на протяжении периода наблюдений содержание глюкозы в крови колебалось от 4,3±0,08 до 5,1±0,10 мМ/л. Динамика колебаний не носила закономерного характера. Введение аллоксана сопровождалось резкой гипергликемией уже на вторые сутки наблюдений, содержание глюкозы в крови увеличилось в 2,45 раза. На 3-и сутки гипергликемия достигла максимума (подъем в 2,59 раза по сравнению с исходным), а затем начала снижаться и с 8-х суток вошла в рамки колебаний (4,8±0,40 мМ/л - 5,1±0,35 мМ/л), сходных с интактными животными, хотя на 10-й и 11-й дни гликемия у аллоксановых крыс была достоверно выше, чем у интактных на 10,20% и 15,69% соответственно.

Введение тимогена существенно изменило динамику концентрации глюкозы в крови самцов крыс. Максимально уровень глюкозы увеличился на 3-й день в 1,31 раза по сравнению с исходным и был в 1,81 раза ниже, чем в аллоксановой группе. Затем уровень гипергликемии постепенно снижался, и с 5-х суток содержание глюкозы в крови опытных животных не отличалось достоверно от интакта. К этому дню уровень глюкозы крови опытных крыс был в 1,96 раза ниже чем у контрольных. На 8-й день (нормализация глюкозы у аллоксановой группы) уровень гликемии у опытных животных был ниже чем у контрольных и интактных на 22,92% и 15,91% соответственно. На 9-11-й дни уровень глюкозы в крови у опытных крыс был ниже по сравнению с контрольными на 0,4-0,7 мМ/л, а разница с интактом составила ±0,1 мМ/л.

Таким образом, в опыте на самцах белых крыс показано, что исследуемый препарат оказывает положительное влияние на динамику уровня глюкозы в крови при аллоксановом диабете, что проявляется в снижении в 1,97 раза максимального подъема гликемии и более ранней (на 3-е суток) ее нормализации.

Лечебное применение тимогена (ежедневно, начиная с 48 часов после введения аллоксана).

Опыт на крысах-самцах. В каждой из 3 групп было по 8 животных.

В таблице 4 и на фиг. 2 представлена динамика содержания глюкозы в крови крыс-самцов на протяжении 9 суток наблюдений.

У интактных животных содержание глюкозы в крови составило от 5,4±0,25 до 5,6±0,36 мМ/л. Введение аллоксана сопровождалось выраженной гипергликемией. На вторые сутки наблюдений содержание глюкозы в крови увеличилось в 2,82 раза. На 5-е сутки отмечался максимум гипергликемии (подъем в 3,01 раза по сравнению с исходным), а затем уровень глюкозы в крови начал снижаться, но даже на 9-й день был достоверно выше, в 1,53 раза, чем у интактных животных.

Ежедневное введение тимогена было начато через 48 часов после аллоксана на фоне глюкозы крови 15,3±0,85, что превышало уровень гликемии интактных животных в 2,78 раза. Уже на следующий день после начатого лечения глюкоза в крови крыс снизилась в 1,76 раза и была в 1,79 раза ниже, чем у контрольных животных, но 1,56 раза выше по сравнению с интактом. На 5-е сутки отмечался незначительный подъем (на 0,3 мМ/л) уровня гликемии у животных, получающих лечение тимогеном, но при этом гликемия в данной группе оставалась достоверно ниже (в 1,89 раза), чем в аллоксановом контроле. В дальнейшем в группе с тимогеном отмечалось снижение уровня гликемии и на 9-е сутки содержание глюкозы в крови леченых животных было ниже в 1,40 раза, чем у аллоксанового контроля, и достоверно не отличалось от интактных крыс.

Таким образом, ежедневное лечебное применение тимогена позволяет значительно снизить уровень глюкозы в крови у крыс с аллоксановым диабетом. Уже однократное лечебное введение тимогена приводит к снижению уровня гликемии в 1,76, а дальнейшее его применение позволяет стабилизировать положительную динамику.

Пример 5. Действие тимогена при функциональной нагрузке глюкозой.

Опыт на крысах-самках. В каждой из 3 групп было по 7 животных.

На 1-е сутки после введения аллоксана животным всех групп проведена "глюкозная нагрузка". Оценивался исходный уровень глюкозы, после чего каждому животному подкожно, однократно ввели раствор глюкозы из расчета 800,0 мг/кг. Через 60 и 120 минут после инъекции вновь оценивали уровень гликемии.

Результаты глюкозной нагрузки на 1-е сутки приведены в таблице 5 и наглядно представлены на фиг. 3.

Установлено, что у интактных крыс через 60 минут уровень глюкозы крови поднялся на 53,3%, а через 120 минут составил 95,6% от исходного.

Введение аллоксана привело к значительным изменениям показателей гликемии при проведении функциональной пробы. Через 60 минут уровень глюкозы в крови животных поднялся на 162,7%, что в 3,1 раза выше, чем у интактных крыс, а через 120 минут составил 202,0% от исходного.

При применении тимогена уровень глюкозы через 60 минут поднялся на 67,3%, что выше, чем у интактных крыс на 14,0%, но достоверно ниже по сравнению с контролем на 95,4%. Через 120 минут уровень гликемии составил 96,0% от исходного, что выше, чем в интакте, на 0,4% и ниже на 106,0%, чем в контроле.

Таким образом, заявляемый препарат обеспечивает сохранение адекватной ответной реакции на нагрузку глюкозой при проведении функциональной пробы на 1-е сутки после введения аллоксана.

Пример 6. Влияние тимогена на состояние системы ПОЛ-АОЗ.

Опыт на крысах-самцах. В каждой из 3 групп было по 7 животных.

Результаты оценки состояния системы ПОЛ-АОЗ на 3-й день наблюдения представлены в таблице 6.

Аллоксановый диабет у крыс сопровождается активизацией процессов перекисного окисления липидов и истощением системы антиоксидантной защиты. Так, концентрация малонового диальдегида (МДА) в крови на 3-и сутки после введения аллоксана повысилась на 26% по отношению к интактным животным. Активность глутатионпероксидазы (ГПО) снизилась на 4%, глутатионредуктазы (ГР) - на 43%.

Применение тимогена на фоне аллоксанового диабета вызывает позитивный сдвиг в балансе свободнорадикальных реакций организма опытных животных. Уровень малонового диальдегида в группе опытных крыс был достоверно ниже по сравнению с контрольными животными на 18,36% и лишь на 3,05% был выше чем у интактных крыс. Тимоген вызывал изменения в системе глутатионзависимых ферментов. Так, в опытной группе активность глутатионпероксидазы была на 42,86%, а глутатионредуктазы на 61,77% выше, чем в контроле.

Пример 7. Влияние тимогена на β-клетки поджелудочной железы при аллоксановом диабете.

Опыт на крысах-самцах. В каждой из 3 групп было по 7 животных.

Результаты морфологических исследований β-клеток поджелудочной железы на 8-й день после введения аллоксана представлены в таблице 7.

У интактных животных количество β-клеток на 1000 мкм² островка составило 11,2. В группе аллоксана 1,5, что 7,47 раза меньше чем в интакте. Введение тимогена оказало существенное влияние на количество β-клеток в островках, их число составило 8,1/1000 мкм². Это в 5,40 раза больше чем в контроле и только в 1,38 раза меньше по сравнению с интактом.

Соотношение ядро/цитоплазма*100 β-клетки в интакте составило 41,17, в контроле 22,06, что в 1,87 раза меньше чем в интакте. Введение тимогена позволило сохранить ядерно-цитоплазматическое отношение на значении 38,75. Это на 75,67% больше по сравнению с аллоксановым контролем и лишь на 5,86% меньше по сравнению с интактом.

Таким образом, заявляемый препарат в 5,4 раза предупреждает уменьшение количества β-клеток в островках и на 75,67% сохраняет их функциональную активность судя по ядерно-цитоплазматическому соотношению.

Пример 8. Клиническое применение тимогена.

Проводилось исследование действия тимогена на уровень глюкозы крови у больных сахарным диабетом, находящихся на диспансерном учете в поликлинике.

Больная М. , 1953 года рождения. Инсулиннезависимый сахарный диабет с 1996 года. В течение последней недели принимала манинил по 5 мг 3 раза в сутки. При этом уровень глюкозы в крови изменялся от 11,6 до 12,1 мМ/л. Перед началом лечения тимогеном исходный уровень составил 11,7 мМ/л. Тимоген применялся интраназально в виде стерильного 0,01% раствора по 10-20 мкг (3-5 капель) ежедневно 1 раз в сутки. На 5-й день лечения уровень глюкозы снизился до 5,2 мМ/л. Доза манинила была уменьшена в 2 раза (по 2,5 мг 3 раза в день), лечение тимогеном продолжалось. Через 12 дней после начала лечения тимогеном и через 7 дней после уменьшения дозы манинила уровень глюкозы крови составил 10,6 мМ/л.

Больной З. , 1937 года рождения. Инсулиннезависимый сахарный диабет с 1997 года. В течение двух недель получал глюренорм по 30 мг 1 раз в сутки. Глюкоза крови составляла 9,5 - 10,2 мМ/л. Перед началом лечения тимогеном исходный уровень глюкозы был 9,7 мМ/л. Тимоген вводился интраназально по 10-20 мкг (3-5 капель) в виде стерильного 0,01% раствора ежедневно 1 раз в сутки. На фоне применения тимогена уровень глюкозы крови уменьшился и составил как на 3-й, так и на 7-й день лечения 6,7 мМ/л.

Больной С. , 1946 года рождения. Инсулиннезависимый сахарный диабет с марта 2000 года. Проводилась диетотерапия, медикаментозного лечения не получал. Глюкоза крови за последние 2 недели колебалась от 7,0 до 8,0 мМ/л. К моменту начала лечения тимогеном составила 7,8 мМ/л. На 3-й день лечения (по 10-20 мкг стерильного 0,01% раствора интраназально ежедневно 1 раз в сутки) уровень гликемии снизился до 5,7 мМ/л, а на 7-й день составил 5,8 мМ/л.

Таким образом, тимоген оказывает сахароснижающее действие при клиническом применении у больных с сахарным диабетом. Использование тимогена вместе с другими антидиабетическими средствами дает возможность снижения дозы последних без ухудшения показателей гликемии у больного.

Заявляемый препарат обладает комплексным антидиабетическим действием.

Однократное введение тимогена в дозе 10 мкг/кг усиливает гипогликемический эффект вводимого инсулина. При аллоксановом диабете тимоген на 60% снижает летальность, предупреждает общую потерю массы тела на 5,03%, в 1,97 раза снижает гипергликемический пик, обеспечивает на 3-е суток раньше нормализацию глюкозы в крови при профилактическом применении, обеспечивает в 1,76 раза снижение уровня глюкозы в крови при лечебном использовании, сохраняет адекватную ответную реакцию при функциональной нагрузке глюкозой после введения аллоксана. На 18,36% снижает интенсивность ПОЛ, стимулирует антиоксидантную защиту на 42-62%. Обладает выраженным защитным действием в отношении β-клеток, в 5,4 раза предупреждая уменьшение их количества и на 75,67% сохраняет их функциональную активность. При клиническом применении тимогена у больных сахарным диабетом, препарат снижает уровень гипергликемии в 1,3-2,2 раза.

ЛИТЕРАТУРА
1. Патент США N 452589, A 61 K 37/26.

2. Campbell R.K., Ann. Pharmacother., 30 (11), 1263-1271 (1996).

3. Matthaei S., Fortschr. Med., 115 (12), 35-36 (1997).

4. Heinemann L., Traut T., Heise T., Diabet. Med., 14 (1), 63-72 (1997).

5. Pozzilli P., Eur.J. Endocrinol., 137 (3), 234-239 (1997).

6. Патент США N 4518595, A 61 K 31/56, 1985.

7. Tomioka T, Fujii H, Hirota M, Ueno K, Pour PM Int J Pancreatol, May, 8 (4), 355-66 (1991).

8. Кабак Я.M. Практикум по эндокринологии. Издательство Московского университета, 1968.

9. Машковский M. Д. Лекарственные средства, 2 т., Москва, "Медицина", 1998.

10. Чернов Ю.H., Пашков А.H., Васин M.В., Батищева Г.А., Золотарев Д.В. Экспериментальная и клиническая фармакология, Май-Июнь, 62 (3), 60-6 (1999).

Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии, и касается применения тимогена (L-глутамил-L-триптофана) в качестве антидиабетического средства. Изобретение позволяет расширить ассортимент эффективных антидиабетических средств за счет препарата, обладающего комплексным действием, которое выражается в усилении гипогликемического эффекта инсулина, предупреждении гибели, уменьшении степени потери массы тела, снижении гипергликемии, снижении перикисного окисления липидов, активации системы антиоксидантной защиты, защите бета-клеток от повреждения при сахарном диабете. 7 табл., 3 ил.

Применение тимогена (L-глутамил-L-триптофана) в качестве антидиабетического средства.