РАСТИТЕЛЬНЫЙ ИММУНОСТИМУЛЯТОР Российский патент 2001 года по МПК A61K35/78 A61K31/58 

Изобретение относится к медицине, конкретно к средствам для повышения защитных сил организма. Эффективность вакцин, вызывающих стойкий и напряженный иммунитет, в немалой степени зависит от препаратов, способных усиливать эффект иммунизации. Для этой цели используются адъюванты и иммуностимуляторы. В настоящее время ведется активный поиск и исследование таких препаратов из растительного сырья.

Известно применение для активации иммунного ответа фракции сапонинов - QuilA, выделенной из южно-американского дерева Quillaia saponaria и представляющей собой смесь тритерпеновых гликозидов [1] . На основе указанного экстракта разрабатывается препарат - ISCOMs - иммуностимулирующий комплекс, состоящий из антигена, холестерола, фосфолипидов и природных сапонинов [2]. Известна иммуностимулирующая активность циклоартрановых гликозидов - куркулигосапонинов C и F из Curculigo orchioides (содержание 0.13 - 0.20%) [3].

Недостатком указанных препаратов является недоступность растительного сырья, проявление указанными препаратами иммуносупрессорных свойств при использовании в больших дозах, а также низкая эффективность при оральном введении.

Известно также иммуностимулирующее действие β глицирризиновой кислоты, основного компонента корня солодки. Основным недостатком этого препарата в плане его широкого применения является минералокортикоидное действие [4].

Задачей изобретения является расширение арсенала средств из отечественного сырья, повышающих защитные силы организма.

Поставленная задача решается путем использования известного вещества класса флавоноидов, группы изофлаванов, конкретно (+)-(R)-ликорицидина, формулы (I) [5] , выделенному из этанольного экстракта солодки уральской Glycyrrhiza uralensis F.

Аналогами по строению соединения (I) являются природные изофлаваны - (-)-дауртин (II), (+) И (-)-мукронулатолы (III), (+) и (-)-веститолы (IV), унаниизофлавон (V) [6], выделенные из бразильских видов лекарственных растений, а также (+) 7-O-метилликорицидин (VI), найденный в солодке уральской [7] . Описан также полный синтез соединения (VI) [8]. Соединение (VI) и содержащие его экстракты корня солодки обладают транквилизирующей и антидотной активностью [7].

II (R¹=R⁴=OH; R²=R³=R⁵=R⁶OMe; R⁷=R⁸=H);
III (R¹=R⁴=OH; R²=R⁶=R⁷=R⁸=H; R³=R⁵=OMe);
IV (R¹=R³=OH; R²=R⁴=R⁶=R⁷=R⁸=H; R⁵=OMe;
V (R¹=R⁴=OH; R²=R⁷=H; R³=R⁵=R⁸=H; R⁶=Me₂CH);
VI (R¹=R⁷=OMe; R²=R⁶=H; R³=R⁵=OH; R⁴=R⁸=CH₂CH C(Me)₂).

Известны препараты солодки - ликвиритон - сумма флавоноидов (содержание не менее 55% в пересчете на ликуразид) и флакарбин, применяемые при лечении язвенной болезни желудка [9]. Иммуностимулирующие свойства указанных экстрактов, а также индивидуальных фенольных соединений из солодки не изучены [10, 11].

(+)-R-Ликорицидин (I) в качестве иммуностиммулятора может использоваться как в чистом виде, так и в виде высушенного экстракта корня солодки, содержащего от 12 до 38% вещества (I). Кроме указанного флавана, в состав экстракта входят флаваны, флавоноиды и изофлавоноиды, содержащие пренильные заместители в положениях C⁵, C⁷, C⁸, C^2', C^3', C^4' атомов, а также гликозидосодержащие (изо)-флавоноиды.

Способ получения экстрактов заключается в обработке измельченных корней Glycyrrhiza uralensis F. этанолом при комнатной температуре с последующим извлечением из упаренного и высушенного спиртового экстракта активных компонентов с помощью метил-трет.-бутилового эфира. Выход упаренного и высушенного экстракта составляет 8.5 - 10% на воздушно-сухое сырье. Содержание вещества (1) в исследованных экстрактах составляло 6 - 55%. Выход суммы экстрактивных веществ фенольной природы, а также соотношение компонентов зависит от места сбора и времени сбора сырья.

Соединение (I) выделяется из упаренного спиртового экстракта корня солодки путем обработки его диэтиловым эфиром с последующей колоночной хроматографией эфирного раствора на силикагеле. Для получения индивидуального кристаллического вещества обогащенные фракции перекристаллизовывали из смеси эфир-гексан. Выход соединения составляет 0.31% на воздушно-сухое сырье.

Достоинством изобретения является возможность комплексного использования растительного сырья солодки уральской путем переработки фенольных компонентов солодки, накапливающихся при получении лекарственных препаратов глицирризиновой кислоты - глициррама и глицирризина [9].

Иммуностимулирующие свойства патентуемого соединения и его экстрактов изучали на беспородных мышах массой 18-20 г при иммунизации слабым антигеном [бычий сывороточный альбумин (БСА)]. Схема иммунизации была следующей. Первичный иммунный ответ у животных индуцировали путем подкожного введения 500 мкг БСА в 0.5 мл стерильного физиологического раствора. Вторичный иммунный ответ вызывали повторным введением антигена через 28 дней (в дозе 100 мкг).

Исследуемые вещества вводили в дозах 5 мг/кг или 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного физиологического раствора внутрибрюшинно (в/б) или подкожно (п/к). Контрольной группе животных вводили антиген без препарата (отрицательный контроль) или с полным адъювантом Фрейнда (положительный контроль).

Кровь для получения исследуемой сыворотки забирали на 14 и 36 сутки после первой иммунизации индивидуально от каждого животного, уровень специфических антител в сыворотках оценивали иммуноферментным анализом (ИФА) по стандартной методике.

Для сравнения исследовали иммуностимулирующие свойства глицирризиновой кислоты (VII) - основного тритерпенового компонента корня солодки, а также ликвиритина (VIII) - основного фенольного компонента экстрактов солодки [10, 11].

Результаты испытаний приведены в табл. 1, 2 и 3.

Из данных табл. 1 видно, что экстракт корня солодки 1, содержащий по данным ВЭЖХ 20% вещества (I), обладает выраженными иммуностимулирующими свойствами, так как титры антител в сыворотках, полученных от иммунизации альбумином с этим препаратом, сходны с титрами антител в сыворотках при иммунизации с полным адъювантом Фрейнда и в 100 раз выше, чем при введении альбумина без препарата. Необходимо отметить, что экстракты 2 (по данным ВЭЖХ содержание ликорицидина составляет 10%) и 3 (по данным ВЭЖХ содержание ликорицидина составляет 40%), а также глицирризиновая кислота (VII) по активности существенно уступают полному адъюванту Фрейнда. Экстракт 1 является наиболее эффективным иммуностимулятором также и при подкожном введении. Экстракт также не вызывает иммуносупрессорных свойств при введении в большой дозе.

В табл. 2 приведены данные по иммуностимулирующему действию индивидуальных компонентов экстракта - ликорицидина (I), ликвиритина (VIII), а также экстрактов, содержащих 11% (экстракт 4) и 45-50% (экстракты 5, 6) вещества (I).

Из данных табл. 2 видно, что все экстракты обладают иммуностимулирующей активностью. Наибольшей иммуностимулирующей активностью как при подкожном, так и при оральном введении, обладает соединение (I). Следует отметить, что соединение (VIII) - обладает меньшей активностью, чем любой из экстрактов.

В табл. 3 приведены данные по иммуностимулирующему действию экстрактов, содержащих различное количество соединения (I).

Из данных табл. 3 видно, что все экстракты по титру ИФА превышают эффект контрольной группы. Наибольшей активностью, сравнимой с эффектом адъюванта Фрейнда, обладает экстракт 9, а при подкожном введении - экстракт 10.

Таким образом, из данных табл. 1-3 наибольшей иммуностимулирующей активностью обладают экстракты, содержащие соединение (I) в концентрации 12-38 мас.%.

Соединение (I) и его экстракты относятся к 3-ему классу умеренно опасных веществ. ЛД₅₀ для (I) - 700 мг/кг, для экстрактов 1, 9 и 10 - >5000 мг/кг.

Данное изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1. Получение экстрактов 1 - 12. 100 г воздушно-сухих измельченных корней Glycyrrhiza uralensis F. заливают 250 мл 95%-ного этанола, настаивают 12 ч при 20^oC, а затем 8 ч при 50-60^oC при перемешивании. Спиртовый настой отфильтровывают, упаривают, сушат в вакууме, получают сухой сыпучий аморфный порошок (вес 11,2 - 12,3 г, в зависимости от времени и места сбора сырья). 10 г полученного сухого экстракта обрабатывают 20 мл метил-трет.-бутилового эфира при кипячении, по охлаждении отфильтровывают, полученный фильтрат упаривают, остаток растирают с гексаном. Образовавшийся осадок (8,2-9,5 г) (8,5-10,0%) отфильтровывают, сушат в вакууме. Содержание соединения (I) в экстракте определяют по данным ВЭЖХ [Хроматограф - Милихром A-02, колонка ⊘ 2x75 мм, Nucleosil 5-C 18, элюент A: EtOH:0,03%CF₂COOH, 10:90; элюент B: EtOH:H₂O, 90:10, детектор: 230 и 260 нм].

Пример 2. Выделение соединения (I). 10 г спиртового экстракта, полученного в условиях примера 1, обрабатывают 45 мл диэтилового эфира при комнатной температуре, образовавшийся осадок (флавоноиды, гликозиды) отфильтровывают, полученный фильтрат упаривают, остаток (0,8-0,9 г) сушат в вакууме и подвергают колоночной хроматографии на силикагеле (элюент - бензол - этилацетат). Фракцию 2 (элюент бензол) (вес 0,35 г) перекристаллизовывают из смеси гексан: эфир, 3:1. Получают 0.31 г вещества (1), т.пл. 157-159^oC, [α] ₅₈₀ +23,2^o (с 0,5, MeOH), которое по данным ЯМР- и масс-спектров соответствует ликорицидину [4]. Абсолютная конфигурация соединения установлена как (3R) из данных анализа оптического кругового дихроизма (CD) [θ]₃₂₈ + 1,2•10³ (положительный максимум), [θ]₂₈₂ + 2,2•10³ (положительный максимум).

Пример 3. Выделение соединения (VIII). 10 г спиртового экстракта, полученного в условиях примера 1, вносят в смесь 15 мл воды и 15 мл этилацетата. Окрашенные слои разделяют на делительной воронке, водный слой охлаждают до 10^oC. Через 12 ч отфильтровывают 0,7 г соединения (VIII), которое по данным ЯМР- и масс-спектров соответствует ликвиритину [11].

Пример 4. Иммуностимулирующие свойства заявляемых веществ изучали на 288 животных. Беспородным мышам вводили подкожно 500 мкг бычьего альбумина в 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Исследуемое соединение вводили в дозах 5 мг/кг или 100 мг/кг внутрибрюшинно или подкожно. Контрольным животным вводили бычий альбумин без препарата (отрицательный контроль) или с полным адъювантом Фрейнда (положительный контроль). Повторное введение альбумина в дозе 100 мг на мышь проводили на 28 сутки. Сыворотки получали на 14 и 36 сутки и исследовали методом иммуноферментного анализа индивидуально от каждого животного. Эксперименты повторяли дважды, на каждую дозу и способ введения брали по 6 мышей. Результаты приведены в табл. 1-3.

Таким образом, соединение (I), а также экстракты его содержащие, обладают следующими преимуществами:
- они доступны, так как выделяются из доступного растительного сырья (солодка уральская);
- способ получения прост в технологическом оформлении и не требует дорогостоящих реагентов и оборудования;
- соединение (I) и его экстракты обладают выраженной иммуностимулирующей активностью, не проявляя иммуносупрессорных свойств, присущих известным иммуностимуляторам терпеноидной природы.

Источники информации
1. Bomford R., Stapleton M., Winsor S., Beesley J.E., Jessup E.A. Vaccine. 1992. V. 10. N 9. P.572-577.

2. Kersten G. F. A., Crommelin D.J.A. Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1241. N 2. P. 117-138.

3. Xu J.-P., Xu R., Li X.-Y. Phytochemistry. 1992. V. 31. N 1. P. 233-236.

4. Hikino H. in Economic and Medicinal Plant Research. // Ed. by Wagner H., Hikino H., Farnsworth N.R., v. I, p.55-60, Academic Press, 1985.

5. Fukai Т. , Toyono M., Nomura T. On the Structure of Licoricidin. // Heterocycles. 1988. V. 27. N 10. P. 2309-2313.

6. Бандюкова В.А., Казаков А.Л. Успехи в химии природных изофлавоноидов. ХПС, 1978. N 6. С. 670-689.

7. Пат. США 4.639.466 МКИ A 61 K 031/35. С.А., 1987. 106. 189006 с.

8. T. L. Shin, M.J.Wyvratt, H.Mrozik, J.Org.Chem. 1987. V. 52. N 10. P. 2029-2013.

9. Машковский М. Д. Лекарственные средства, т. 1, С.361-362, Медицина, Москва, 10-е изд.), 1987.

10. Толстиков Г.А., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстикова Т.Г. Солодка. Неиспользуемые возможности здравоохранения России, Химия в интересах устойчивого развития, 1997. N 5. С.57-73.

11. Okuda Т. , Yoshida Т., Hatano Т. In Food Phytochemicals for Cancer Prevention II // ACS Symp. Ser. 547. Ch. 15. P. 133-143, 1996.

Изобретение относится к медицине, конкретно к поиску иммуностимуляторов растительного происхождения. В качестве последних предлагается использование (+)-R-ликорицидина (1), компонента корня солодки уральской, а также высушенного в виде порошка и обработанного экстракта корня солодки уральской, содержащего 12-38 мас.% вещества (1). Предлагаемые иммуностимуляторы не токсичны, выделяются из доступного растительного сырья и не обладают побочными эффектами, присущими известным растительным иммуностимуляторам терпеноидной природы. 2 с.п. ф-лы, 3 табл.

1. Применение (+)-R-ликорицидина формулы I

в качестве иммуностимулирующего средства. 2. Растительный иммуностимулятор на основе экстракта корня солодки уральской, отличающийся тем, что он содержит 12 - 38 мас.% (+)-r-ликорицидина формулы I.