СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ОЦЕНКИ БИОПТАТОВ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, предназначено для оценки биоптатов при диагностике заболеваний или для определения эффективности лечения, может быть использовано в ветеринарии.

Известен способ оценки биоптатов (Абрамов М.Г. Клиническая цитология. - М. , 1974, с.90-93), заключающийся и том, что взятые для исследования биоптаты подвергают макроскопическому осмотру, а затем подвергают фиксации, микротомии. Срезы окрашивают и проводят микроскопическую оценку биоптатов: составных частей их клеток, межклеточных структур, изучают признаки дегенерации, других патологических проявлений или регенераторные процессы, оценивают уровень окраски структур биоптата, распределение красителей, маркеров.

Недостатком известного способа является невозможность оценки живых клеток, поскольку биоптат подвергают фиксации, блокирующей жизнедеятельность его клеток, изменяющей некоторые структурные характеристики клеток, межклеточные и межтканевые отношения.

Известен способ прижизненной оценки биоптатов, взятый в качестве прототипа (Тимошин С.С. и др. Архив патологии, 1991, т.53, с.37-40), заключающийся в том, что биоптат инкубируют в течение 60 минут при температуре 37^oС в среде 199, содержащей ³Н-тимидин (5 мкКю/мл) с последующей промывкой, дегидратацией, химической фиксацией и заливкой биоптатов в парафин. В последующем готовят гистологические срезы и проводят авторадиографическое исследование с использованием микроскопии.

Недостатком известного способа является невозможность микроскопии живых клеток, длительное (60 минут) содержание биоптата в искусственной среде. При этом могут изменяться скорость, последовательность, выраженность процессов жизнедеятельности клеток. Кроме того, известный способ дает одностороннюю оценку, так как, характеризуя по тимидиновой метке синтез ДНК в ядрах части клеток, не позволяет оценить все имеющиеся в биоптате клетки. К другим недостаткам известного способа следует отнести необходимость иметь для исследования биоптатов специализированную лабораторию, отвечающую требованиям, предъявляемым при работе с радиоактивными изотопами, а также достаточно высокие трудоемкость и себестоимость исследования. Перечисленные недостатки ограничивают доступность этого вида исследования для практической медицины.

Сущность заявленного изобретения состоит в том, что согласно способу прижизненной оценки биоптатов, включающему инкубацию биоптата в искусственной среде и его микроскопическое исследование, биоптат подвергают ферментативной обработке, затем помещают в многовекторное знакопеременное электрическое поле и при микроскопическом исследовании определяют число клеток, реагирующих на электрическое поле, амплитуду движений ядер, цитолеммы, гранул цитоплазмы, а о жизнедеятельности клеток биоптата и уровне их реакций на электрическое поле судят по сохранению их движений или их частей не менее 10 минут.

Применение заявленного способа позволяет выявить состояние и реакции цитолеммы, ядра, ферментных систем клетки, уровень адаптации клеток. Способ не требует дорогостоящих устройств и методически не сложен. За короткое время: 10-20 мин можно получить большой объем информации о реакциях клеток на знакопеременное поле. Документальными отражениями реакций клеток является микрометрия, видеосъемка.

Способ позволяет решать диагностические задачи, определять эффективность лечения различных заболеваний за короткое время. Способ может быть использован как самостоятельный метод оценки биоптата или в комплексе с микроскопическим исследованием биоптата, подвергнутого фиксации.

Способ осуществляют следующим образом: взятый биоптат разрезают на более мелкие фрагменты, инкубируют при температуре 37^oС в течение 10-20 минут в среде, пригодной для жизнедеятельности клеток, например в среде 199. В инкубационную среду вводят низкие концентрации гидролитического фермента для разобщения клеток и межклеточных структур, а также витальный краситель для окраски ядер и цитоплазмы. После инкубации биоптаты отмывают в 3 порциях инкубационной среды без фермента, при необходимости подвергают частичной механической дезагрегации, например, тонкими иглами для отделения поверхностных клеток от основного пласта. Биоптаты с помощью пипеток, микропипеток, микрошприцов помещают в исследовательскую камеру, обеспечивающую многовекторные законопеременные электрические поля и создающую возможность микроскопии клеток и их реакций на биоэлектрические воздействия и на витальное окрашивание. Для микроскопического исследования используют увеличения в 200-600 раз, проводят микрометрию клеток, регистрируют амплитудные колебания ядер, цитолеммы в электрических полях, определяют процент клеток с выраженной биоэлектической активностью, проводят анализ уровня окрашивания и распределения витального красителя. По комплексу указанных показателей или отдельным из них составляют хронограммы реакций клеток, используя 5 минутные или 10 минутные интервалы. Длительность микроскопического исследования от 15 до 30 минут. О жизнедеятельности клеток биоптата и их реакциях судят по показателям биокинетики в нескольких временных интервалах.

Полученные результаты используют для уточнения диагноза заболевания, для оценки уровня адаптации клеток органа и организма, анализа дегенеративных процессов, определения эффективности лечения.

Пример 1
Больная Д., 25 лет.

Диагноз: Хронический гастрит в фазе обострения.

Изучены электрокинетические параметры биоптата в определенное время после получения (забора) биоптата.

Результаты измерений амплитуд движений эпителиоцитов биоптата (хронограмма), мкм:
1-я минута - 10±0,4
10-я минута - 8±0,3
20-я минута - 5±0,4
30-я минута - 3±0,5
На основании указанной хронограммы врач констатировал наличие биокинетики клеток во все изученные временные интервалы, отсутствие выраженных дегенеративных процессов.

Пример 2
Больной П., 39 лет.

Диагноз: Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки в фазе обострения.

Результаты измерения амплитуд эпителиоцитов (хронограмма), мкм:
1-я минута - 2±0,5
10-я минута - 0
20-я минута - 0
На основании хронограммы врач констатировал низкий уровень амплитуды в начале исследования, а затем (с 10-й минуты) полное отсутствие биокинетики клеток, и назначил с учетом полученного результата лечение с применением рибоксина - стимулятора метаболизма клеток.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, предназначено для оценки биоптатов при диагностике заболеваний, для определения эффективности лечения. Биоптат помещают в искусственную среду, подвергают прижизненной ферментальной обработке. Затем помещают в многовекторное знакопеременное электрическое поле и при микроскопическом исследовании определяют число клеток, реагирующих на электрическое поле, амплитуду движений ядер, цитолеммы, гранул цитоплазмы, а о жизнедеятельности клеток биоптата и уровне реакций на электрическое поле судят по сохранению их движений или их частей не менее 10 мин. Технический результат: способ позволяет выявить состояние и реакции цитолеммы, ядра, ферментных систем клетки, уровень адаптации клеток.

Способ прижизненной оценки биоптатов слизистых оболочек, включающий инкубацию биоптата в искусственной среде и его микроскопическое исследование, отличающийся тем, что биоптат подвергают ферментативной обработке, затем помещают в многовекторное знакопеременное электрическое поле и при микроскопическом исследовании определяют число клеток, реагирующих на электрическое поле, амплитуду движений ядер, цитолеммы, гранул цитоплазмы, а о жизнедеятельности клеток биоптата и уровне их реакций на электрическое поле судят по сохранению их движений или их частей не менее 10 мин.