СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА И СУХОЙ БИОПРЕПАРАТ Российский патент 2001 года по МПК A61K35/74 A61K35/76 C12N1/20 C12N7/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к сухим препаратам и способам их получения, и может быть использовано в пищевой промышленности, медицине, ветеринарии и смежных отраслях.

Известны сухие биопрепараты на основе живых микроорганизмов, в частности бактерий и вирусов, (Евр.пат. N 0097484, 1984 кл. A 23 C 1/05; авт.св. СССР N 1459239, 1986, кл. C 12 n 7/00; пат. США N 4289888, 1979, кл. A 23 C 9/123; Н. Г.Рыбальский и др. Вакцины - как объект изобретения, М., ВНИИГПЭ, 1988, с. 192-258). Препарат содержит клетки микроорганизмов, остатки питательной среды (ПС)-культуральной (КЖ) или алантоисной (АЖ) жидкости, жиры, белки и другие вспомогательные добавки. Технология включает в себя, как правило, подготовку раствора или взвеси биомассы микроорганизмов, введение в нее специальных добавок, высушивание и получение готового продукта. Условия процесса и состав композиций определяются особенностями используемых микроорганизмов и характером поставленной задачи.

Недостатками препаратов, содержащих живые микроорганизмы является, как правило, нестабильность при хранении и часто неудобная форма применения для человека (порошок или раствор).

Прототипом настоящего изобретения в отношении "вещества" является препарат из клеток Lactobacillus acidophilus с остатками ПС и добавками вспомогательных веществ, в частности защитной среды, содержащей мелассу, сахар, пектин и ряд других соединений (авт.св. СССР N 1227145, 1983, кл. A 23 C 9/123).

Недостатком прототипа является невозможность получения высокоактивного препарата в таблеточной форме из-за деактивации клеток микроорганизмов на стадиях высушивания на распылительной сушилке и прессования.

В настоящее время процессы таблетирования, как правило, включают в себя подготовку исходного сырья, введение в него вспомогательных веществ и его прессование (Технология лекарственных форм. Под ред. Л.А.Ивановой, М., Медицина, 1991, с. 132). Недостатком указанного способа являются большие потери активного начала при прессовании в случае лабильных микроорганизмов.

Прототипом заявляемого способа является технология получения тритурационных таблеток. Приготовление включает подготовку тонкодисперсных порошков активного начала и вспомогательных веществ, их смешение с растворителем (спиртовыми растворами), введение лактозы или сахарозы, втирание получившейся смеси в матрицу (таблеточную форму), сушка на воздухе и получение готовой формы (Технология лекарственных форм. Под ред. Л.А. Ивановой, М., Медицина, 1991, с. 201). Способ эффективен для нитроглицерина и т.п. лабильных химических соединений, но при переходе на биологические препараты становится неперспективным в связи с трудностями получения тонкодисперсных порошков при сохранении активности микроорганизмов, а также относительно невысокой производительностью.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось модификация технологии получения тритурационных таблеток для биопрепаратов и создание новых более активных и стабильных при хранении биологических препаратов, содержащих живые микроорганизмы.

Было найдено, что задача может быть решена при использовании в качестве исходного сырья водосодержащей смеси микроорганизмов с остатками питательной среды и вспомогательными веществами, введением в полученную смесь в качестве структурообразователей смеси полиглюкина и альгината натрия и проведения сушки помещенного в матрицы биоматериала методом лиофильной сушки при температуре от -10 до -55^oC и давлении 5-12 Па в течение по крайней мере 36 часов.

Создание нового способа оказалось возможным на базе установленного авторами свойства смеси полиглюкина и альгината натрия создавать в вязкой среде сетчатую пространственную полифункциональную структуру, в узлах которой, по-видимому, размещаются микрогранулы, представляющие собой микроорганизмы, защищенные от воздействия негативных факторов внешней среды защитной оболочкой из остатков питательной среды и вспомогательных веществ. Такая структура позволяет осуществлять относительно легкую дегидратацию полученной смеси, что и позволило использовать технологию лиофильной сушки.

Полученный в результате препарат имеет следующий состав конечного продукта (мас.%):
полиглюкин - 2-3
альгинат натрия - 5-6
вспомогательные вещества - 2-5
питательная среда, содержащая микроорганизмы - остальное
В качестве микроорганизмов он содержит бактерии, например штаммы Lactobacillus acidophilus, или вирусы, в частности вирус утиного гепатита.

В качестве вспомогательных веществ применяют подсластители, например мегасвит, красители, в частности сублимированный сок свеклы и другие вещества.

Введение больших или меньших количеств вспомогательных веществ возможно, по практически не нужно.

При выходе концентраций полиглюкина и альгината натрия за заявляемые параметры нарушается внутренняя структура препарата и либо не образуется таблетка, либо при сушке существенно возрастает гибель микроорганизмов.

Сущность изобретения иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. В ампулы с лиофилизованными эталонами производственных штаммов Lactobacillus acidophilus A-91 и H-91 вносят по 1 мл дистиллированной воды, после чего тщательно перемешивают и вносят раздельно в пробирки с обезжиренным молоком и выдерживают при 37±2^oC в течение 16-20 часов.

Посевной материал вводят в колбы по 100 мл гидролизатно-молочной среды, содержащей в панкреатическом гидролизате молока 0.2 г пептона, 0.06 г хлористого натрия, 0.002 г цистеина и 0.1 г лактозы и выдерживают при 37±2^oC в течение 16-20 часов.

Готовый посевной материал получают смешением отдельно выращенных культур таким образом, чтобы соотношение клеток отдельных штаммов было близко к 1:1 по данным оптической плотности при длине волны 600 нм.

Выращивание нативной культуры производится на среде, содержащей в 1 л панкреатического гидролизата молока 2 г пептона, 0.6 г хлористого натрия, 0.02 г цистеина, 4 г углекислого кальция и 1 г лактозы при 38±2^oC в течение 16-20 часов.

К культуральной жидкости добавляют 3-компонентную среду, состоящую из сахарозы, желатина и ОСМ в соотношении 10%:2%:4% в расчете на сухое вещество конечного продукта в виде взвеси в воде (содержание живых клеток составляло 3.0 млрд. КОЕ/г), разливали в емкости по 50 мл и вводили в каждую емкость 0.4 г альгината натрия, 0.2 г полиглюкина, 0.2 г сублимированного сока свеклы и 10 мг мегасвита.

Полученную смесь разливали по матричным стерильным алюминиевым формам диаметром 20 мм и высотой 7 мм с помощью дозатора по 2 куб.см в форму. Затем формы охлаждали до -10^oC и помещали в сублимационную камеру на 2.0-2.5 часа при -25-27^oC, после чего температура понижалась до -47-50^oC при одновременном снижении давления до 10-12 Па. Формы выдерживались в течение 33-43 часов при постепенном подъеме температуры до -25-27^oC и понижении давления до 5-6 Па. При достижении в камере указанных условий форма экспонируется еще 3 часа, после чего сбрасывается вакуум и осуществляется выгрузка таблеток из форм. Полученные таблетки имеют остаточную влажность не более 2.1%. Содержание полиглюкина - 2,4%, альгината натрия - 5,6%, сока свеклы - 2.6%, мегасвита - 0.15%. Титр сухого препарата - 1.8 млрд. КОЕ/г. (При использовании процедуры получения таблеток методом прессования титр составлял 0.5 млрд. КОЕ/г).

Пример 2. В условиях примера 1 проводилось таблетирование при введении в КЖ добавок до достижения конечной концентрации альгината натрия - 6%, полиглюкина - 2%, сублимированного сока свеклы - 1.9% и мегасвита - 0.1% КОЕ/г.

Исходная активность культуры - 3.5 млрд. КОЕ/г. Активность конечного препарата - 1.4 млрд.

Пример 3. В условиях примера 1 проводилось таблетирование при введении в КЖ добавок до достижения конечной концентрации альгината натрия - 5%, полиглюкина - 3%, сублимированного сока свеклы - 2.9%, мегасвита - 0.2%, желатины - 1.9%. Исходная активность культуры - 3.0 млрд. КОЕ/г. Активность конечного препарата - 1.5 млрд. КОЕ/г.

Пример 4. Полученные в результате сублимационного высушивания по примерам 1-3 таблетки были заложены на "ускоренное" хранение на 3 месяца при 40^oC по методике (Звягин И.В. и др. Методические рекомендации по разработке режимов замораживания-высушивания биологических препаратов. М., Главмикробиопром, 1981, 35 с.) Результаты испытаний приведены в таблице 1.

Пример 5. Производственный штамм "К-УНИИП" вируса гетатита уток разводили в физиологическом растворе 1:100 в объеме 0.2 куб. см и пассивировали на 8.5-9 дневных куриных эмбрионах. Эмбрионы инкубировали при 37.5^oC в течение 96 часов. Полученную вируссодержащую жидкость смешивали в соотношении 1:1 с раствором среды высушивания, состоящего из равных количеств пептона и сорбита, после чего добавляли 0.8% альгината натрия, 0.4% полиглюкина и 0.6% глюкозы.

Полученный материал разливали и подвергали дальнейшей обработке по методике примера 1 при температуре конденсатора -50^oC, рабочем давлении 8-10 Па, конечном давлении 3-5 Па в течение 48 часов.

Остаточная влажность образцов составила 2.2%. ЭЛД₅₀ вируса до высушивания составлял 10 в степени -4.47/куб.см, после высушивания - 10 в степени -4.35/куб. см. Степень инактивации 0.45 lg. В контроле - степень инактивации 0.75 lg.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой стабильности и эффективности технологии получения таблеток и активности получаемых на их основе препаратов.

Изобретение относится к биотехнологии. Может быть использовано в пищевой промышленности, медицине, ветеринарии и смежных отраслях. Получают таблеточный биопрепарат тритурационным способом. Активное начало получают культивированием микроорганизмов на питательной среде, вводят вспомогательные вещества, полиглюкин и альгинат натрия. Полученную смесь помещают в матрицу и подвергают сублимационному высушиванию при температуре от -10 до -50°С и давлении 4-12 Па в течение по крайней мере 48 ч. Полученный биопрепарат содержит живые микроорганизмы (бактерии или вирусы). Конечный продукт имеет следующий состав, мас.%: полиглюкин 2-3, альгинат натрия 5-6, вспомогательные вещества 2-5, питательная среда, содержащая микроорганизмы остальное. Препарат отличается высокой активностью и стабильностью при хранении. 2 с. и 6 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения биопрепарата тритурационным способом, включающий подготовку активного начала, его смешение с вспомогательными веществами, введение в смесь сахаров, помещение в матрицу, сушку и получение готовой формы, отличающийся тем, что активное начало получают культивированием микроорганизмов на питательной среде, вспомогательные вещества и сахара вводят непосредственно в смесь, получаемую в результате культивирования, в качестве сахаров вводят 2 - 3 мас.% в расчете на конечный продукт полиглюкина и 5 - 6 мас.% в расчете на конечный продукт альгината натрия, а вспомогательные вещества вводят в количестве 2 - 5 мас.% в расчете на конечный продукт, после чего полученную смесь помещают в матрицу и подвергают сублимационному высушиванию при температуре от -10 до -50^oC и давлении 4 - 12 Па в течение по крайней мере 48 ч. 2. Сухой биопрепарат, содержащий живые микроорганизмы, питательную среду и вспомогательные вещества, отличающийся тем, что он дополнительно содержит полиглюкин и альгинат натрия при следующем соотношении ингредиентов в конечном продукте, мас.%: полиглюкин - 2 - 3, альгинат натрия - 5 - 6, вспомогательные вещества 2 - 5, питательная среда, содержащая микроорганизмы, - остальное. 3. Сухой биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов он содержит бактерии. 4. Сухой биопрепарат по п.2 или 3, отличающийся тем, что в качестве бактерий он содержит клетки Lactobacillus acidophilus. 5. Сухой биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов он содержит вирусы. 6. Сухой биопрепарат по п.2 или 5, отличающийся тем, что в качестве вирусов он содержит вирус утиного гепатита. 7. Сухой биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что в качестве вспомогательных веществ он содержит сублимированный сок свеклы. 8. Сухой биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что в качестве вспомогательных веществ он содержит мегасвит.