ШТАММЫ Lactobacillus helveticus D75 и D76 И ПРЕПАРАТ, ИХ СОДЕРЖАЩИЙ Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 A61K35/747 C12R1/225 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к пробиотическим препаратам и бактериальным штаммам, используемым для их получения. Изобретение предназначено для использования в медицине, пищевой и молочной промышленности, сельском хозяйстве и смежных областях.

В настоящее время широко известны пробиотические препараты, под которыми понимают композиции, содержащие функциональный пищевой ингредиент в виде полезных для человека непатогенных и нетоксикогенных живых микроорганизмов, обеспечивающий при систематическом употреблении в пишу в виде препаратов или в составе пищевых продуктов благоприятное воздействие на организм человека в результате нормализации состава и(или) повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника (ГОСТ Р 52349-2005 «Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения».

В частности, широко применяют пробиотики в виде кисломолочных напитков. Так, кисломолочный напиток "Здоровье" получают на основе пастеризованной молочной сыворотки, ферментированный закваской, приготовленной из чистых рас молочнокислого стрептококка, болгарской, ацидофильной и сырных палочек (А.Г. Храмцов. Безотходная технология в молочной промышленности, М., Агропромиздат, 1989, с. 210). Недостатком напитка является низкая способность штаммов к адаптации в энтеральных средах хозяина и, как следствие, слабо выраженный лечебный эффект.

Известен сывороточный напи- ток "Эликсир", применяемый в практике в качестве препарата для повышения адаптационных возможностей организма при неблагоприятных условиях внешней среды, и используемые при его приготовлении штаммы микроорганизмов Lactobacillus acidophilus (штамм 20Т), Streptococcus thermophilus (штамм 24С), Lactobacillus casei (штамм 2), Lactobacillus helveticus (штамм 305-5). Для получения напитка используют закваску, содержащую указанные штаммы в соотношении 20-35 мас. %, 20-35 мас. %, 20-35 мас. % и 5-15 мас. % (RU 2064268, 1996). Недостатком напитка является сложная технология получения закваски и наличие антагонистических отношений между производственными штаммами.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемой группе изобретения является ранее разработанный с участием авторов настоящего изобретения препарат «ВИТАФЛОР»^® (RU 2160992, 2000). Сублимированный препарат содержит 1-5 млрд/г жизнеспособных клеток 2-х штаммов Lactobacillus acidophilus А-91 и Н-91 (при депонировании штаммы Д№75 и Д№76 соответственно), 0,5-2,5 мас. % желатина, 5-20 мас. % сахарозы, 3-5 мас. % обезжиренного молока, 2-8 мас. % воды и остатки культуральной жидкости. Для получения кисломолочного продукта препарат вносят в молоко или молочную смесь и выдерживают при повышенной температуре в течение 16-18 ч.

Препарат и кисломолочный продукт зарекомендовали себя эффективными средствами для профилактики и лечения кишечных инфекций, а также как перспективные иммуностимуляторы и адаптогены (RU 2342174, 2008; RU 2487543, 2013; RU 2419443, 2011; RU 2371190, 2009; RU 342174, 2008; RU 2278682, 2006). С учетом полной безопасности препарата перспективно его использование в виде пробиотика или пробиотического пищевого продукта (probiotic food) в экстремальных условиях (космический полет, длительное плавание, другие стрессовые условия).

Способ получения препарата предусматривает выращивание бактерий Lactobacillus acidophilus в гидролизатно-молочной питательной среде, содержащей 0.3-0.5 мас. % карбоната кальция, введение защитной среды, содержащей желатин, сахарозу, обезжиренное молоко, замораживание при температуре минус 25-30°C, сублимационное высушивание при температуре не выше минус 30°C и давлении 13-15 Па в течение 45-48 часов. Для получения кисломолочного напитка препарат растворяют в воде, вливают в молоко и выдерживают 12-18 часов при температуре 35-45°C.

Недостатком препарата является низкая стабильность кисломолочного напитка при хранении (не более 5 дней), проявляющаяся в быстром нарастании кислотности и степени синерезиса, обусловленных свойствами производственных штаммов препарата.

Задачей, решаемой авторами, являлось повышение стабильности кисломолочного напитка.

Технический результат достигался путем путем изменения штаммовой формулы препарата, именно, использования в составе препарата, получившего условное наименование «Витафлор-Н» штаммов Lactobacillus helveticus D75 и Lactobacillus helveticus D76, полученных в результате направленной селекции штаммов, входящих в препарат «Витафлор» в соотношении клеток от 1:1 до 1:3 (оптимально 1:2)..

Штаммы Lactobacillus helveticus D75 и D76 были охарактеризованы генетически и культурально-морфологически.

Исходные штаммы были выделены из кишечника здорового ребенка в 1991 году в Санкт-Петербурге. Являлись дикими типами. Фенотипическая идентификация диких типов была проведена в 1995 году по O. Kandler & Nor-bert Weiss. 1986. Regular, Nonsporing Grampositive Rods // In: P.H. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe, & J.G. Holt (ed.) Bergey's manual of Systematic bacteriology, Vol. 2. The Willians & Wilkins Co., Baltimore. По результатам фенотипической идентификации штаммы были отнесены к Lactobacillus acidophilus.

Фенотипическая идентификация селекционированных типов проведена в 2012 году по определителю Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Volume 3: The Firmicutes) Editors: Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N.R., Ludwig, W., Rainey, F.A., Schleifer, K.-H., Whitman, W. (Eds.), 2009. После проведения полного секвенирования геномов штаммы были представлены в NCBI как Lactobacillus helveticus D75 [GenBank: СР020029.1] и Lactobacillus helveticus D76 [GenBank: СР016827.1].

Штамм Lactobacillus helveticus D75 депонирован в связи с патентной процедурой под регистрационным номером RCAM04483 в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ).

Штаммы представляют собой грамположительные длинные тонкие палочки с закругленными краями, одиночные или в цепочках из 2-3 клеток.

Тип строения оболочки - фирмакутный. Спор не образуют. Неподвижны, лишены жгутиков и пилей. Размеры клеток варьируются в зависимости от условий культивирования, и особенно, от фазы роста.

Культурально-морфологические особенности штамма.

При выращивании в среде МРС-1 в течение 48 часов при температуре 37±1°C образует слабую муть и осадок; в полужидкой среде МРС-2 - висячие колонии в форме «гвоздиков».

В толще плотной среды МРС-4 образует белесые колонии сложной конфигурации диаметром 2-4 мм. На поверхности среды МРС-4 формирует округлые, часто - неправильной формы, слабовыпуклые бесцветные (со временем светло-бежевые) колонии диаметром 1,8-2,2 мм. Край колоний волнистый, поверхность - шероховатая, структура - складчато-зернистая, консистенция - мягкая, маслянистая. Колонии состоят из плотно уложенных пучков клеток, соединенных мостиками, окруженных тонкой поверхностной пленкой.

Рост по штриху - умеренный, четковидный.

Пигмент, диффундирующий в питательную среду, отсутствует.

Известные физиолого-биохимические свойства штамма.

Факультативный анаэроб, каталазоотрицательный, цитохромоксида-зоотрицательный. Нитраты не редуцирует, желатину не разжижает, эскулин не гидролизует, сероводород и индол не продуцирует. Гемолитической активностью не обладает.

Облигатный сахаролитик. Ферментирует лактозу, маннозу, галактозу, трегалозу, глюкозу, фруктозу. Слабо ферментирует сахарозу. Не ферментирует мелицитозу, рибозу, рамнозу, ксилозу, раффинозу, целлобиозу, мальтозу, арабинозу, сорбит, мелибиозу, маннит.Конечное значение pH в среде МРС-1 на ферментируемых сахарах 4,1-4,2.

Тип ферментации - гомоферментативный. Конечным продуктом метаболизма является DL-лактат.

Молоко с лакмусом восстанавливает без образования газа, интенсивно восстанавливает молоко с метиленовой синью.

При росте в молоке образует однородный слизистый сгусток. Максимальная титруемая кислотность при выращивании в молоке составляет не менее 230°T, в МРС-1 не менее 370°T.

Штамм характеризуется высоким уровнем и широким спектром антагонистической активности в отношении музейных референс-культур и клинических изолятов патогенной микрофлоры (S. flexneri, S. sonnei, P. vulgaris, P. mirabilis, E.coli, S. aureus, C. albicans и т.д.).

Температурный оптимум: (37±1)°C. Растет при 45°C. Не растет при 15°C. Оптимальное значение pH среды 5,8±0,2.

Условия культивирования:

Состав питательных сред (г/л).

МРС-1 (жидкая): Пептонизированное молоко (Peptonized milk, Himedia) - 40,0; ферментативный гидролизат казеина - 10,0; дрожжевой экстракт (BBL) - 8,0; глюкоза - 20,0; аммоний лимоннокислый - 2,0; натрий уксуснокислый плавленный - 5,0; L-цистина гидрохлорид - 0,1; К₂НРО₄ - 2,0; Mg₂SO₄ - 0,2; MnSO₄ - 0,02; твин-80 - 1,0 мл.

pH среды 6,4.

МРС-2 (полужидкая): Состав идентичен составу МРС-1, агар - 0,75.

МРС-4 (плотная): Состав идентичен составу МРС-1, агар - 20.

Температура и продолжительность выращивания: (37±1)°C. В среде МРС-1 - 18-24 часа, в средах МРС-2 и МРС-4 - 48 часов.

Условия хранения

В сублимированном виде в запаянных ампулах при температуре 6±2°C. Продолжительность хранения - 5 лет и более. Защитная среда при высушивании - сахароза 10%, желатина 1%, pH 7,0±0,2.

При периодическом пересеве (не более 5 пересевов из ампулы) продолжительность хранения - 1 месяц при температуре 6±2°C.

Результаты генотипической идентификации штамма D75

Технология секвенирования: PacBio

Метод секвенирования: SMRT PacBio RS II

Тип сборки: De novo assembly

Програмное обеспечение: SMRT Portal v.2_3_0

Метод сборки: HGAP (точная сборка)

Характеристика библиотеки прочтений:

1) средняя длина прочтений = 14321 п.о.;

2) N50 прочтений = 23981 п.о.;

3) количество прочтений = 92790;

4) общее число оснований = 1328881154;

Уровень покрытия генома прочтениями: х422,69

Уровень завершенности проекта: законченный геном

Характеристика генома: контиг = 1

Идентификационный номер генома в базе данных Genome (NCBI): СР020029.1

Идентификационный номер генома в базе данных BioSample (NCBI): SAMN05417795

Длина генома = 2053066 п.о.

Количество генов = 2092

Количество псевдогенов = 317

Количество белок-кодирующих генов = 1693

Количество генов рРНК=5, 5, 5 (5S, 16S, 23S)

Количество генов тРНК=64

Другие гены РНК=3

Соотношение Г/Ц=37%

Штамм Lactobacillus helveticus D76 депонирован в связи с патентной процедурой под регистрационным номером RCAM04484 в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ). Классификация: царство - Bacteria; тип - Firmicutes; класс - Bacilli; отряд - Lactobacillales; семейство - Lactobacillaceae; род - Lactobacillus; вид - Lactobacillus helveticus; штамм - D76.

Штаммы представляют собой грамположительные длинные тонкие палочки с закругленными краями, одиночные или в цепочках из 2-3 клеток.

Тип строения оболочки - фирмакутный. Спор не образуют. Неподвижны, лишены жгутиков и пилей. Размеры клеток варьируются в зависимости от условий культивирования, и особенно, от фазы роста.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Грамположительные длинные тонкие палочки с закругленными краями, одиночные или в цепочках из 2-3 клеток.

Тип строения оболочки - фирмакутный. Спор не образует. Неподвижен, лишен жгутиков и пилей. Размеры клеток варьируются в зависимости от условий культивирования, и особенно, от фазы роста. Средняя длина клеток составляет 4,0 мкм.

При выращивании в среде МРС-1 в течение 48 часов при температуре 37±1°C образует прозрачный надосадок и осадок; в полужидкой среде МРС-2

- висячие, округлые колонии.

В толще плотной среды МРС-4 образует белесые колонии сложной конфигурации диаметром 2-4 мм. На поверхности среды МРС-4 формирует округлые, часто - неправильной формы, слабовыпуклые бесцветные (со временем светло-бежевые) колонии диаметром 1,5-2,0 мм. Край колоний волнистый, поверхность - шероховатая, структура - складчато-зернистая, консистенция - мягкая, маслянистая. Колонии состоят из плотно уложенных пучков клеток, соединенных мостиками, окруженных тонкой поверхностной пленкой.

Рост по штриху - умеренный, четковидный.

Пигмент, диффундирующий в питательную среду, отсутствует.

Известные физиолого-биохимические свойства штамма.

Факультативный анаэроб, каталазоотрицательный, цитохромоксидазо-отрицательный. Нитраты не редуцирует, желатину не разжижает, эскулин не гидролизует, сероводород и индол не продуцирует. Гемолитической активностью не обладает.

Облигатный сахаролитик. Ферментирует лактозу, маннозу, галактозу, трегалозу, глюкозу, фруктозу. Слабо ферментирует сахарозу. Не ферментирует мелицитозу, рибозу, рамнозу, ксилозу, раффинозу, целлобиозу, мальтозу, арабинозу, сорбит, мелибиозу, маннит. Конечное значение pH в среде МРС-1 на ферментируемых сахарах 4,2-4,3.

Тип ферментации - гомоферментативный. Конечным продуктом метаболизма является DL-лактат.

Молоко с лакмусом восстанавливает без образования газа, интенсивно восстанавливает молоко с метиленовой синью.

При росте в молоке образует однородный неплотный сгусток. Максимальная титруемая кислотность при выращивании в молоке составляет не менее 220°T, в МРС-1 - не менее 330°T.

Штамм характеризуется высоким уровнем и широким спектром антагонистической активности в отношении музейных референс-культур и клинических изолятов патогенной микрофлоры (S. flexneri, S. sonnei, P. vulgaris, P. mirabilis, E. coli, S. aureus, C. albicans и т.д.).

Температурный оптимум: (37±1)°C. Растет при 45°C. Не растет при 15°C. Оптимальное значение pH среды 5,8±02.

Условия культивирования:

Состав питательных сред (г/л).

МРС-1 (жидкая): Пептонизированное молоко (Peptonized milk, Himedia) - 40,0; ферментативный гидролизат казеина - 10,0; дрожжевой экстракт (BBL) - 8,0; глюкоза - 20,0; аммоний лимоннокислый - 2,0; натрий уксуснокислый плавленный - 5,0; L-цистина гидрохлорид - 0,1; К₂НРО₄ - 2,0; Mg₂SO₄ - 0,2; MnSO₄ - 0,02; твин-80 - 1,0 мл. pH среды 6,4.

МРС-2 (полужидкая): Состав идентичен составу МРС-1, агар - 0,75.

МРС-4 (плотная): Состав идентичен составу МРС-1, агар - 20.

Температура и продолжительность выращивания: (37±1)°C. В среде МРС-1 - 18-24 часа, в средах МРС-2 и МРС-4 - 48 часов.

Условия хранения

В сублимированном виде в запаянных ампулах при температуре 6±2°C. Продолжительность хранения - 5 лет и более. Защитная среда при высушивании - сахароза 10%, желатина 1%, pH 7,0±0,2.

При периодическом пересеве (не более 5 пересевов из ампулы) продолжительность хранения - 1 месяц при температуре 6±2°C.

Результаты генотипической идентификации штамма D76

Технология секвенирования: PacBio

Метод секвенирования: SMRT PacBio RS II

Тип сборки: De novo assembly

Програмное обеспечение: SMRT Portal v.2_3_0

Метод сборки: HGAP (быстрая сборка)

Характеристика библиотеки прочтений:

1) средняя длина прочтений = 14125 п.о.;

2) N50 прочтений = 18990 п.о.;

3) количество прочтений = 77334;

4) общее число оснований = 1092367582

Уровень покрытия генома прочтениями: х375

Уровень завершенности проекта: законченный геном

Характеристика генома: контиг = 1

Идентификационный номер генома в базе данных Genome (NCBI): СР016827.1

Идентификационный номер генома в базе данных BioSample (NCBI): SAMN05417796

Длина генома = 2058319 п.о.

Количество генов = 2097

Количество псевдогенов = 321

Количество белок-кодирующих генов = 1694

Количество генов рРНК=5, 5, 5 (5S, 16S, 23 S)

Количество генов тРНК=64

Другие гены РНК=3

Соотношение Г/Ц=37%

Общие маркерные генетические области для штаммов D76 и D75, отличающие эти штаммы от других бактерий

1) Ген BCM45_RS08730 (BCM44_RS01540), кодирующий белок суперсемейства EpsG, локализован на хромосоме D76 от 1725915 п.о. до 1727033 п.о. (от 291350 п.о. до 292468 п.о. на хромосоме D75). Входит в блок из 3-х генов (целевой ген располагается между двумя соседними генами, кодирующими гипотетические белки, относящиеся к группе гликозилтрансфераз). Слева от генетического блока располагаются гены гликозилтрансферазы, гены синтеза экзополисахаридов и мультирезистентный MFS-транспортер. Справа располагается транспозаза.

2) Ген BCM45_RS08735 (BCM44_RS01545), кодирующий белок семейства гликозилтрансфераз, локализованный на хромосоме D76 от 1727041 п.о. до 1728057 п.о. (от 292476 п.о. до 293492 п.о. на хромосоме D75).

3) Ген BCM45_RS10040 (BCM44_RS02850), кодирующий гипотетический белок, локализованный на хромосоме D76 от 1990879 п.о. до 1991445 п.о. (от 556314 п.о. до 556880 п.о. на хромосоме D75). Продукт трансляции целевого гена частично схож с семейством белков гликозилтрансфераз. Ген расположен рядом с геном резолвазы (справа по прямой цепи) и двумя генами гипотетических белков по схеме: транспозаза - гипотетический белок - гипотетический белок - гипотетический белок - резолваза.

4) Ген BCM45_RS00535 (BCM44_RS03680), кодирующий АТФ-связывающий белок ABC-транспортера, локализован на хромосоме D76 от 98906 п.о. до 100492 п.о. (от 721280 п.о. до 722866 п.о. на хромосоме D75).

Нуклеотидные последовательности указанных генов для штамма D75 приведены в таблице 1, для штамма D76 - в таблице 2.

Области различия штаммов D75 и D76 приведены в таблице 3.

Пример 1. Способ получения препарата

Сублимированные моноштаммы активируют в обезжиренном молоке, содержащем факторы роста, в течение 16-18 часов при температуре 37±1°C (исходная величина засева составляет 10⁶ КОЕ/мл). Затем штаммы D75 и D76 выращивают при 37±1°C в течение 12 часов в среде МРС-1.

Активизированные штаммы вносят в обезжиренное молоко в соотношении 1:1 (образец 1); 1:2 (образец 2): и 1:3 (образец 3) и культивируют в течение 18 часов при 37±1°C. После этого доводят значение pH культуральной жидкости до 6,7±0,2, вносят защитную среду высушивания, разливают по емкостям и сублимируют.

Готовый препарат представляет собой пористую массу, содержащую на конец срока хранения не менее 1 млрд. клеток в 1 грамме.

Пример 2. Способ получения кисломолочного напитка

В емкость, содержащую 0,25 г препарата по примеру 1, вливают 10 мл кипяченой и охлажденной до комнатной температуры воды, взбалтывают и переносят полученную суспензию в 0,5 л кипяченого и охлажденного до 37±1°C молока. Заквашенное молоко ставят на 12-16 часов в теплое место.

Готовый напиток представляет собой хорошо сформированный слегка вязкий сгусток сметанообразной консистенции и содержит 0,5-1 млрд. клеток в 1 мл.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штамм Lactobacillus helveticus D75, депонированный в коллекции ФНБУ ВНИИСХМБ под номером RCAM04483, и штамм Lactobacillus helveticus D76, депонированный в коллекции ФНБУ ВНИИСХМБ под номером RCAM04484, предназначенные для использования в составе пробиотических препаратов. Предложен также пробиотический препарат, предназначенный для приготовления кисломолочного продукта и содержащий клетки бактерий штамма Lactobacillus helveticus D75 и Lactobacillus helveticus D76 в соотношении от 1:1 до 1:3. Группа изобретений обеспечивает сохранение свойств кисломолочного напитка при хранении в течение 20 суток. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 табл., 3 пр.

1. Штамм Lactobacillus helveticus D75, депонированный в коллекции ФНБУ ВНИИСХМБ под номером RCAM04483, предназначенный для использования в составе пробиотических препаратов.

2. Штамм Lactobacillus helveticus D76, депонированный в коллекции ФНБУ ВНИИСХМБ под номером RCAM04484, предназначенный для использования в составе пробиотических препаратов.

3. Пробиотический препарат, предназначенный для приготовления кисломолочного продукта, отличающийся тем, что он содержит клетки штаммов бактерий по пп. 1 и 2 в соотношении от 1:1 до 1:3.

4. Пробиотический препарат по п. 3, отличающийся тем, что он содержит клетки штаммов бактерий по пп. 1 и 2 в соотношении 1:2.