ШТАММ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS А-91, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ, ШТАММ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS H-91, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ, ЗАКВАСКА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ И ПРЕПАРАТ, СПОСОБСТВУЮЩИЙ АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ ВНЕШНИМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ Российский патент 2001 года по МПК A23C9/12 A23C9/123 C12N1/20 A61K35/74 C12N1/20 C12R1/23 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к штаммам для выработки кисломолочных напитков, их технологии получения в домашних или промышленных условиях и продуктам с лечебными свойствами на их основе. Изобретение может быть использовано в пищевой и молочной промышленности, медицине, сельском хозяйстве и смежных областях.

Известны бактериальные препараты медицинского назначения, такие как колибактерин, лактебактерин, бифидобактерин (Руководство по вакцинному и сывороточному делу. Под ред. акад. АМН СССУ И. Н. Бургасова, Москва, "Медицина", 1978) содержит одни или два штамма микроорганизмов, обладающих необходимыми медико-биологическими характеристиками.

Недостатком указанных препаратов является их низкая терапевтическая активность и невозможность использования для сквашивания молока.

Известно использование в качестве адаптагенов женьшеня, элеутерококка, облепихи, котовника, мумие, прополиса и препаратов из других природных источников (В.И.Машанов, А.А.Покровский. Пряно-ароматические растения, М., Агропромиздат, 1991; И.С.Соколова и др. Дикорастущие и культурные растения, М. , Медицина, 1990).

Недостатком указанных препаратов является ограниченность природных ресурсов, нестандартность сырья, наличие побочных эффектов.

В настоящее время широкое распространение получили кисломолочные напитки, сочетающие доступность сырья с относительной безопасностью и эффективностью.

В частности, известен напиток "Здоровье", получаемый на основе пастеризованной молочной сыворотки, сквашенной закваской, приготовленной из чистых рас молочнокислого стрептококка, болгарской, ацидофильной и сырных палочек (А. Г. Храмцов. Безотходная технология в молочной промышленности, М., Агропромиздат, 1989, с. 210).

Недостатком напитка является низкая адаптационная эффективность и отсутствие лечебного эффекта.

Для повышения качества препаратов на основе молочной сыворотки используются бактериальные добавки (закваски), улучшающие в основном питательные и вкусовые характеристики препаратов.

Известно в качестве заквасок использование смеси в соотношении 1:1 культур Str. cremons и Str. diacetitaetis (Авт. св. СССР N 581923, кл. A 23 C 9/12).

Недостатком закваски является низкая биологическая ценность из-за невысокой антагонистической активности указанных микроорганизмов по отношению к посторонней микрофлоре.

Известна более эффективная закваска на основе молочнокислых бактерий, содержащая равные части Saceharomyces cerevisiae, Lactobacillus fermenti и Lactobacillus helveticus (Авт. св. СССР N 1329745, кл. А 23 С 9/00).

Недостатком закваски является плохая совместимость микроорганизмов, вызывающая необходимость применения нескольких температурных режимов при их использовании, невысокие адаптационные свойства при введении в молочную сыворотку
Прототипом заявляемой группы изобретений является напиток "Эликсир", применяемый в практике в качестве препарата для повышения адаптационных возможностей организма при неблагоприятных условиях внешней среды, и используемые при его приготовлении штамм микроорганизмов и кисломолочная закваска (Патент РФ N 2064268, 1996, кл. А 23 С 9/12). Напиток получают на основе использования Lactobacillus acidophilus (L. Acidophilus) штамм 20T с добавками микроорганизмов Str. thermophilus штамм 24С, Lactobacillus casei штамм 2, Lactobacillus helveticus штамм 305-5. Для получения напитка используют бактериальную закваску, содержащую указанные культуры в соотношении 20-35 мас.%, 20-35 мас.%, 20-35 мас.% и 5-15 мас.%
Недостатком прототипа является сложная технология получения, взаимное угнетение штаммов различных бактериальных культур.

Задачей, стоявшей перед исследователями, являлось создание таких штаммов, которые, сохраняя эффективность прототипа, находились бы в более устойчивом равновесии и были бы близки по природе, что существенно упрощало бы подготовительные стадии процесса получения напитка, делая возможным изготовление напитка неспециалистами в домашнем хозяйстве, а также могли бы иметь самостоятельное значение в качестве концентрата, полезного для кишечника при дисбактериозе и при воздействии других негативных факторов.

Указанная задача решается созданием штаммов L. acidophllus А-91 и Н-91, кисломолочной закваски, содержащей эти штаммы, и препарата на ее основе.

Штамм Lactobacillus acidophllus А-91 был выделен из кишечника здорового ребенка в 1991 году в г. Ленинграде, является диким типом и был идентифицирован по определителю: O. Kandlor & N. Weiss 1986., Regular, Nonsporing Grampositive Rods // In; P.H Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe & J.G. Holt (ed.) Bergey, s manual of Systematic bacteriology, v.2, The Willians & Wilkin & Co., Baltumore.

Штамм депонирован в коллекции ВНИИ СХМБ N Д 75 от 16.07.1997.

Штамм характеризуется следующими признаками
Культурально-морфологические признаки
При выращивании на базовой среде для идентификации лактобацилл (N 1) в течение 48 часов при температуре 38-40^oC в бульоне образуется равномерная муть, в полужидкой среде - висячие, каплеобразные колонии, в толще агара - белесые колонии сложной конфигурации до 1,5-2,0 мм в диаметре. На поверхности твердой агаризованной среды формируются округлые, слабовыпуклые бесцветные (со временем светло-желтые) колонии диаметром 1,8- 2,2 мм. Край колоний - волнисто-лопастной, поверхность - шероховатая, структура - складчато-зернистая, консистенция - мягкая, масляная. Рост по штриху - умеренный, четковидный. Пигмент, диффундирующий в питательную среду, отсутствует.

Морфология клеток
Грамположительные длинные тонкие палочки с закругленными краями, одиночные или в цепочках из нескольких клеток. Спор не образуют. Неподвижны, лишены жгутиков и пилей. Тип строения оболочки - фирмакутный. Размеры клеток варьируются в зависимости от условий культивирования - и особенно - от фазы роста. Средняя длина клеток составляет 2,86 мкм.

Физиолого-биохимические признаки штамма
Факультативный анаэроб, каталазоотрицательный, цитохромоксидазоотрицательный. Нитраты не редуцирует, желатину не разжижает, эскулин гидролизирует слабо, сероводород и индол не продуцирует. O/F - тест на модифицированной среде Хью-Лейфсона положительный. Облигатный сахаролитик.

Сахаролитическая активность
Ферментирует лактозу, маннозу, галактозу, трегалозу, глюкозу, фруктозу. Слабо ферментирует сахарозу. Не ферментирует мелицитозу, рибозу, рамнозу, ксилозу, раффинозу, целлобиозу, мальтозу, арабинозу, сорбит, мелибиозу, маннит. Конечное значение pH на ферментируемых сахарах 4,1-4,3 в базовой среде N 1. Тип ферментации - гомоферментативный (конечным продуктом метаболизма является лактат). Молоко створаживает с образованием слизистого, неплотного сгустка, максимальная титрируемая кислотность которого составляет 250 Т, молоко с лакмусом восстанавливает без образования газа, интенсивно восстанавливает молоко с метиленовой синью.

Температурный оптимум 38-40^oC. Растет при 45^oC. Не растет при температуре 15^oC. Оптимальное значение pH среды 5,6-6,0. Чувствительность к антибиотикам
Штамм характеризуется высокой чувствительностью к левомицитину, оксациллину, карбенициллину, ампициллину, новобиоцину, эритромицину, средней чувствительностью к ристомицину, мономицину, гентамицину, канамицину, неомицину. Устойчив к полимиксину и 5-НОК.

Адгезивные свойства
Высокоадгезивный штамм. Индекс адгезивности на перевиваемых клеточных культурах НЕР-2 составляет 53,3/3,0 (в числителе - процент адгезированных клеток НЕР-2, в знаменателе - среднее число бактерий на клетке НЕР-2.

Способ, условия и состав сред для хранения штамма
Штамм хранят на стерильном обезжиренном молоке при 4^o с периодическим перевесом 1 раз в 20 дней либо в сублимированном виде в запаянных ампулах (длительность хранения 2 года и более) Защитная среда при высушивании - сахароза 10%, желатина 1%, при pH 7,0+0,2.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма
Штамм выращивается при 38-40^o в базовой среде N 1 или на посевной среде N 2.

Состав базовой среды N 1 (МРС), г в 1 л:
ферментативный гидролизат казеина - 10
дрожжевой экстракт - 5
мясной экстракт - 10
глюкоза - 20
аммоний лимоннокислый, двузамещенный - 2
натрий уксуснокислый - 5
MgSO₄ • 7H₂O - 0,5
MgSO₄ • 4H₂O - 0,5
Tween-80 - 1,0
pH доводят до 6,2 - 6,4 и стерилизуют 15 минут при 121^oC. Для получения твердой среды вводят 15 г агара.

Посевная среда N 2, г/л:
Кислотный гидролизат казеина - 10
дрожжевой экстракт - 5
глюкоза - 10
Na₂HPO₄ • H₂O - 1,75
KCl - 3
натрий уксуснокислый - 10
MgSO₄ • 7H₂O - 0,2
MgSO₄ • 4H₂O - 0,016
pH доводят до 6,7 и стерилизуют 15 минут при 121^oC.

Штамм Lactobacillus acidophilus Н-91 был выделен из кишечника здорового ребенка в 1991 году в г. Ленинграде, является диким типом. Идентифицирован по определителю: O.Kandlor & N. Weiss 1986., Regular, Nonsporing Grampositive Rods // In; P. H Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe & J.G. Holt (ed.) Bergey, s manual of Systematic bacteriology, v.2, The Willians & Wilkin & Co., Baltumore.

Штамм депонирован в коллекции ВНИИ СХМБ N Д 76 от 16.07.1997.

Штамм характеризуется следующими признаками
Культурально-морфологические признаки
При выращивании на базовой среде для идентификации лактобацилл (N 1) в течение 48 часов при температуре 38-40^oC в бульоне образуется равномерная муть, в полужидкой среде - висячие, каплеобразные колонии, в толще агара - белесые колонии сложной конфигурации до 2-4 мм в диаметре. На поверхности твердой агаризованной среды формируются округлые, слабовыпуклые бесцветные (со временем светло-желтые) колонии диаметром 1,5-2,0 мм. Край колоний волнистый, поверхность - шероховатая, структура - складчато-зернистая, консистенция - мягкая, масляная. Рост по штриху - умеренный, четко видный. Пигмент, диффундирующий в питательную среду, отсутствует.

Морфология клеток
Грамположительные длинные тонкие палочки с закругленными краями, одиночные или в цепочках по 2-4. Спор не образуют. Неподвижны, лишены жгутиков и пилей. Тип строения оболочки - фирмакутный. Размеры клеток варьируют в зависимости от условий культивирования - и особенно - от фазы роста. Средняя длина клеток составляет 4,0 мкм.

Физиолого-биохимические признаки штамма
Факультативный анаэроб, каталазоотрицательный, цитохромоксидазо-отрицательный. Нитраты не редуцирует, желатину не разжижает, эскулин не гидролизирует, сероводород и индол не продуцирует. O/F-тест на модифицированной среде Хью-Лейфсона положительный. Облигатный сахаролитик.

Сахаролитическая активность
Ферментирует лактозу, маннозу, галактозу, трегалозу, глюкозу, фруктозу. Слабо ферментирует сахарозу. Не ферментирует мелицитозу, рибозу, рамнозу, ксилозу, раффинозу, целлобиозу, мальтозу, арабинозу, сорбит, мелибиозу, маннит. Конечное значение pH на ферментируемых сахарах 4,1-4,3 в базовой среде N 1. Тип ферментации - гомоферментативный (конечным продуктом метаболизма является лактат).

Молоко отвораживает с образованием молочной кислоты. Характер сгустка - колотый, неплотный. Максимальная титрируемая кислотность составляет 190-200 Т. Продолжительность свертывания молока при внесении 3% закваски - 6 часов. Молоко с лакмусом восстанавливает без образования газа, интенсивно восстанавливает молоко с метиленовой синью.

Температурный оптимум 38-40^oC. Растет при 45^oC. Не растет при температуре 15^oC. Оптимальное значение pH среды 5,6-6.0.

Чувствительность к антибиотикам
Штамм характеризуется высокой чувствительностью к левомицитину, оксациллину, карбенициллину, ампициллину, новобиоцину, эритромицину, средней чувствительностью к ристомицину, мономицину, гентамицину, канамицину, неомицину. Устойчив к полимиксину и 5-НОК, налидиксовой кислоте, колимицину.

Адгезивные свойства
Сравнительно низкоадгезивный штамм. Индекс адгезивности на перевиваемых клеточных культурах НЕР-2 составляет 6,5/1,5 (в числителе - процент адгезированных клеток НЕР-2, в знаменателе - среднее число бактерий на клетке НЕР-2).

Способ, условия и состав сред для размножения штамма
Штамм выращивается при 38-40^oC в базовой среде N 1 или на посевной среде N 2.

Состав базовой среды N 1 (МРС), г в 1 л:
ферментативный гидролизат казеина - 10
дрожжевой экстракт - 5
мясной экстракт - 10
глюкоза - 20
аммоний лимоннокислый, двузамещенный - 2
натрий уксуснокислый - 5
MgSO₄ • 7H₂O - 0,5
MgSO₄ • 4H₂O - 0,5
Tween-80 - 1,0
pH доводят до 6,2 - 6,4 и стерилизуют 15 минут при 121^oC. Для получения твердой среды вводят 15 г агара.

Посевная среда N 2, г/л:
кислотный гидролизат казеина - 10
дрожжевой экстракт - 5
глюкоза - 10
Na₂HPO₄ • H₂O - 1,75
KCl - 3
натрий уксуснокислый - 10
MgSO₄ • 7H₂O - 0,2
MgSO₄ • 4H₂O - 0,016
pH доводят до 6,7 и стерилизуют 15 минут при 121^oC.

Как видно из вышеизложенного, указанные штаммы весьма схожи между собой по широкому спектру характеристик.

Основным отличием штаммов являются адгезивные и антагонистические свойства (штамм А-91 - высокоадгезивный, обладает средней антагонистической активностью, штамм Н-91 - среднеадгезивный, антагонистическая активность высокая), принадлежность к слизистой (А-91) и неслизистой (Н-91) расам ацидофильных палочек; характер роста в жидких средах (А-91 - инокулят независимый, Н-91 - инокулят зависимый)
Общим положительным эффектом обоих штаммов является способность образовывать совместно устойчивую симбиотическую систему, характеризующуюся синтрофным и синергетическим типом взаимоотношений и способную оказывать нормализующее воздействие на организм человека, подвергнутого воздействию негативных внешних факторов.

Указанная система существует при соотношении штаммов А-91 к Н-91 от 1:4 до 4:1, сохраняя указанные свойства, хотя лучшие результаты достигаются при соотношении микроорганизмов 2:1, что позволило использовать смеси штаммов в указанном соотношении в качестве закваски и препарата на ее основе.

Основные сравнительные свойства штаммов и их смеси в соотношении микроорганизмов 2:1 приведены в таблице 1.

Для оценки возможности создания препарата на основе полученной биокультуры было проведено исследование антагонистической активности различных смесей штаммов в отношении референс-штаммов, в качестве которых использовали патогенные и условно-патогенные штаммы из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасовича, рекомендованные для исследований производственных штаммов эубиотиков на соответствие требований фармакопейных статей.

Проведенные эксперименты показали, что полученная симбиотическая культура существенно превышает по своей эффективности отдельные микроорганизмы и вызывает полное угнетение роста E.coli 0157, Sh.Flexneri 331, Sh. Flexneri 170, Sh. Sonnae 5063, Pr. Vulgaris 177, St. aureus 209 (таблица 2).

Как упоминалось выше, на основе симбиотической смеси была создана ацидофильная закваска, содержащая наряду с остатками питательной среды штаммы А-91 и Н-91 в соотношении от 1:4 до 4:1 при общем содержании микроорганизмов в закваске 1•10⁹-1•10¹⁰ клеток на грамм, которая наряду с вышеуказанными функциями может выполнять одновременно функции препарата, способствующего адаптации организма к неблагоприятным внешним воздействиям. Испытания полученной закваски показали ее полную безвредность при пероральном введении в организм.

На ее получение Центром Госсанэпиднадзора МСЧ-24 С-Петербурга выдан гигиенический сертификат N 7-97 от 10.02.97. Полученная закваска может быть использована для получения молочного напитка в жидком виде или подвергнута лиофилизации и прессованию с целью дальнейшего использования в виде таблеток.

Полученные таблетки имеют белый или желтоватый цвет с характерным кисломолочным запахом и вкусом
При растворении в воде таблетка образует гомогенную взвесь. При разведении 0,85% раствором хлорида натрия pH раствора составляет 45-55. Активность кислотообразования закваски - не менее 200 Т.

Закваска содержит не менее 5 млрд живых клеток на г и может сохранять свои свойства в течение года при хранении в сухом темном месте при 2-8^oC. При этом к концу этого срока в 1 г закваске содержание жизнеспособных бактерий должно быть не менее 3 млрд клеток.

Пример 1. Сублимированные моноштаммы активизируют в обезжиренном молоке, содержащем факторы роста, в течение 16-18 часов при температуре 37-40^oC (исходная величина засева составляет 10⁶ КОЕ/мл). Далее штаммы А-91 и Н-91 выращивали при 38-40^oC в течение 12 часов на посевной среде N 2.

pH доводят до 6,7 и стерилизуют 15 минут при 121^oC, после чего культуральные жидкости смешивают, добиваясь соотношения клеток штаммов А-91 к Н-91 близким к 2: 1 при общем содержании живых клеток в смеси в зависимости от стоящей задачи от 1 до 5 млрд. Препарат с более низким содержанием клеток лиофилизируют, получая порошок, содержащий около 10 млрд клеток на г.

При необходимости получения жидкой закваски в емкость, содержащую 5 г порошка вливают 10 мл кипяченой и охлажденной до комнатной температуры воды, взбалтывают и вливают в 0,5 л кипяченого и охлажденного до 30-40^oC молока. Заквашенное молоко ставят на 8-12 часов в теплое место. Полученная закваска представляет собой хорошо сформированный сгусток, напоминающий сметану и содержит 5-8 млрд клеток на мл. Закваску следует хранить в холодильнике. Можно использовать в течение 20 дней.

Для получения на ее основе кисломолочного напитка молоко кипятят, остужают до температуры 30-40^oC и вносят в него полученную вышеописанным образом закваску из расчета 1 столовая ложка на 0,5 л молока. Заквашенное молоко ставят в теплое место при 30-40^oC на 8-12 часов. Полученный кисломолочный продукт готов для употребления.

В диетических целях и для профилактики полученный кисломолочный продукт может употребляться в течение всего дня. При применении в лечебных целях его целесообразно употреблять натощак утром и вечером перед сном. Рекомендуемая разовая доза в этом случае для взрослых - 1 стакан, для детей - от 1 столовой ложки до 1 стакана в зависимости от возраста.

Пример 2. Сухой препарат, содержащий ацидофильную закваску, полученный в условиях примера 1, испытывался в Санкт-Петербургской медицинской академии после-дипломного образования на базе гастро- энтерологического и гинекологического отделений. Под наблюдением находился 31 человек (20 человек с хроническим энтероколитом, 5 человек с гипермоторной дискинезией толстой кишки, 6 человек с нарушениями нормальной микрофлоры влагалища). Препарат давали по 2 таблетки 2 раза в день утром и вечером в течение 3-5 дней. Полученные результаты показали у всех больных улучшение психоэмоционального состояния, уменьшение астенических явлений, чувства вздутия и урчания в животе, нормализацию стула, уменьшение болевых ощущений.

Пример 3. На базе Военно-медицинской академии проводились испытания по возможности применения препарата для борьбы с укачиванием и для повышения адаптации организма к условиям высокогорья (подъем от уровня моря до высоты 2500 м и обратно в течение 2 часов в условиях барокамеры).

Испытания, проведенные на группе из 20 добровольцев показали, что число укачивающихся при условиях, имитирующих 5-балльный шторм при предварительном - за 15- 20 мин до начала испытаний - приеме 2 таблеток препарата, полученного по методике примера 1, сократилось с 60 до 25%.

При использовании барокамеры среднее время нормализации основных параметров сердечно-сосудистой (ССС) и иммунной (ИС) системы при предварительном приеме 4 таблеток препарата сократилось по ССС с 36 до 27 часов, по ИС - с 48 до 32 часов, что делает препарат перспективным для дальнейшей проработки в данном направлении.

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в пищевой и молочной промышленности, медицине, сельском хозяйстве. Штамм Lactobacillus acidophilus А-91, депонированный в коллекции ВНИИ СХМБ Д-75 от 16.07.1997, и штамм Lactobacillus acidophilus Н-91, депонированный в коллекции ВНИИ СХМБ Д-76 от 16.07.1997, образуют совместно симбиотическую систему, характеризующуюся синтрофным синергетическим типом взаимоотношений, используют для приготовления кисломолочных продуктов. Закваска на их основе содержит смесь штаммов Lactobacillus acidophilus А-91 и Н-91 в соотношении микроорганизмов от 4 : 1 до 1 : 4. Препарат "Витафлор", способствующий адаптации организма к неблагоприятным внешним воздействиям, на основе ацидофильных бактерий содержит смесь штаммов Lactobacillus acidophilus A-9l и Н-91 в соотношении микроорганизмов от 4 : 1 до 1 : 4 при содержании живых клеток от 1 до 10 млрд клеток на 1 г препарата. Препарат показал высокую эффективность при ряде заболеваний, а также для адаптации организма к неблагоприятным условиям внешней среды. 4 с. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Штамм бактерий Lactobacillus acidophilus A-91 ВНИИ СХМБ Д-75 симбионт штамма Lactobacillus acidophilus Н-91, используемый для приготовления кисломолочных продуктов. 2. Штамм бактерий Lactobacillus acidophilus Н-91 ВНИИ СХМБ Д-76 симбионт штамма Lactobacillus acidophilus А-91, используемый для приготовления кисломолочных продуктов. 3. Закваска для приготовления кисломолочных продуктов на основе бактерий Lactobacillus acidophilus, отличающаяся тем, что она содержит смесь штаммов Lactobacillus acidophilus А-91 и Н-91 в соотношении микроорганизмов от 4 : 1 до 1 : 4. 4. Закваска по п. 3, отличающаяся тем, что соотношение штаммов А-91 к Н-91 составляет 1 : 1. 5. Препарат, способствующий адаптации организма к неблагоприятным внешним воздействиям на основе ацидофильных бактерий, отличающийся тем, что в качестве ацидофильных бактерий он содержит смесь штаммов Lactobacillus acidophilus А-91 и Н-91 в соотношении микроорганизмов от 4 : 1 до 1 : 4 при содержании живых клеток от 1 до 10 млрд клеток на 1 г препарата.