СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА УТЯТ Российский патент 1995 года по МПК A61K39/29 C12N7/00 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам изготовления вакцины против вирусного гепатита утят.

Вирусный гепатит высококонтагиозная остропротекающая болезнь молодняка до 30-дневного возраста со смертностью, достигающей 100% Взрослые утки переболевают бессимптомно, но пожизненно остаются вирусоносителями.

Медикаментозного лечения вирусного гепатита нет, поэтому ведущее место в борьбе с этой болезнью отводится средствам специфической профилактики.

Известен способ изготовления вакцины против вирусного гепатита утят, включающий получение вируссодержащего материала из штамма вируса гепатита утят "К-УНИИП" на куриных эмбрионах, добавление антибиотиков, расфасовку готового препарата [1]
Известен также способ изготовления вакцины против вирусного гепатита утят, включающий получение вируссодержащего материала из штамма вируса гепатита утят "ЗМ" на утиных эмбрионах, добавление антибиотиков, проверку и расфасовку готового препарата [2]
Недостатком известных способов является то, что в процессе получения вакцины часто происходит контаминация вируссодержащего материала грибковой и бактериальной флорой, что сказывается на ее качестве и сроках сохранности биологической активности. Кроме того, на их производство требуются значительные материальные средства.

Целью изобретения является повышение выхода вируссодержащего материала, удешевление целевого продукта с повышением его качества.

Для этого, в качестве вакцинного штамма используют штамм "ВГНКИ-К" вируса гепатита утят, который выращивают в суспензии тканевых эксплантатов утиного эмбриона 11-12-дневного возраста в течение 72 ч на роллерной или спиннерной установке при скорости вращения 10-12 об/мин. Полученный вируссодержащий материал перед расфасовкой смешивают с сорбит-желатозным стабилизатором в соотношении 1:3, а затем лиофильно высушивают.

Вакционный штамм вируса гепатита утят "ВГНКИ-К" получен в результате адаптации эмбрионального штамма вируса гепатита утят "ВГНКИ Эм-У" к монослойной культуре и суспензии тканевых эксплантатов утиного эмбриона.

Штамм вирусного гепатита утят депонирован в коллекции вирусов Всесоюзного научно-исследовательского института ветеринарных препаратов, имеет регистрационный номер "ВГНКИ-К-ДЕП".

Штамму вируса гепатита утят "ВГНКИ-К" присущи следующие признаки и свойства:
Морфологические признаки. Вирусные частицы округлой формы величиной 20-40 нм.

Культуральный свойства. Штамм вируса гепатита утят "ВГНКИ-К" размножается в суспензии эксплантатов и монослойной культуре фибробластов утиного эмбриона, накопление вируса составляет не менее 10^5,0 ЭЛД 50/0,2 см³. В монослойной культуре клеток вирус на 2-3 сут после заражения вызывает слабые цитопатические изменения в виде очаговых округлений клеток, дегенерацию и отслоение от поверхности стекла не менее 10% клеток.

Антигенные свойства. Штамм вируса гепатита утят "ВГНКИ-К" родственен штаммам вируса гепатита, выделенным от уток. На введение штамма в организме образуются вируснейтрализующие антитела в титрах 1:4-1:128.

Безвредность. Штамм "ВГНКИ-К" безвреден для утят и взрослых уток и при внутримышечном введении в дозе 1 ˙ 10⁵ ЭЛД 50/0,2 см³ не вызывает изменений в клиническом состоянии птицы.

Патогенность. При заражении 11-12-дневных эмбрионов уток штамм "ВГНКИ-К" вызывает их гибель через 48-72 ч.

Стабильность биологических свойств прослежена до 25 пассажа.

Иммуногенные свойства. Введение вакцины из штамма "ВГНКИ-К" против вирусного гепатита утят суточным утятам в разведении 1:10 и взрослым уткам в нативном состоянии индуцирует у 100% поголовья образование стойкого и напряженного иммунитета.

П р и м е р 1. Получают 10, 11, 12, 14, 19 дневные утиные эмбрионы. После дезинфекции скорлупы эмбрионов асептически извлекают тушки (удаляют глаза, клюв, лапки) и механически измельчают до получения суспензии, которую переносят в стерильные емкости с культуральной средой (0,5% раствор ГЛА + среда Игла + среда 199 + сыворотка крови крупного рогатого скота). Суспензию эксплантатов заражают вакцинным штаммом вируса гепатита утят "ВГНКИ-К" в дозе 1-5 лог. ЭЛД50/0,2 см³. После адсорбции вируса в течение 1 ч при комнатной температуре добавляют поддерживающую питательную среду. Получение вируссодержащего материала проводят на роллейной или спиннерной установке со скоростью вращения 5, 10, 12 и 15 об/мин в течение 24, 48, 72 и 96 ч. Накопление вируса в эксплантатах определяют титрованием на утиных эмбрионах 11-12-дневного возраста путем заражения на ХАО. Данные по накоплению титра вакцинного штамма вируса гепатита в зависимости от возраста утиных эмбрионов, использованных для получения эксплантатов, представлены в табл.1.

Из табл. 1 видно, что максимальное накопление вируса в титрах 5,99-5,50 логарифмов ЭЛД 50/02, см³ происходит при использовании для получения эксплантатов 11-12-дневных утиных эмбрионов.

В табл.2 представлены сведения по влиянию дозы, используемой для заражения эксплантатов, на накопление в них вируса гепатита.

Наибольшее накопление вируса, как следует из табл.2, обеспечивает заражающая доза 4 лог. ЭЛД 50/02, см³.

В табл.3 представлены сведения по влиянию частоты вращения роллейной установки на накопление вируса гепатита утят.

Как следует из табл.3, при режиме вращения 10-12 об/мин вирус накапливается до уровня 5,75-5,99 лог. ЭЛД 50/0,2 см³.

Результаты по накоплению вируса гепатита в зависимости от времени культивирования представлены в табл.4.

Данные табл.4 показывают, что наиболее высокое содержание вируса достигается при культивировании инфицированных эксплантатов в течение 72 ч.

П р и м е р 2. Полученный по примеру 1 вируссодержащий материал вакцинного штамма с титром 6,25 лог. ЭЛД 50/0,2 см³ смешивают перед расфасовкой со стабилизаторами, в качестве которых используют обезжиренное молоко; медицинский сорбит; смесь 50%-ного раствора сорбита и 25%-ного раствора желатозы, взятые в соотношении 1:2; и пептон. Полученный биопрепарат, расфасованный в пенициллиновые флаконы в объеме 2 см³, лиофильно высушивают. Данные по влиянию протективного действия стабилизаторов на титр вируса гепатита после высушивания представлены в табл.5.

Из табл.5 следует, что лучшим для изготовления сухого биопрепарата является сорбит-желатозный стабилизатор. Активность вируса после сушки при этом стабилизаторе снижается не более чем на 0,6 лог. в то время как другие приводят к снижению его на 1,5-3,2 лог. ЭЛД 50/0,2 см³.

Готовая вакцина представляет собой сухую мелкопористую массу светло-серого цвета в виде таблетки, не рассыпающейся при встряхивании. Биологическая активность не ниже 10^5,0 ЭЛД 50/0,2 см³.

П р и м е р 3. Изучают влияние срока хранения вакцины на сохранность ее биологической активности. Вакцину хранят в течение 18 мес в условиях бытового холодильника при 6-10^оС.

Титр вируса определяют титрованием на утиных эмбрионах через каждые 3 мес.

Данные по влиянию срока хранения вакцины на ее биологические свойства представлены в табл.6.

Из табл. 6 видно, что вакцина против вирусного гепатита утят сохраняет без изменения биологическую активность в течение 12 мес.

П р и м е р 4. Изучают иммуногенные свойства сухой вакцины против вирусного гепатита утят из штамма "ВГНКИ-К" на 1-10-дневных утятах.

Для определения иммуногенности лиофилизированный препарат разводят 1:10 растворителем (физраствором рН 6-6,5) и вводят внутримышечно 1-10-дневным утятам в область бедра в объеме 0,5 см³. Через 7 сут после прививки всех вакцинированных и 10 невакционированных (контрольных) утят заражают внутримышечно вирулентным штаммом "Орех" вируса гепатита утят в дозе 1000 утиных ЛД50.

Иммуногенные свойства вирусвакцины против гепатита утят из штамма "ВГНКИ-К" проверяют в сравнении с вакцинами биофабричного производства из штаммов "ЗМ(УНИИП)" и "К-УНИИП". Указанные вакцины применяют согласно "Наставлению по применению". Данные по сравнительной проверке иммуногенных свойств вакцин против вирусного гепатита утят представлены в табл.7.

Из табл. 7 видно, что культуральная вакцина против вирусного гепатита утят из штамма "ВГНКИ-К" обладает высокой иммуногеностью и по сравнению с известными вакцинами сохраняет высокую иммуногенность в течение рекомендуемого срока хранения 12 мес.

Способ приготовления культуральной вакцины более современен и технологичен в сравнении с эмбриональной вакциной.

Использование в биологической промышленности данного способа изготовления вакцины против гепатита утят из штамма "ВГНКИ-К" позволит увеличить выход вируссодержащего материала более чем в 20 раз, что полностью оправдывает материальные затраты на ее производство.

Использование культуральной вакцины против вирусного гепатита утят из штамма "ВГНКИ-К" в ветеринарной практике позволит повысить эффективность ветеринарных мероприятий с указанным заболеванием.

Использование: ветеринарная вирусология. Сущность изобретения: штамм вируса гепатита утят "ВГНКИ-К-ДЕП", выращивают в суспензии тканевых эксплантатов 11-12-дневных утиных эмбрионов в течение 72 ч на роллерной или спиннерной установке. Полученный вируссодержащий материал перед расфасовкой смешивают с сорбит-желатозным стабилизатором в соотношении 1:3, а затем лиофильно высушивают. Данный способ изготовления вакцины позволит увеличить выход вируссодержащего материала более чем в 20 раз, а также даст возможность повысить качество вакцины с сохранением высокой иммуногенности в течение рекомендуемого срока хранения - 12 мес. 7 табл.

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА УТЯТ, включающий получение вируссодержащего материала из вакцинного штамма гепатита утят, проверку и расфасовку готового препарата, отличающийся тем, что из вакцинных штаммов используют штамм вируса гепатита утят ВГНКИ-К-ДЕП, а вируссодержащий материал получают культивированием штамма в суспензии тканевых эксплантатов утиного эмбриона 11 12-дневного возраста в течение 72 ч на роллерной или спиннерной установке при частоте вращения 10 12 мин^-1, вируссодержащий материал перед расфасовкой смешивают с сорбит-желатозным стабилизатором в соотношении 1 3, а после расфасовки лиофилизируют.