СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛЛАГЕНА Российский патент 2001 года по МПК G01N21/78 

Изобретение относится к аналитической химии и биологической химии, а именно к способам определения коллагена, и может быть использовано в практике контрольно-аналитических лабораторий химических и химико-фармацевтических предприятий, биохимических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения белков, в том числе и коллагена, по общему азоту путем обработки анализируемой пробы концентрированной серной кислотой в присутствии сульфата калия и красного оксида ртути (II), подщелачивания реакционной смеси гидроксидом натрия в присутствии тиосульфата натрия, отгонки выделяющегося аммиака, поглощения аммиака раствором серной кислоты с последующим титрованием раствором гидроксида натрия в присутствии смеси индикаторов метилового красного и метиленового синего до появления зеленого окрашивания [Полюдек-Фабини P. , Бейрих Т. Органический анализ.- Л.: Химия, 1981, с. 529-531; 253-255].

Способ малоселективен, трудоемок, характеризуется значительными затратами времени на его осуществление.

Известен способ определения коллагена по аминокислотным фрагментам, заключающийся в обработке анализируемой пробы раствором трихлоруксусной кислоты в условиях нагревания при 90^oC в течение 30 минут, разбавлении реакционной смеси водой, обработке сульфатом меди (II) в щелочной среде с последующей обработкой реактивом Фолина-Чиокальте, выдерживанием реакционной смеси в течение 30 минут и фотометрированием образующегося окрашенного раствора [Слуцкий Л.И., Шелекетина И.И. Количественное определение коллагена в легочной ткани //Вопросы медицинской химии. -1959. -Т. 5.- Вып. 6. -С. 466-468].

Способ малоселективен, характеризуется трудоемкостью, недостаточно высокой точностью.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемым результатам является способ определения коллагена по его аминокислотному фрагменту оксипролину путем обработки анализируемой пробы раствором хлорной кислоты в течение 4 часов в условиях нагревания (на водяной бане) при 100^oC, нейтрализации реакционной смеси гидроксидом натрия, прибавления пропанола-2 и раствора хлорамина Т в ацетат-цитратном буфере с последующей обработкой раствором парадиметиламинобензальдегида в смеси 57% раствора хлорной кислоты и пропанола-2, нагреванием в течение 25 минут при 60^oC и фотометрированием образующегося окрашенного раствора [Прошина Л.Я., Приваленко М.Н. Исследование фракционного состава коллагена в ткани печени // Вопросы медицинской химии. -1982. -Т. 28. -Вып. 1. -С. 115-119].

Способ характеризуется длительностью выполнения, трудоемкостью, недостаточной селективностью, относительно невысокой точностью.

Задачей настоящего изобретения является упрощение способа, повышение точности, селективности, сокращение продолжительности процесса определения.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что анализируемую пробу растворяют в воде в условиях нагревания при 42-44^oC в течение 2 часов, обрабатывают ацетоновым раствором тетрахлорпарахинона в присутствии 1,4-диоксана с последующим фотометрированием образующегося окрашенного раствора.

Способ осуществляется следующим образом: анализируемую пробу растворяют в воде в условиях нагревания при 42-44^oC в течение 2 часов, обрабатывают ацетоновым раствором тетрахлорпарахинона в присутствии 1,4-диоксана и образующийся окрашенный раствор фотометрируют.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1
Качественное определение коллагена
Около 5 мг коллагена растворяют в 5 мл воды в условиях нагревания при 42-44^oC в течение 2 часов. К 1 мл полученного раствора прибавляют 0,5 мл 0,4% раствора тетрахлорпарахинона в ацетоне и 3,5 мл 1,4-диоксана. В присутствии коллагена появляется фиолетовое окрашивание. Чувствительность реакции - 2,6 мкг/мл.

Пример 2
Количественное определение коллагена
Построение калибровочного графика
В ряд пробирок вносят 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0 мл 0,1% раствора коллагена и соответственно 0,8, 0,6, 0,4, 0,2 и 0 мл воды. В каждую пробирку прибавляют по 0,5 мл 0,4% раствора тетрахлорпарахинона в ацетоне и по 3,5 мл 1,4-диоксана. Содержимое пробирок перемешивают и через 10 минут фотометрируют образующиеся окрашенные растворы на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 547 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерение оптической плотности проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. По результатам измерений строят калибровочный график и рассчитывают его уравнение, которое в данном случае имеет вид:
Д = 0,00441•С - 0,02405,
где Д - оптическая плотность, С - концентрация коллагена в фотометрируемом растворе, мкг/мл.

Методика определения
Около 0,025 г коллагена, предварительно высушенного до постоянной массы в присутствии водоотнимающего средства (кристаллический гидроксид натрия) в эксикаторе при 20-22^oC (точная навеска), растворяют в 20 мл воды в мерной колбе вместимостью 25 мл в условиях нагревания при 42-44^oC в течение 2 часов. Полученный раствор охлаждают и доводят водой до глотки. 0,6 мл полученного раствора вносят в пробирку, прибавляют 0,4 мл воды и дальнейшие операции осуществляют в соответствии со схемой, описанной для построения калибровочного графика.

Количественное содержание коллагена определяют, исходя из величины оптической плотности, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску.

Результаты количественного определения коллагена представлены в таблице 1.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом значительно упрощает процесс определения, более чем в два раза сокращает его продолжительность (с 4 часов 45 минут до 2 часов 15 минут), характеризуется более высокой точностью (относительная ошибка среднего результата снижается в 5 раз) и селективностью (в отличие от прототипа позволяет избирательно проводить определение коллагена в присутствии ряда белков и аминокислот).

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 2.0

Изобретение относится к аналитической химии и биологической химии, а именно к способам определения коллагена, и может быть использовано в практике контрольно-аналитических лабораторий химических и химико-фармацевтических предприятий, биохимических лабораторий. Анализируемую пробу растворяют в воде в условиях нагревания при 42-44°С в течение 2 ч, обрабатывают ацетоновым раствором тетрахлорпарахинона в присутствии 1,4-диоксана, и образующийся окрашенный раствор фотометрируют. Техническим результатом является повышение точности, селективности и сокращение продолжительности процесса определения. 2 табл.

Способ определения коллагена путем растворения анализируемой пробы в воде при нагревании с последующей обработкой цветореагентом в присутствии органического растворителя и фотометрированием образующегося окрашенного раствора, отличающийся тем, что растворение анализируемой пробы в воде проводят при 42-44°С в течение 2 ч, в качестве цветореагента используют раствор тетрахлорпарахинона в ацетоне, а в качестве органического растворителя-1,4-диоксан.