Способ количественного определения энзимов гидролитического действия Советский патент 1976 года по МПК G01N21/24 

(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНЗИМОВ ГИДРОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

центраций SHsmvia в гомогенных средах, (таких, как сыворотка или экстракты тканей

К метоксипированным соединениям пре; почтительно добавлять буфер, обеспечиваю-. .щий поддержание оптимального или близкого к нему значения водородного показателя для данного энзима.Если нужно содействовать процессу солюбилизации соединения,, то можно также добавлять пропиленгликоль. Эту смесь смешивают с гомогенатом, содер жащим энзим, подлежащий определению, после чего дают энзиму обеспечивать гиде-. ролиз соединения.

После проведения гидролиза в течение определенного промежутка времени добав ляют денатурирующее соединение, такое как хлористоводородная или трихлоруксусная кислота, для прекращения гидролиза. После удаления осадка любого вида, который мо жет образоваться, добавляют средство, способное образовывать краситель с любым 4- метоксип.2 афтиламином, который имеется в наличии вследствие энзиматического гидролиза субстрата.

Типичными средствами для образования красителя служат прочный синий (тетра™ зотированный ди лЛ анизидин), прочный гарнет (диазотированный 4 Ог- гоидазо о. толуидин), прочный синий (диазотированны 4.-лминс 2,5-диэтоксибензинилид)и гекса зотированный парарозанилин.

YlociK образования .красителя определяют, концентрацию Красител: фотометрически посредством пропускания светового луча заданной интенсивности через смесь, согдержащую краситель, после чего измеряют интенсивность светового луча, прощедщего через смесь. Данную концентрацию энзима определяют путем сравнения со стандарт™ ной кривой, полученной путем проведения ряда аналогичных определений с известными концентрациями энзимов.

Пример, Подлежащую инкубированию смесь готовят, сливая 1,5 мл субстрат -буфера одного из типов, перечисленных

ниже, О,3 мл препарата ткани или сьто- ротки и 1,2 мл 0,85 н. солевого раство ра в пробирки.

Пробирки закрывают колпачком и инкубируют 2 час при 37°С на водяной бане,

После инкубирования снимают колпачки и прекращают реакцию с энзимом путем добавления 0,5 мл раствора трихлсруксусной кислоты, причем образующийся осадок удаляют центрифугированием,

В каждую пробирку вводят 1,0 мл водного раствора, в 1 мл которого содержите, ся 1 мг крастгеля прочного синего .

Затем пробирки .подвергают вибрационному воздействию в течение 15-30 сек,

после чего спустя 5 мин производят спектл рофотометрическое определение при 520 ммк по отношению к пустой пробе,. Ко личество высвободивщегося 4вметоксИ 2- нафтиламина отсчитывают по ранее приготовленной стандартной кривой, отградуиг рованной по 4-А1етокси™2 нафтиламину в присутствии рецептур, содержащих сыворотку или ткани,

В приведенном процессе можно использовать следующие субстрат-буферы.

Для определения общей активности ами нопентидазь: применяют лейцил-41 1етокс№,2-нафтиламид, 32,3 мг упомянутого соединения добавляют к 50 мп воды и сме шиванот с одинаковым объемом О, 2 М фосфного буфера, рН 7, О, для образования субстрат-буферного раствора.

Для определения активности дипепт& диламичопетидазь (степень активности П) найденной в лизо1.;ах клеток иитовидной желзы, применяют лизилаланйл1...4-метокси-2-. нафталамид, 43,4 , мг упомянутого соединения добавляют к 50 мл воды и смешивают с равным объемом О, 2 М натрий какодилатного буфера, рН 5,5, содержащего Ои.5 мл хлористоводородной соли меркаптоэтиламина в виде 1,О М раствора, для образования субстрат-буферного раствора,

Для определения активности дипептиди- ламинопейтидазы (степень активности 1 катепсин С) применяют пропиларгинил.4- метокси-2-нафтиламид, 52, О мг упомянутого соединения добавляют к 50 мл воды и -смешивают с равным объемом О, 2 М натрийкоксдилаткого. буфера, рН 5,5,содержащего О, 5 мл 0,1 М раствора хлористоводородной соли меркаптоэтиламина, для образования субстрат-буферного раствора.

Для определения активности дипептидиламинопентидазы (степень активности 1У) применяют глицилпpoпиI -4.-A eтoкcи-2-на у™ тиламид. 43,0 мг упомянутого соединения добавляют к 50 мл воды и смешивают с равным объемом 0,1 М трис-хлористоводородного буфера, рН 7, 5, для получения субстрат-буферного раствора (трис озн. чает 2-амина-2-оксиметил 1,3-пропандиол, поставляемый иностранной фирмой Истмен Кемикелс).

Для определения активной дипептидиламинопептидазы (степень активности III) пра меншот аргиниларгинил- .4-метокси-2i ac. таламид, 59,5 г упомянутого соединения

добавляют к 5О мл воды и смешивают с равным объемом трис-хлористоводородного

буфера в виде О, 2 М раствора для образо,. вания субстрат«-буферного раствора. Для определения трипсина и подобных трипсину -энзимов, таких как катепсин В и подобного трипсину энзима, найденного в веществе головок сп матозоидов, находящихся 6 сперме, применяют карбобензокс№ диглици; -1 «аргинил 4«метокси 2- нафтиламид. Для определения концентрации катепсина В к 50 мл воды добавляют такое копичеетво упомянутого амида, чтобы полу чить 2,0 М раствор, и смешивают с равным объемом 2, О М раствора натрийкакодилат- ного буфера, рН 4, 8, содержащего 2- меркаптцэтанол, для получения субстрат- буфер ного раствора. Вследствие изменения вели чины водородного показателя этого раствора до 6, 7 его можно применить для определения концентрации энзима, подобного трипсину, найденному в выделениях зерен клеток. Для определения концентрации трипсина к 50 мл воды добавляют такое количество упомянутого амида, чтобы получить 2, О мМ раствор, который смешивают с равным объемом О, 2 Мтрис1буфера при рН 7 для поручения субстрат-буферного раствора. Дл облегчения растворения амида к 50 мл вод можно добавить пропиленгликоль. -Формула изобретения Способ количественного определения энзимов гидролитического действия добав«. лением к пробе анализируемого веществасубстрат-буферного раствора, инкубированием полученной смеси с последующим введением в полученный раствор средства, образующего краситель, фотометрировшием и определением энзима по калибровочному графику, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве субстратов гидролитического действия энзимов используют Ы -аминокислотные роизводные 4-л етокси-.2-нафтш1амида общей формулы О I О где R содержит,, по меньшей мере, одну группировку аминокислоты.