Способ выделения лейцинаминопептидазы Советский патент 1984 года по МПК A61K38/46 C12N9/48 

4 С9д QO СО Изобретение относится к биохимии и предназначено для получения широк используемого в биологии и медицине фермента лейцинаминопептидазы. Известен способ получения лейцин аминопептидазы путем микробиологического синтеза с последующей много стадийной очисткой Lll. Однако данньй способ достаточно сложен, требует длительного времени и дорогостоящих реактивов. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ выделени лейцинаминопептидазы из крови убойных животных, заключающийся в нанесении исходной биологической жидкос ти на хроматографическую колонку, 3 аполненную диэтиламиноэтилцеллюлозой, с последующим элюированием целевого продукта буферным раствором диализом элюата,, после чего диализат подвергают повторной хроматогра фии на колонках с гидроксилапатитом и ДЭА,Э.-сефадексом. Степень очистки целевого продукта 5042 раза от исходного С 21, Недостатками известного способа являются его сложность и многостадийность. Цель изобретения - упрощение спо соба. Указанная цель достигается тем, что согласно способу выделения лейцинаминопептидазы ;из биологических жидкостей, предусматривающему нанес ние пробы жидкости на хроматографическую колонку, заполненную сорбентом, с последующим элюированием целевого продукта, в качестве исходно сырья используют биологические жидкости больных с демиелинизирующими заболеваниями, в качестве сорбента используют сефадекс , промываю колонку физиологическим раствором и выдерживают сорбированный на сефа дексе фермент 3-4 сут, а целевой пр дукт элюируют физиологическим раств ром. Способ заключается в проведении всего одной хроматографической стад и обусловливает достаточно высокую степень очистки, в среднем 5161 раз Упрощение способа при сохранении на большего эффекта очистки получают п использовании сефадекса Q-75. При применении частиц декстрана другимиразмерами пор (U-10, Gt-25, 6-50) степень очистки ниже. Жесткие условия опыта не позволяют использовать крупнопористые сефадексы. Оптимальное время инкубации сефадекса с адсорбированным ферментом установлено опытным путем и составляет 3-4 сут. При инкубации сорбированного фермента менее трех суток активность его не определяется или значительно снижена, а более четырех суток - активность фермента также низка по отношению к оптимальной, которая достигается при инкубации в течение 3-4 сут. Упрощенное получение фермента объясняется следующими причинами. В биологических жидкостях у больных с демиелинизирующими заболеваниями основная масса фермента лейцинаминопептидазы связана с ингибитором. Ингибитор имеет повышенное сродство к соединениям типа дектрана и мол. вес в пределах 20000-50000, поэтому он адсорбируется на колонке с размером частиц, соответствуюш;им сефадексу Q-75, тогда как связанный фермент имеет мол. вес 150000 и в поры сефадекса Q -75 не проникает. Инкубация в течение указанного времени приводит к отделению фермента от ингибитора, после чего фермент элюируют физиологическим раствором. Ингибитор остается на колонке и может быть использован для реохроматографии. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Биологическую жидкость (сыворотка, кровь, ликвор, моча) наносят на хроматографическую колонку с приспособлениями для центрифугирования, заполненную предварительно отцентрифугированным сефадексом , центрифугируют в течение 2 мин со скоростью 3000 об/мин, промывают физиологическим раствором для удаления балластных белков и вновь центрифугируют 2 мин со скоростью 3000 об/мин. Колонку инкубируют в течение 3-4 сут при , а конечньш продукт элюируют физиологическим раствором. Пример 1. Сыворотку крови больного с рассеянным склерозом наслаивают на хроматографическую колонку (с приспособлениями для центрифугирования), заполненную предварительно отцентрифугипоиянным сефадексом Gf-75, центрифугируют 3 мин со скоростью 3000 об/мин, промывают 3 20 мл физиологического раствора для удаления балластных белков и вновь центрифугируют 2 мин со скоростью 3000 об/мин. Колонку, содержащую сор бированный фермент, инкубируют в течение 72 ч при 4,0°С, конечный продукт элюируют 5 мл физиологического раствора. Удельная активность ЛАП до инкубации 0,048 ед/г белка, после инкуба ции - 250 ед/г белка. Степень очистки 5208 раз. Пример 2. Метод осуществляют аналогично примеру 1, при этом ин кубацию проводят 96 ч. Удельная активность фермента до инкубации 0,011 едУг белка, после инкубации вЬ ед/г белка. Степень очистки 5454 раза. Пример 3. У больного с рассеянным склерозом берут ликвор, проводят исследования аналогичные приме ру 1, инкубацию проводят 84 ч. При этом удельная активность ЛАП до инку бации 0,7 ед./г белка, после инкубации 3910 ед/г белка. Степень очистки 5585 раз. Пример 4. Исследовали мочу больного рассеянным склерозом. Приемы исследования аналогичны примеру инкубировали 74 ч. Исходная активность ЛАП нулевая, после инкубации 125 ед/г белка. Специфическая активность целевого продукта подвергается исследованию его активности с помощью ЛАП-тес та фирмы Fermognost. Метод определения ЛАП основан на том, что лейцингидразид под влиянием ЛАП расщепляется, отщепленный гидразин образует с 4-диметиламинобензаль 9 дегидом в солянокислой среде оранжево-красное красящее вещество, которое определяют колориметрически. Испытания проводят в четырех пробирках. Вначале в пробирки 1 и 2 наливают по 0,5 мл лейцингидразида, выдерживают на водяной бане при 37С в течение 10 мин, в опытную пробирку добавляют 0,2 МП испытуемой жидкости. Далее все пробирки инкубируют на водяной бане при 37®С 30 мин, после инкубации, в контрольную пробу (пробирка 3) вносят 0,7 мл гидразина, а в пробирку (4 вносят 0,7 мл дистиллированной воды. Затем во все пробирки 1-4 добавляют по 5 мл димётилбензальдегида и быстро перемешивают содержимое пробирок. Далее в пробирку 2 добавляют 0,2 мл испытуемой жидкости и 30 мин инкубируют при 37°С. Не более, чем через 6 ч, изменяют экстинкцию опытной пробы (пробирка 1) против пустой пробы (пробирка 2) и экстинкцию контрольной пробы (пробирка 3) против второй пустой пробы (пробиркг 4), длина волны 455 мм (можно 13 области 450-460 им), Ш11рина слоя 1 ,00 см. При расчете первое полученное значение экстинкции делят не второе, активность фермента выражают в единицах (1 ед. - количество ЛАП, которое расщепляет 1 мМоль |: -лейцинг}одразиде в течение 1 мин в условиях одной пробы). Одновременно в исследуемых образцах проводят количественное определение белка методом Лоури и удельную активность фермента выряжают на 1 г белка. Выделение лейцинаминопептидазы из различных биологическтс жидкостей приведено в таблице. ,

СПОСОБ ВВДЕЛЕНИЯ ЛЕЙЦИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ из биологических жидкостей, предусматривающий нанесение пробы жидкости на хроматографическую колонку, заполненную сорбентом, с последующим элюированием целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве исходного сырья используют биологические жидкости больных с демиелинизирующими заболеваниями, в качестве сорбента используют сефадекс G-75, промывают колонку физиологическим раствором и вьщерживают сорбированный на сефадексе фермент 3-4 сут, а целевой продукт элюируют физиологическим раствором.

Доноры

0,05 1 2 0,08

О

О О

О

Продолжение табли1ды

Данные таблицы показывают, чтовзятый у больных с демиелинизирукицимй

предлагаемый способ эффективен призаболеваниями, который в настоящее

использовании биологических жидкостейвремя является отходом после кяинико

только от больных демиелинизирующимидиагностических исследований, заболеваниями. 5 Преимуществом способа является

предлагаемый способ значительнобиологических жидкостей после сорбции

упрощен при сохранении высокой сте-лейцинаминопептидазы как исходного

пени очистки, позволяет практическисырья для получения биологическихtipeиспользовать биологический материал. паратов.

возможность дальнейшего использования