анилина, n-фенилаэоанилина и 4-фени азо-1-нафтиламина. Предпочтительным является остаток п-нитроанилина, та как содержащее его дипептидное производное лучше всего растворяется в воде, наиболее стабильно и синтезировать его проще всего. Активность фермента по отношению к новым дипептидным производным Х-1-пролин-У различна в зависимости от того, какбва круппа N-конечной аминокислоты (X). Дипептидные производные, - содержащие нейтральную ил основную аминогруппу в качестве X, наиболее легко гидролизуются фермен том, а те, которые содержат кислотную аминогруппу, наиболее слабо. Дипептидные производные, содержащие нейтральную или основную аминокислотную группу, или их соли, таких кислот как п-толуолсульфоновая кис лота, подходят в качестве субстрато но производные основных аминокислот гигроскопичны. Дипептидные производ ные, содержащие группу глицина, отличаются самой большой скоростью гидролиза при рН 8,7 из различных дипептидных производных X-Ь-пролина-Y; в темноте они обладают высоко стабильностью и легко растворяются в воде. Производные глицина, особен его соль такой кислоты, как хлорист водородная и п-толуолсульфоновая, н гигроскопичны по сравнению с производными основных С1МИНОКИСЛОТ и удоб при анализе. П-нитроанилид глицил-L -пролина или его соли, особенно п-т луолсульфонат (тозилат), являются наилучшими субстратами. Если используемая аминокислота содержит боковые функциональные гру пы, то они могут быть использованы после того, как функциональные тру пы будут защищены. Например, в случае кислых аминокислот, их использу ют после того, как боковые карбокси ные группы превращают в сложные эфи ры, такие как бензиловый эфир. Аргинин используют после того, как группу гуанидина защищают обычной защитной группой, такой как тозил, нитро-, п-нитро-бензил-карбонил и 2-(изопропилоксикарбонил)3,4,5,6-тетрахлор-бензоил, и особенно двумя первыми группами, тогда как N-аминогруппу лизина обычно защищаю известными аминозащищающими группам предпочтительно теми же защитными группами, как и те, что используют для защиты N-аминогруппы. Защитную группу N-защищенного-Х-L-пролина-У, полученного таким образом, затем отщепляют с помощью известного способа, зависящего от природы N-защитной группы/ и, если она есть, защитной группы боковых функциональных групп. Очень важно от щепить только защитную группу, не затронув остальные, в этой реакции .элиминирования. Можно также синтезировать необходимые Дипептидные производные соединением вначале N-защищенного X-L-пролина с частью V-II, а затем отщепить защитную группу от полученного Х-1-пролина-У. Если нужно получить соли кислот дипепг-идных производных, то их получают при -взаимодействии дипептидных производных с кислотами в такой среде, как вода, этанол. Соли также получают из N-защищенных производных при взаимодействии их с кислотс1Ми, если защитная группа является т-бутилоксикарбонилом или аналогом, который может быть отщеплен под действием кислоты. Среди различных солей кислот тозилат является наиболее предпочтительным, так как он образует твердые кристаллы, которые не включают примесей, присутствующих в маточном растворе, и который может быть поэтому получен с высокой степенью чистоты . простой перекристаллизацией. Активность фермента легко измеряется, если в качестве субстратов используют Дипептидные производные или их соли. Вначале приготавливают водный раствор Х-1-пролина-У или его соли подходящей концентрации. Если для растворения субстрата в воде требуется слишком мало времени, то предпочтительно использовать подходящие вещества для ускорения скорости растворени;, такие как неионные детергенты, кислоты или спирты, или использовать субстрат в пористой форме, чего MoXiCHo достичь замораживанием. Пористый субстрат наиболее удобен для рутинного анализа фермента; рН раствора субстрата меняется в зависимости от того, какой субстрат используют. рН обычно расположен в интервале от 6 до 9, и предпочтительно от 7,5 до 8,9. Субстраты спонтанно гидролизуются при рН свЕлие 9,5, но расторы .субстрата, особенно раствор п-нитроанилида глицил-1-пролина, стабилен при вышеупомянутом оптимуме рН и может храниться при свыше недели без заметного разложения Активность фермента измеряют при контакте субстрата с Х-пролил-диаминопептидазой или образцом, содержащим ее, в водной среде, предпочтительно в буферном растворе, таком как трималеат буфер, глицин-NaOH буфер и амидиол буфер при температуре от 30 до в течение определенного промежутка времени, определяя фермент обычным способом, и затем определяют освобожденные Y-H. Инкубационный период определяют в со ответствии с количеством субстрата и фермента. Даже если сырой фермент, такой как сыворотка человек, исполь зуют в качестве источника фермента, то активность измеряют достаточно точно, так как субстрат практически не гидролизуется другими ферментами, сопровождающими сырой фермент. Количество освобожденных Y-H легко определ5пот, измеряя поглощение фе ментной, реакционной смеси непосредственно на длине волны, соответствую щей индивидуальной группе Y-H а именно при 385 нм для п-нитроанилина 493 нм для п-фенилазоанилина и 532 н для 4-фенилазо-1-нафтиламина. Прямой фотометрический метод прост, удобен точен и, таким образом, подходит для рутинного анализа активности фермента. Когда У-Н группой является п-нитроанилин, активность фермента можно определять диазотизицией п-нитроанилина, осуществляемой за счет избытка нитрата натрия в кислой среде. При этом измерении количество п-нитроанилина, который образовался, может быть рассчитано измерением непро реагировавшего нитрата натрия; однако обычно определяется так назьшаемым способом азосоединения, разлагая непрореагировавший нитрит натрия сул фаминовой кислотой сульфатом аммония, мочевиной и т.д., подвергая взаимодействию образовавшийся п-нитрофенилдиазониум с соединяющим компо нентом, таким как (- 1-нафтил) этилендиамин, и затем измеряя поглощение образовавшегося азосоединения на длине волны, характеризующей это азосоединение. Этот косвенный метод определения более сложен, чем предыдущий прямой фотометрический способ, но более чувствителен. Приведенные далее примеры иллюстрируют изобретение более подробно. Пример 1. п-Нитроанилид М-бензилоксикарбонил-1- пролииа. Треххлористый фосфорил (50,6 г) медленно размещают в растворе N-бензилоксикарбонил-1-пролина (74,8 г) и п-нитроанилина (41,4 г) в тетрагидрофуране (400 мл) при . В смесь по каплям добавляют триэтилами (92,4 мл), причем температуру внутри поддерживают при -15°С. Триэтиламин добавляют до рН 7, после чего температуру реакционной смеси повышают до комнатной и перемешивают смесь, в течение 3 ч. Растворитель заменяют этилацетатом (1,2 л), раствор последовательно промывают водой (100 мл), 1 н. соляной кислотой (300 мл X 5), водой (400 мл), 5%-ным раствором гидрокарбоната (300 мл X 3) и насыщенным раствором хлористого натрия (300 мл и сушат над сульфатом магния. Высушенный рас тпор концентрируют при пониженном давлении, остаток кристаллизуют, добавляя этиловый эфир, и полученный продукт перекристаллизовывают из смеси этилацетата (300мл) и метанола (50 мл), выход 56 г, т. пл. 159-161 С, ,60(,0 метанол). Найдено, %: С 62,07; Н 5,20; N 11,62. Ci,H,,05Nj Вычислено, %: С 61,77; Н 5,19; N 11,38. Пример 2. Бромгидрат п-нитроанилида L-пролина. п-Нитроанилин N-бензилоксикарбонил-1-пролина (55,4 г), растворяют в 26%-ном растворе безводного бромистого водорода в уксусной кислоте (200 мл) при 0°С, и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Раствор примешивают в сухой этиловый эфир (2 л) для кристаллизации продукта, который выделяют декантацией, отмывеиот этиловым эфиром и сушат, выход 47 г. Неоч(военный продукт используют в следующих примерах без дальнейшей очистки. Пробу для анализа получают перекристаллизацией из смеси метанола с этиловьм эфиром. Т.пл. 225-226°С, 22 35,бО(,0, CHjOH). Найдено, %: С 41,75; Н 4,34; Н 13,30. .Br Вычислено, %: С 41,79; Н 4,46; N 13,29. Пример 3. п-Нитроанилид N-бензилоксикарбонил-глицил-L-пролина. N-бензилоксикарбонил-глициновый оксисукцинимидный сложный эфир (48 г, 0,16 моль) перемешивают в охлажденную смесь бромгидрата п-нитроанилида L-пролина (47 г, 0,15 моль) i триэтиламина (22 мл) и N-оксибензтриазола (1 г) в диметилформамиде (100 мл). Всю смесь перемеишвают при ксмиатной температуре в течение 1 ч, поддерживая в течение этого времени рН раствора 6 с помощью триэтиламина, а затем раствор перемешивают еще в течение 19 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляют испаренн л при понижение давлении, в остаток добавляют .воду (350 мл), а зате14 продукт двгикды экстрагируют этилащетатом (500 мл, 200 мл), Экстракты смешивсиот, последовательно отмывают водой (200 мл), 1 н. соляной кислотой (200 мл X 2), водой (200 мл) и 5%-иьм раствором гидрокарбоната натрия (200 мл X 4) и водой (200 мл) и сушат над сульфатом магния, выход 67 г. Гомогенность этого продукта была подтверждена методом тонкослойной газовой хроматографии на силикг еле с использованием в качестве растворителя смеси хлорофо1 1а, метанола и уксусной кислоты объемное отноше|1яе (95:5:3) . П р и м е р 4. п-Нитроанилид гли цил-L-пролнна. п-Нитроанилид N-бензилоксикарбонил-глицин-L-пролина (61 г) подвергают взаимодействию с 26%-иым раств ром безводного бромистого водорода . уксусной кислоте (250 мл) и реакцио ную смесь обрабатывают так же,как в примере 2, в результате чего получаю бромгидрат п-нитроанилида глицил-L-пролина, выход 9 г. БрОмгидрат (20 г) смешивают с 1 М раствором карбоната натрия (100 мл) и суспензию экстрагируют хлороформом 8 раз (по 100 мл каждьй раз) после насыщения хлористым на.трием. Экстракты смешивают, пробивают насы щенным раствором хлористого натрия (100 мл) и сушат над сульфатом магния. Высушенный раствор концентриру ют, а остаток кристаллизируют из смеси этилацетата с этиловьв эфиром выход 12,7 г, т.пл. 118-120с,ГЛ 115, (, метанол) ,д llStJO (0,1 н. хлористоводородная кислота) П р.и м е р 5. Тозилат-п-нитроанилида глицил-L-пролина. п-Нитроанилид-глицил-L-пролина (584 мг) нейтрализуют раствором моно гидрата п-толуолсульфоновой кислоты в этаноле (380 мг в 10 мл). Продукт кристаллизуют путем помещения раствора в холодильник. Неочищенный про дукт перекристаллизовывают из смеси метанола с этиловым эфиром, выход 312 мг, т.пл. 223-225°С (с разложени ем), frf. - 81,00 (,0, метанол Найдено, %: С 51,82; Н 5,19; N 12,24. Вычислено, %: С 51,72; Н 5,21; N 12,06. Пример 6.. п-Нитроанилид т-бyтилoкcикapбoнил-L-aлaнил-L-пролина. т-Бyтилoкcикapбoнил-L-aлaнин (5,7 г) и бромгидрат п-нитроанилида L-пролина (9,5 г) растворяют в хлороформе (40 мл) с триэтиламином (4,2 мл, 0,03 моль) и в этот раствор добавляют раствор N.М-дициклогексилкарбодиимида (6,2 г) в хлороформе (5 мл) Всю смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 44 ч и после добавления нескольких капель уксусной кислоты перемешивание -продолжают еще 2 ч. Осевшие продукты отфильтровывают, фильтраты концентри руют при пониженном давлении. Остаток смешивают с водой и продукт экстрагируют этилацетатом. Экстракт последовательно отмывают 1 н. соляной кислотой, водой, 5%-ным раствором гидрокарбоната, водой и .насыщенным раствором хлористого натрия и с-ушат над сульфатом магния Высушенный раствор концентрируют до получения остатка, который растворяют в этиловом эфире. Некоторое коли чество нерастворившихся материалов отфильтровывают, фильтрат концентрируют и остаток отверждают титрованием н-гексаном, выход 12,9 г. На тонкослойной хроматограмме этот продукт дает одиночное пятно. Пример 7. Хлоргидрат п-нитроанилида L-аланид L-пролина. Расувор п-нитроанилида т-бутилоксикарбонил-L-аланил-L-пролина (12,9г) в диоксане (20 мл) обрабатывают 6N растворсал безводного хлористого водорода в диоксане (45 мл) в течение 55 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении, а остаток растирают для отверждения в этиловом эфире, затем отвержденный продукт кристаллизуют из этанола, выход 6,4 г, т.,пл. 130-14. (с разложением) , oLj - 103,4 (,0, метанол) . Найдено, %: С 46,12; Н 6,09; N 15,50 . А4Нл904НдС«. 5/4На-0 вычислено, %: С 46,03; Н 5,93; N 15,34. Пример 8. п-Нитроанилид т-бyтилoкcикapбoнил-0-бeнзил-L-acпapтил-L-пролина. т-Бyтилoкcикapбoнил-ft-бeнзил-Lracпаргиловую кислоту (9,7 г 0,03 моль) и бромгидрат п-нитроанилида L-пролина (9,5 г, 0,03 моль) присоединяют друг к другу так же, как в примере 6. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке силикагеля (3,6см X 19 см), причем в качестве растворителя используют смесь хлороформа и этилацетата (объемное отношение 5:1), Фракции, содержащие основной пик, собирают и концентрируют до получения аморфного твердого вещества, выход 10,3 г. Гомогенность этого продукта была подтверждена тонкослойной хроматографией. Пример 9. п-Нитроанилид L-аспартил-L-пролина. п-Нитроанилид т-бутилоксикарбонил- -бeнзил-L-acпapтил-L-пpoлинa(10,3 г) хорошо смешивают с аназолом (8 мл) и раствор обрабатывают безвЪдным фтористым водородом (около 50 мл) в течение 1 ч при . Фтористый водород отгоняют и продукт осаждают, добавляя этиловый эфир. Осажденное вещество дважды отмывают этиловым эфиром, детактируют и сушат. Неочищенный продукт растворяют в 0,1 М уксусной кислоты и раствор хорошо промывают этиловым эфиром, а затем пропускают через колонку с сильноосновной ионообменной смолой (Амберлит ИР-400, ацетатная форма, 200 мл), которую промывают 0,1 М уксусной кислоты. Элюат и промывки смешивают и концентрируют при пониженном давлении. Остаток кристаллизуют из небольшого количества воды, вькод 5,2 г, . 144-145 С (с разложением) , - 100,3(,0 1NНС1),Е 12170 (0,1N-HC1).
Найдено, %: С 48,03; Н 5,63; N 14,16.
C.,s4ie9bN4 3/2НЗ.О
Вычидлено, %: С 47,74; Н 5,61; N 14,85.
и м е р 10. п-Нитроанилид т-буТилоксикарбонил- -бензил-1-глутамил-L-пролина.
Бромгидрат п-нитроанилида L-пролина (9,5 г) и т-бутилоксикарбонил-у -бензил-1,-глютаминовую кислоту, вьаделенную из дициклогексиламиновой соли (17,1 г), присоединяют с помощью N,N -дициклогексилкарбодинмида, как в примере 6. Сырой продукт очищают на хроматографической колонке до получения аморфного твердого вещества, выход 12j7 г.
Гемогенность твердого вещества была подтверждена с псвлсш1ью тонкослойной хроматографии.
Пример 11. п-Нитроанилид L-глутамил-L-пролина.
п-Нитроанилид т-бутилоксикарбонил- бeнзил-L-глютaмил-L-пpoлинa (10 г 0,018 моль) обрабатывгиот фтористым водородом (около 50 мл) и реакционную смесь обрабатывают как в примере 9. Конечный продукт получен в виде кристаллов, выход 4,7, т. пл. 1171260С (с разложением), - 82,8 (,0, вода) .
Найдено, %: С 49,73; Н 5,91; N 14,54
Ь 5/4Н2.0
Вычислено, %: С 49,66; Н 5,87; N 14,88.
. П-р и м е р 12. п-Нитроанилид N ,N -дибeнзилoкcикapбoнил-L-лнзил-L-пролина.
Бромгидрат п-нитроанилида L-пролина (9,5 г) соединяют с Н,К -дибензи oкcикapбoнил-L-лизинoм (12,4 г) и реакционную смесь обрабатывают, как в примере 6. Конечнь продукт получают в виде аморфного твердого вещества, выход 15,8 г.
Гемогеиность продукта была подтверждена с помсхцью тонкослойной хроматографии.
П р и м е р 13. Дитолизат п-нитроанилида L-лизил-L-пролина.
п-Нитроанилид .И-дибензилоксикapбoнил-L-лизил-L-пpoлинa (9,5 г) обрабатывают 26%-Hfcw раствором безводного бромистого водорода в уксусной кислоте (35 мл) и реакционную смесь обрабатывают по методике примера 2. Таким образом получают дибромгидрат п-нитроанилида L-лизил-L-пролина, выход 7,8г.. :
Бромгидрат растворяют в 0,1 М уксусной кислоте, раствор пропускают через колонку Амберлита 1 R-400 (в форме эцетата,,200 мл),которую промывсши 0,1 м уксусной кислотой. Элюат и промывки соединяют и выпаривают до остатка при пониженном давлении; затем остаток растворяют в смеси этанола с моногидратом п-толуолсульфоновой кислоты (5,5 г). Концентрирование раствора при пониженном давлении дает остаток, который кристаллизуют, растирая его с этиловым эфиром, выход 10,1 г, т. пл. 92-130 С (с разложением), UJ - 32, (,1, вода-)
0
Найдено, %; С 49,76; Н 6,02; N 9,26
Ci%H4 O oM, ftj
Вычислено, %: С 50,05; Н 6,11; N 9,42
s
. П р и м е р 14. п-Нитроанилид N -бeнзилoкcикapбoнил-N -тoзил-L-apгинид-L-пролина.
Бромгидрат п-нитр(оанилида L-пролина (12,0 г) и N-бензилоксикарбонилrN -тoзил-L-apгинин, который вьщеляют
0 из соли циклогексйламида (23 г), растворяют в хлорофО Ж е (60 мл) и в раствор примешивают 1-этил-З-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (6,8 мл) при . Смесь перемешивают еще в
5 течение 17 ч при комнатной температуре и далее обрабатывеиот, как в .примере 3, выход 22,3 г.
Гомогенность этого продукта под0тверждена с помощью тонкослойной хроматографии.
П р и м е р 15. дитозилат п-нитроанилида L-аргинин-L-пролина.
п-Нитроанилид N-бензилоксикарбо-.
5 нил-N -тoзил-L-apгинил-L-пролина (8,2 г) обрабатывают безводньм фтористым водородсм, как в примере 9. После удаления избытка Фтористого водорода остаток обрабатывают, как в примере 13. Конечный продукт
0 получен в виде кристалла, выход 7,3, т. пл. 125-138 с- (с разложением) , W -31,4«С (,0, вода).
Найдено, %: С 47,79; Н N 12,53
5
CMH4-fO-fo Sa.-5/2H2,0
Вычислено, %: С 47,67; Н 5,85; N 12,56.
Пример 16. п-Фенилазоанилид N-бензилоксикарбоиил- L- пролииа.
0
п-Фенилазоанилин (7,9 г) и Н-бен3 илоксикарбонил- L-пролин (10,0г.) соединяют и реакционную смесь обрабатывают, как в примере 6. В результате получают твердый продукт, вы5ход 10,8.
Этот продукт используют в следую цен примере 17 без дгшьнейней очистки. Образец для ангшиза получают рекристгшлизацией из н-гексанэтилацетата.,о А
0
Т. пл. 141-143 C,Wt - 87,0С (С«1,О, диметилформамид).
Найдено, %: С 70,27; N 5,61; N 12,93 5CAsHx40iN-v
Вычислено, %: С 70,07; Н 5,65; N 13,08
Пример 17. п-Фенилазоанилид
Ы-т-бутилоксикарбонил-глйцил-1-пролина. .
п-Фенилазоанилид N-бензилокси,карбонил-1-пролина (4,3 г 0,01 моль) обрабатывают 25%-ным раствором безводного бромистого водорода в уксусной кислоте (35 мл) и реакционную смесь обрабатыва |рт, как в примере 2.
Бромгидрат п-фенилазоанилида L-пролина, полученный таким образом, и т-бутилоксикарбонилглицин (2,5 г) соединяют, как в примере 6. Сырой продукт полученный при этом, очищают на хроматографической колонке; после очистки получают конечный продукт в виде кристаллов, выход 3,4 г, т. пл. 172-176°С, fo( 110, (,0, яиметилформамид).
Найдено, %: С 64,08; Н 6,73; N 15,18
QZAHigO Ng
вычислено, %: С 63,84; Н 6,47; N 15,51.
П р и м е р 18. Тозилат п-фенилазоанилнда глицин L-пролина п-Фенилазоанилид т-бутилоксикарбонил-глицил-L-пролина (2,5 г) растворяют в уксусной кислоте (8 мл) вместе с моногидратом п-толуолсульфоновой кислоты (2,3 г). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. ПРОДУК.Т осаяодают, добавляя в реак ционную смесь этиловый эфир, выделяют фильтрованием и отмывают этиловым эфиром. Полученный твердый продукт дважды перекристаллизовывают из смеси этанола с этиловым эфиром, выход 1,6 г, т. пл. 141-155 С (с разложением) , Го.}; ..68,7°С (, диметилформамид),6 2 25000(0,1 н. соляная кислота).
Найдено, %: С 57,53; Н 5,60;: N 12,99
OgNjj
Вычислено, %: С 57,65; Н 5,77; N 12,93.
Пример19. 4-Фенилазо-1-нафтиламид Ы-бензилоксикарбонил-1-про-лина.
4-Фенилазо-1-нафтиламин (4,9 г) и Ы-бензилоксикарбонил-1-пролин (5,0 г) соединяют и затем реакционную смесь обрабатывают,как в примере 6. Конечный продукт получают в виде кристаллов, выход 3,5 г. т.пл. 136-138°С, -75,9°С (,0, диметилформамид) ,
Найдено, %: С 72,68; Н 5,57; ,93
С,9 Нjq Оа N ,
вычислено, %: С 72,78; Н 5,48; N 11,71.
П р и м е р 20. 4-Фенилазо-1-нафТиламид-т-бутилоксикарбонил-глицил-, -L-пролина.
4-Фенилазо-1-нафтиламид-М-бензилoкcикapбoнил-L-пpoлинa (2,5 г) обрабатывают- 25%-ным раствором безводного бромистого водорода и уксусной кислоте (25 мл) и реакционную смесь 5 обрабатывают,как в примере 2.
Бромгидрат 4-фенилазо-1-нафтиламида t-пролина, полученный таким обра, зом, и т-бутилоксикарбон L-глицин (1,36 г) соединяют с N, }-дициклоIQ гексилкарбодимидом и реакционную
смесь обрабатывают, как в примере 6. Сырой продукт очищают затем на хроматографической колонке, после чего конечный продукт получают в кристаллическом виде, выход 1,1 г.
5 На тонкослойной хроматограмме этот продукт проявился в виде одиночного пятна.
П р и м е р 21. 4-Фенилазо-1-нафтиламид глицил-L-пролина.
0 4-Фенилазо-1-нафтиламид т-бутилокси-глицил-L-пролина С1,0 г) обрабатывают моногидратом н-толуолсульфоновой кислоты (0,76 г) и реакционную смесь обрабатывают, как в примере 17.
5 Тозилат 4-фенилазо-1-нафтиламида глицилпролина, полученный таким образом, растворяют в метаноле и нейтрализуют 5%-ным раствором гидрокарбоната натрия для высаждения продукта.
« Высаженный из раствора продукт ввделяют фильтрованием, отмывают водой, сушат я перекристаллизовывеиот из смеси метанола с водой, выход 0,67 г, т. пл. 127-138 С (с разложением), М , , диметилформа мидГ. t(KC 14.400 (0,1 н. соляная кислота).
Найдено, %: С 66,45; Н 5,81; N 16,69
Cji H- iOjN -3/4H.
0 вычислено. %: С 66,56; Н 5,95; N 16,88
П р и м е р 22. Изучают связь между инкубационным периодом и количеством гидролизованного субстрае та, используя п-нитроанилид глицил-L-пролина и сыворотку человека в качестве субстрата и источника фермента соответственно, и пробу гйдролизованного субстрата отбирают для
последующего прямого фотометрического измерения.
Тозилат п-нитроанилида глицил-L-пролина растворяют в 2%-ном водном растворе неполного детергента (Nikkol NP-10, Nikko, Chemical, Osaca, Japan)
5 в концентрации 3 мм для получения раствора субстрата. Затем приготовляют следующие 4 пробирки:
экспериментальная пробирка, содержащая 0,5 мл 0,15 М глицин-NaOH0 в качестве буфера (рН 8,7) О,5 мл
раствора субстрата и 0,5 мл человечес кой сыворотки;
пробирка,содержащая 0,5 мл 0,15 г-. глицин-NaOH в качестве буфера 0,5 wj:
5 раствора субстрата и 0,05 мл воды; эталонная пробирка, содержащая 0,6 мл буфера, 0,5 мл субстрата и 0,5 мл водного раствора п-нитроанили на; контрольная пробирка, содержащая 0,5 мл буфера и 0,5 мл субстрата. Все пробирки инкубируют при 37°С в течение времени, указанного в табл.1,и затем реакцию останавли;вают добавлением 3,О мл 1 М ацетата в качестве буфера (рН 4,2) в каждую пробирку. В контрольную пробирку добавляют 0,05мл человеческой сыворотки после остановки реакции. Фотометр устанавливают на нуль с помощью холостой пробирки, а затем измеряют поглощение экспериментальной (э), контрольной (к) и стандартной (С) пробирок на длине волны 385 мл в кю вете толщиной 1 см. Количество п-ни роанилина, освобожденного в реакции с ферментом, рассчитывают по уравне -Ц. 150 (н моль) . Результаты приведены в табл.1. Таблица 1 Результаты этих испытаний подтверждают, что реакция ферментации линейно зависит от времени. Ту же самую процедуру повторяют той разницей, что вместо человеческ сыворотки используют гомогенный фер мент, выделенный препаративно из по челюстной железы человека. Пример23. Зависимость межд количеством фермента и количеством гидролизованного субстрата изучают тозилате п-нитроанилида глицил-L-пролина и человеческой сыворотке, которые используют в качестве субстрата и источника фермента соответственно, и пробу на гидролизуемость субстрата осуществляют по сле дующим азосочетаниям. Приготовляют следующие пробирки: экспериментальная пробирка,- содержащая 1,0 мл 0,15 М глицин-NaOH в качестве буфера (рН 8,7), 1,0 мл раствора субстрата, приготовленного в примере 21, и человеческую сыворотку в объеме, указанном в табл.2. контрольная пробирка, содержащая 1,0 мл глицин-NaOH в качестве буфера и 1,0 мл раствора субстрата. Обе пробирки, как экспериментальную, так и контрольную, инкубируют при.37с в течение 30 мин, а затем добавляют 0,1 мл человеческой сыворотки в контрольную пробирку. Реакцию останавливают добавляя 0,4 мл 30%-ного водного раствора хлорной кислоты. После центрифугирования со скоростью 3000 об/мин в течение 10 мин каждые 0,5 мл надосадочной жидкости переносят в другую пробирку, Кроме того 0,1 мл водного раствора п-нитроанилина и 2,4 мл 30%-ного раствора хлорной кислоты добавляют в эталонную пробирку, а 2,5 мл раствора хлорной кислоты - в холостую пробирку. Во все четыре пробирки добавляют по 0,5 мл 0,2%-ного водного раствора нитрита натрия при и при этой температуре их выдерживают в течение 10 мин. Затем добавляют 0,5 мл свежеприготовленного 0,5%-ного водного раствора сульфата аммония. Через 2 мин добавляют 1,0 мл 0,05%ного раствора N-(1-нафтил)-этилендиамина и пробирки инкубируют при в течение 30 мин в темноте. Фотометр устанавливают на нуль с помощью холостой пробирки, измеряют поглощение экспериментальной (Э), контрольной (К) и стандартной (с) пробирок при 548 нм. Количество п-нитроанилина, образовавшегося с помощью фермента, рассчитывают по уравнению (Е - с) X 500 А 2,5 1 ОТЗ где А есть объем 0,5 мМ водного раствора п-нитроанилина, использованного в стандартной пробирке (мл). Результаты приведены в табл. 2. Таблица 2 Результаты этих испытаний подтверждают, что реакция ферментации линейно зависит от количества фермента.
Пример 24, ЗмМ раствора суОстратов приготавливают, как в примере 2, причем в качестве субстратов используют различные дипептидные производные или их соли. Активности фермента по отношению к раэличньм субстратам, скорости гидролиза и оптимальные значения рН различных субстратов с помощью фермента измеряют, как в примере 22.
Результаты приведены в табл. 3. Таблица 3
п-Нитроанилид-1-лиИзмеряют активности очищенного фермента подчелюстной железы человека в 0,15 М трисмалеат буфере с рН 5,6-8,8 и в 0,15 М глицин-NaOH буфере с рН 8,2-0,4. Для п-нитроан лида 1-аланил-1-пролина в качестве буфера вместо глицина используют индол, так как глицин затрудняет фотометрирование при значениях рН 9-10. Значения К измеряют для трисмал ат буфера с рН 7,0 с применением фермента подчелюстной железы человека. Приведенные значения являются средними из повторных экспериментов Измеряют активности при рН 7,0 в 0,15 М трисмалеат буфере или при рН в 0,15 М глицин-NaOH буфере. При веденные значения являются средними из повторных экспериментов. Очищенный фермент получают следующим способом. Фермент переводят в растворимое состояние..из микросоматической фракции автодигерировани и последовательно очищают фракциони рованием с помощью (NH4) с последующей очисткой Sephadex G-200 хроматографией. Субстрат используют в виде дитозилата. Субстрат используют в виде хлоргидрата. Пример 25. Продукты, полученные после инкубирования в течение 30 мин различных п-нитроанилидов X-L-пролинов с очищенным ферментом подчелюстной железы человека или с .человеческой сывороткой, как в примере 22, используют с помснцью бумажной хроматографии, причем в качестве N-кЬнечных аминокислот (X) используют остатки глицина, L-аланина, L-глутаминовой кислоты, L-аспаргиловой кислоты, L-лизина и L-аргинина. В этом случае, когда используют очищенный фермент, на хроматограмме идентифицируют кроме субстрата только X-L-пролин и п-нитроанилид, а Х-ОН, L-пролин или п-нитроанилид L-пролина не наблюдались. . В этом случае, когда в качестве фермента используют человеческую сыворотку, а в качестве субстрата п-нитроанилид - глицил-пролина, на хроматограмме идентифицируют глицил-L-пролин-глицин, L-ПЕЮЛИН и п:-нитроанилид, а п-нитроанилид L-пролина обнаружен не был. При исследовании скорости гидролиза п-нитроанилида L-пролина человеческой сывороткой обнаружено, что гидролизу подверглось всего лишь 0,7% п-нитроанилида глицил-L-пролина. Было показано, что человеческая сыворотка гидролизует глицин-L-пролин из глицина и L-npoпина. Эти результаты показывгиот, чт глицил-L-пролин может быть гидролиэован предпочтительно Х-пролилдипептидиламинопептидазой, содержащей в сыворотке человека, с получением вначале п-нитроанилида и глицил-L-пролина, который далее гидролизуэтся до глицина и L-пролива другим ферментом в человеческой сыворотке. Пример 26. ЗмМ раствора су зтрата приготавливают, как в примере 22, причем в качестве субстрата используют тозилат п-фенилазоанилида глицил-L-пролина и 4-фенилазо-1-нафгаламид глицил-1-пролина. Испытание активности фермента осуществляют, добавляя 0,05 мл чело веческой сыворо ки в смесь 0,5 мл 1,5 мм буфера глицин-NaOH (рН 8,7) и О,5 мл субстрата раствора в экспериментальной пробирке, выдерживая полученный раствор в течение 30 мин при 37°С и останавливая затем реакцию добавлением 3,0 мл 1 н. соляной кислоты. Поглощение п-фенилазоанилиЗначения активности у молодых лужчин (не старше 40 лет) были значительно выше, чем у молодых женщин, э 0,001.
Значения активности у пожилых женщин были значительно выше, чем у . молодых женщин, р 0,05.
Normal (control)
88 54,9+1,5 23 75,8+28,5 Мераt i tus
П р и м е р 29, Была измерена активность Х-пролилдипептидиламинопептидазы, как в примере 22, с использованием п-нитроанилида глицил-L-пролина и человеческой сыворотки в качестве субстрата и фермента соответ,ственно.
Результаты приведены в табл. 5.
Таблица 5
Р . 0,01 да глицил-L-пролива А 493 нм 0,18 и для 4 фенилазо-1-нафтиламида П 532 мм 0,80. Эти значения сопоставимы с теMKj которые были получены для п-нитроанилида глицил-L-пролина. П р и м е р 27. Была измерена скорость гидролиза п-фенилазоанилида глицил-1-пролина по методике примера 26 с применением человеческой сыворотки в качестве фермента. Однако холостая пробирка содержала воду вместо раствора фермента, как это было в экспериментальной пробирке, а стандартная; пробирка содержала 3 мМ раствор п-фенилазо-анилина вместо раствора фермента в экспериментальной пробирке. В результате скорость составила 18,7 г моль/мин/1 сыв. П р и м е р 28. По методике примера 22 была измерена активность Х-пропилдипептидиламинопептидазы, в качестве фермента использовали 88 и человеческую сыворотку и п-нитроанилид глицил-1-пролина в качестве субстрата. Результаты приведены в табл.4. Таблица 4
- 19
x4i c--,, ., ,
,. ,., .4 .-..
Early essential nyper tens ion Fixed essential
78685320
. Продолжение табл, 5
20
80,94+3,87
P 0,001
