СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХИ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно клинической биохимии, и может быть использовано для неинвазивной диагностики механической желтухи.

Известны способы диагностики холестаза, вызванного механической желтухой, по ферментному анализу крови, уровню билирубинемии (Р.Г.Хачатрян, Б.И.Альперович. Механическая желтуха. - Томск, издательство томского университета, 1994. - 304 с.).

Все эти методики связаны с забором крови у пациентов, что является инвазивной процедурой.

Технический результат: исключение инвазивного компонента путем разработки неинвазивного способа диагностики механической желтухи, ускорение, упрощение способа.

Указанный результат достигается путем замены исследуемой среды: вместо анализа крови, забранной из вены, проводят анализ слезной жидкости, в которой определяют показатели холестаза, и при значении щелочной фосфатазы, равном и выше 400,0 нмоль/(с·л), γ-глутамилтранспептидазы, равном и выше 700,0 нмоль/(с·л), лейцинаминопептидазы 52,5 Ед/л диагностируют механическую желтуху.

Способ осуществляют следующим образом: слезу у больного для исследования получают по методу, разработанному Терехиной Н.А. (Терехина Н.А., Петрович Ю.А., Батуева Р.А. Влияние метода сбора слезной жидкости на ее состав. / Лабораторное дело, 1989. - № 6. - С.27-30), который заключается в следующем: после поднесения к носу ваты, смоченной 10% раствором нашатырного спирта, собирают чистой пипеткой выделившуюся слезу у наружного угла глаза. Процесс забора слезы технически проще и быстрее, чем забор крови из вены.

Определяют в слезной жидкости активность лейцинаминопептидазы, щелочной фосфатазы, γ-глутамилтранспептидазы.

Количественное определение лейцинаминопептидазы (ЛАП) проводят кинетическим методом по Nagel [Nagel W et al. Klin Wschr 1964; 42: 446-469].

Принцип метода: содержащаяся в пробе ЛАП расщепляет 1-лейцил-р-нитроанилид до 1-лейцина и р-нитроанилида. Уровень образовавшегося 1-лейцина, измеренный фотометрически, пропорционален уровню ЛАП в исходной пробе.

Реагенты: набор реактивов «Quantitative determination of leucine aminopeptidase (LAP)» фирмы «SPINREACT, S.A.» - Испания.

1. Буферный раствор рН 7,2 - фосфат (100 ммоль/л).

2. Субстрат - 1-лейцил-р-нитроанилид (0,8 ммоль/л) растворяют в буферном растворе.

Приготовленный раствор стабилен 7 дней при температуре 2-8°С или 48 часов при комнатной температуре (15-25°С).

Ход работы: приготовленный раствор вносят в пробирки в объеме 1,5 мл. Затем добавляют исследуемую среду (слезу) в объеме 0,1 мл. Содержимое пробирки перемешивают и измеряют оптическую плотность через 1 минуту. Затем измеряют увеличивающуюся оптическую плотность ровно через 1, 2 и 3 минуты. Измерение проводится с помощью спектрофотометра PD-303 против воды при длине волны 405 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 см. Температура исследования 37°С.

Рассчитывают среднее изменение оптической плотности за минуту (ΔА/мин). Коэффициент для перевода полученных результатов в международные единицы: ΔА/мин × 1544=Ед/л ЛАП.

Количественное определение щелочной фосфатазы (ЩФ) проводят унифицированным методом по «конечной точке».

Принцип метода: содержащаяся в пробе ЩФ фосфатаза расщепляет п-нитрофенилфосфат в присутствии воды до п-нитрофенола и фосфата. Уровень образовавшегося п-нитрофенола, измеренный фотометрически, пропорционален уровню ЩФ в исходной пробе.

Реагенты: набор реактивов «Alcalin Phosphatase "FL"» фирмы «VITAL DIAGNOSTICS, SPb.» - Россия.

Реактив № 1. Глициновый буфер рН 10,4 - глицин (55 ммоль/л).

Реактив № 2. Раствор едкого натра (200 ммоль/л) разводят дистиллированной водой в 10 раз. Приготовленный раствор стабилен в плотно закрытой посуде.

Реактив № 3. п-Нитрофенилфосфат (27,6 ммоль/л).

Рабочий реагент готовят из реагентов № 1 и № 3, смешанных в пропорциях 4:1. Реагент стабилен не менее 10 дней при температуре 4°С в темноте или 3 месяца при температуре -20°С.

Ход работы. В 2 пробирки вносят реагент №2 в объеме 0,25 мл. Затем в опытную пробирку добавляют исследуемую среду (слезу) в объеме 0,025 мл. Содержимое пробирок перемешивают, инкубируют при температуре 37°С в течение 30 минут. В контрольную пробирку вносят 0,025 мл дистиллированной воды. Измеряют оптическую плотность с помощью спектрофотометра PD-303 против воды при длине волны 405 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 см.

Расчет активности фермента проводят по калибровочной кривой.

Количественное определение у-глутамилтрансферазы (γ-ГТП) проводят унифицированным методом по «конечной точке» (Szasz G., J.P. Persijn, et.al. Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 1974, vol. 12, p.228.)

Принцип метода: содержащаяся в пробе γ-ГТП расщепляет L-γ-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид в глицилглицине до L-γ-глутамилглицилглицина и 5-амино-2-нитробензоата. Количество образовавшегося в единицу времени 5-амино-2-нитробензоата пропорционально активности фермента в исходной пробе.

Реагенты: набор реактивов «γ-глутамилтрансфераза» фирмы «OLVEX DIAGNOSTICUM, SPb.» - Россия.

Реактив № 1. Буфер рН.

Реактив № 2. Раствор уксусной кислоты.

Реактив № 3. L-γ-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид.

Рабочий реагент готовят из реагентов № 1 и № 3, смешанных в пропорциях 4:1. Реагент стабилен 20 дней при температуре 2-8°С.

Процедура анализа. В 2 пробирки вносят реагент № 2 в объеме 0,25 мл. Затем в опытную пробирку добавляют исследуемую среду (слезу) в объеме 0,025 мл. Содержимое пробирок перемешивают, инкубируют при температуре 37°С в течение 15 минут. В контрольную пробирку вносят 0,025 мл дистиллированной воды. Измеряют оптическую плотность с помощью спектрофотометра PD-303 против воды при длине волны 405 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 см.

Расчет активности фермента проводят по калибровочной кривой. При значении щелочной фосфатазы, равном и выше 400,0 нмоль/(с·л), γ-глутамилтранспептидазы, равном и выше 700,0 нмоль/(с·л), лейцинаминопептидазы 52,5 Ед/л диагностируют механическую желтуху.

Проведено обследование 19 доноров и 17 больных механической желтухой различной этиологии (доброкачественной, злокачественной). Из них 8 с механической желтухой, вызванной опухолями различной локализации, и 9 больных с механической желтухой, вызванной желчно-каменной болезнью с холедохолитиазом.

Активность ферментов биологических сред доноров ЩФ (нмоль/(с·л))γ-ГТП (нмоль/(с·л))ЛАП (Е/л)Сыворотка крови317,9±28,6382,2±47,922,3±0,9Слеза153,1±21,7245,2±42,54,7±0,5

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Донор П., муж., 38 лет. На момент обследования здоров. Активность в крови ЩФ составила 280 нмоль/(с·л), γ-ГТП - 250 нмоль/(с·л), ЛАП - 20,1 Е/л. Активность в слезе ЩФ составила 250 нмоль/(с·л), γ-ГТП - 180 нмоль/(с·л), ЛАП - 3,1 Е/л. Значения активности ферментов в пределах допустимых норм.

Пример 2. Больная Р., 50 лет. Диагноз: ЖКБ. Хронический калькулезный холецистит, холедохолитиаз. Механическая желтуха. При поступлении беспокоит боль в правом подреберье, тошнота. Кожные покровы, склеры иктеричны. По данным УЗИ - конкременты в желчном пузыре, холедох расширен до 16 мм, содержит камень диаметром до 10 мм; закл.: ЖКБ, холедохолитиаз, механическая желтуха. Биохимический анализ крови: билирубин общий - 180 мкмоль/л, билирубин прямой - 83,1 мкмоль/л, ЩФ - 11802 нмоль/(с·л), γ-ГТП - 5020 нмоль/(с·л), ЛАП - 156,7 Е/л. Активность в слезе ЩФ составила 400 нмоль/(с·л), γ-ГТП - 840 нмоль/(с·л), ЛАП - 94,2 Е/л. Значения активности ферментов значительно превышают нормальные показатели, как в крови так и в слезе.

Пример 3. Больной П., 60 лет. Диагноз: Опухоль головки поджелудочной железы. Механическая желтуха. При поступлении жалоб не предъявляет. Кожные покровы, склеры желтушные. По данным УЗИ - образование головки поджелудочной железы диаметром до 4 см, признаки механической желтухи; закл: Опухоль головки поджелудочной железы, механическая желтуха. Биохимический анализ крови: билирубин общий - 420 мкмоль/л, билирубин прямой - 178 мкмоль/л, ЩФ - 3680 нмоль/(с·л), γ-ГТП - 30240 нмоль/(с·л), ЛАП - 162,1 Е/л. Активность в слезе ЩФ составила 970 нмоль/(с·л), γ-ГТП - 1540 нмоль/(с·л), ЛАП - 86,5 Е/л.

Значения активности ферментов превышают нормальные показатели как в крови, так и в слезе.

Пример 4. Больная Д., 64 лет. Диагноз: ЖКБ. Хронический калькулезный холецистит. Поступила на плановое оперативное лечение. При поступлении жалоб нет. По данным УЗИ - конкременты в желчном пузыре, холедох не расширен, однородный; закл.: ЖКБ, хронический калькулезный холецистит. Биохимический анализ крови: билирубин общий - 9,8 мкмоль/л, ЩФ - 400 нмоль/(с·л), γ-ГТП - 1000 нмоль/(с·л), ЛАП - 20,1 Е/л. Активность в слезе ЩФ составила 70 нмоль/(с·л), γ-ГТП - 110 нмоль/(с·л), ЛАП - 4,6 Е/л. Значения активности ферментов в пределах допустимых норм.

Положительный эффект: забор слезы для исследования является неинвазивным методом, для способа характерны простота выполнения, доступность, скорость выполнения анализа.

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической биохимии. В слезе у больного определяют ферменты-показатели холестаза: щелочную фосфатазу (ЩФ), γ-глутамилтранспетидазу (γ-ГТП), лейцинаминопептидазу (ЛАП). При значении активности ЩФ, равном и выше 400,0 нмоль/(с·л), γ-ГТП, равном и выше 700,0 нмоль/(с·л), ЛАП, равном и выше - 52,5 Е/л, диагностируют механический характер желтухи. Способ позволяет исключить инвазивный компонент в лабораторной диагностике желтух, упрощает проведение анализа и ускоряет диагностику. 1 табл.

Способ диагностики механической желтухи путем определения ферментов холестаза, отличающийся тем, что определяют ферменты холестаза в слезе и при значении щелочной фосфатазы, равном и выше 400,0 нмоль/(с·л), γ-глутамилтранспептидазы, равном и выше 700,0 нмоль/(с·л), лейцинаминопептидазы, равном и выше 52,5 Ед/л, диагностируют механическую желтуху.