КОМПЛЕКС 1:2 ГЕРМАНИЯ И 2,6-ПИРИДИНДИКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 2001 года по МПК C07F7/30 A61K31/555 A61P31/04 A61P37/02 

Изобретение относится к антибактериальным иммуномодулирующим препаратам, которые могут найти применение в медицине и ветеринарии.

Поддержание гомеостаза и сопротивляемость влиянию факторам окружающей среды, таким как инфекционные агенты, обусловливается в большой степени функционированием систем (прежде всего, иммунной системы), обеспечивающих неспецифическую сопротивляемость организма. Система интерферона является одной из важнейших частей неспецифического иммунитета. Интерфероны являются цитокинами, посредством которых происходят внутриклеточные и гуморальные реакции, направленные на поддержание гомеостаза организма (Grеsser, Cell Immunol., 977, 43, N 2, pp. 406-413; Stewart, The Interferon System, Springer-Verlag, N.Y., 1979; Соловьев и др., Интерфероны в медицинской теории и практике, М., Медицина, 1981, стр. 400). Система интерферона представляет собой совокупность клеточных элементов, способных продуцировать различные виды интерферона, изменяющих свои функциональные возможности под действием интерферона и таким образом реализуя внутриклеточные и гуморальные реакции, обеспечивая поддержание гомеостаза организма. Дефекты в системе интерферона приводят к нарушениям функции иммунной системы и, как следствие, к возрастанию риска развития некоторых инфекций и онкологических заболеваний. Избирательная модуляция интерферонов, индукторов интерферонов или других иммуномодуляторов некоторых частей иммунной системы, непосредственно участвующих в защите против того или иного заболевания, может приводить к коррекции иммунодефицита и дефицита интерферона и значительно повышать устойчивость организма к инфекционным заболеваниям (The Biology of the Interferon System. 1988. Proceedings of the Fifth Annual meeting of the International Society for Interferon Research (ISIR 88), Kyoto, Japan, 14-18 November, 1988, Tokyo, 1989, p. 503).

Новая группа препаратов - индукторы интерферона - нашла широкое применение в качестве препаратов, подавляющих инфекцию, и в качестве иммуномодулирующих препаратов. Индукторы интерферона содержат гетерогенные группы высоко- и низкомолекулярных соединений природного или синтетического происхождения. Такие препараты обладают широким спектром биологической активности: антибактериальной, противоопухолевой, иммунномодулирующей, радиозащитной и т. д. (Ершов и др., Интерферон и его индукторы, М., Медицина, 1980, стр. 173).

Известны препараты альфа-, бета- и гамма-интерферонов, которые, в зависимости от способа получения, делятся на природные (интерфероны первого поколения) и рекомбинантные (интерфероны второго поколения):
1. Природные интерфероны: препараты α-интерферона - человеческий лейкоцитарный интерферон, эгиферон, виллиферон; препараты β-интерферона - человеческий фибробластный интерферон, ферон; γ -интерферона - человеческий иммунный интерферон.

2. Рекомбинантные интерфероны: препараты α 2а-интерферона реаферон, реалдирон, роферон; препараты α 2b-интерферона - интрон, инрек; препараты α 2с-интерферона - берофор; препараты β -интерферона - бета-ферон; препараты γ -интерферона - гамма-ферон (Чекнев и др. Система интерферона в нормальном и патологическом состоянии, М., Медицина, 1966, стр. 196-221).

Существенный недостаток естественных интерферонов заключается в способе их получения из крови человека, который включает риск переноса гетерогенной генетической информации и вирусных инфекций. Рекомбинантные интерфероны не обладают такими недостатками и являются достаточно ценными в определенных клинических ситуациях. Однако наличие только одного подтипа интерферона в каждом конкретном препарате ограничивает область их применения. Все препараты интерферона индуцируют экзогенное образование интерферона в организме, что является их общим недостатком.

Известны индукторы интерферонов, используемые в клинической практике: синтетические соединения, такие как, например, амиксин (низкомолекулярное соединение ароматического ряда, относящееся к классу флуоренонов), неовир (низкомолекулярное соединение, относящееся к биоосновным гетероароматическим соединениям, к классу акридинонов). Известны природные соединения, такие как, например, мегазин (продукт конденсации госсипола через альдегидную группу с натриевой солью β -аминоэтилсерной кислоты), ларифан (РНК фага λ 2 с двойной спиралью); ридостин (РНК с двойной спиралью, полученная из лизата киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae) (Ершов и др. Антивирусные препараты. Санкт-Петербург, 1993, стр. 104). Преимущество этой группы заключается в ее способности индуцировать аутогенные интерфероны. Вышеуказанные индукторы интерферона, однако, индуцируют синтез только альфа- и бета-интерферонов. В настоящее время не известны достаточно эффективные индукторы гамма-интерферона, подходящие для применения в клинической практике.

Известно, что германий-органические соединения обладают различными видами биологической активности. Это препарат, известный как карбоксиэтилгерманий-сесквиоксид общей формулы [GeCH₂CH₂COOH]₂O₃, который способен при пероральном введении индуцировать продукцию интерферона в крови мышей. Позднее было показано, что препарат способен индуцировать синтез γ -интерферона в суспензии мононуклеарных клеток in vitro (Munakata et al, Interferon Res., 1987, v. 7, pp. 69-76). Однако он обладает токсичностью и имеет низкую эффективность в качестве индуктора иммунного интерферона. Сырья (германий-хлороформ) для его получения имеется недостаточно.

Германиевый комплекс 2,6- пиридиндиил-бискарбонилокси (гидроксипропоксигерманий), обладающий свойствами индуктора иммунного интерферона, описан Игнатенко и др. в Российском авторском свидетельстве N 1622989 от 22.09.90. Это вещество, однако, имеет узкий спектр иммуномодулирующей активности.

Таким образом, целью настоящего изобретения является создание нового препарата, обладающего антибактериальной, интерферон-индуцирующей и иммуномодулирующей активностью, который мог бы быть использован в медицине и ветеринарии для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, иммунодефицитных и интерферон-дефицитных состояний, и который не имел бы недостатков, присущих известным вышеуказанным аналогам.

Согласно изобретению, комплексы германия представляют собой насыщенную или ненасыщенную, карбоциклическую или гетероциклическую дикарбоновую кислоту, причем две карбоксильные группы находятся, соответственно, в 1 и 3 положениях кольца. Кольцо может иметь 0, 1 или 2 гетероатома, например N, O или S. Оно может быть 4-, 5-, 6- или 7-членным. Конкретным воплощением данного изобретения является бис (пиридин-2,6-дикарбоксилат) германия формулы I:

Новые соединения обладают антибактериальной, интерферон- индуцирующей и иммуномодулирующей активностями, что может найти применение в медицине и ветеринарии для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, иммунодефицитных и интерферон- дефицитных состояний.

Новые комплексы, согласно изобретению, могут быть получены путем взаимодействия кислоты, например 2,6-пиридиндикарбоновой кислоты, с тетраалкоксигерманием, предпочтительно тетраметоксигерманием или тетраэтоксигерманием. Тетраалкоксигерманий может быть получен непосредственно в реакционной смеси, например, из тетрагалогенида германия и алкоголята щелочного металла, например, тетрахлорида германия и метанолята (этанолята) натрия (получен путем растворения металлического натрия в метаноле (этаноле)).

Реакцию можно проводить в среде органического растворителя, такого как гексан, гептан, метанол или этанол; температура реакции находится обычно в области от 60 до 90^oC. Реакцию предпочтительно проводят в атмосфере инертного газа, такого как аргон или азот, время реакции около 3-5 ч. Целевой продукт выделяют обычными методами, например, фильтрацией и сушкой в вакууме, например, при 133,322 Па (1 Торр) при 40^oC.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента эффективное количество комплекса германия вместе с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или разбавителем. Фармацевтическая композиция может вводиться различными путями, такими как пероральный, парентеральный, интраназальный и т.д.

При пероральном применении композиция может использоваться в виде таблеток, водных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, а также в виде сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для перорального введения, могут быть получены любыми методами, известными в данной области, применяемыми для получения фармацевтических композиций. Такие композиции могут содержать один или несколько агентов, выбранных из подсластителей, ароматизаторов, красителей и консервантов, используемых в фармацевтических препаратах, обладающих хорошими эстетическими и вкусовыми качествами.

Таблетки могут содержать активный ингредиент в смеси с нетоксичными, фармацевтически приемлемыми наполнителями, которые обычно используются для приготовления таблеток. Указанные наполнители могут быть нейтральными разбавителями, такими как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция, гранулирующие и разрыхляющие агенты, например, кукурузный крахмал, производные целлюлозы или альгиновая кислота. Таблетки могут не иметь оболочку или могут быть покрыты известными способами, например, оболочкой, задерживающей процесс распада таблетки в желудочно-кишечном тракте, создавая пролонгирующий эффект. Водные суспензии могут содержать активный ингредиент в смеси с наполнителями, подходящими для приготовления водной суспензии.

Фармацевтическая композиция для парентерального введения, например подкожного или внутримышечного, может содержать стерильный раствор для инъекции в воде или физиологическом растворе. Для интраназального введения фармацевтическая композиция может содержать раствор комплекса германия в воде или физиологическом растворе.

Как будет понятно специалистам в данной области, применяемая доза комплекса будет зависеть от желаемого эффекта, например, иммуномодулирующего, интерферон-индуцирующего, антибактериального, а также от тяжести заболевания, возраста и состояния пациента. Обычно, однократная доза составляет от 0,05 мг/кг до 100 мг/кг. Число введений может колебаться от 1 до 4 в день.

Новый комплекс имеет низкую токсичность. В исследованиях острой токсичности на мышах ЛД₅₀ равно 900 мг на килограмм массы тела.

Конкретные примеры получения германий-органического соединения формулы I, его физико-химические характеристики, примеры фармацевтических композиций на его основе, а также результаты биологических испытаний представлены ниже.

Структура полученного соединения была подтверждена данными спектрального анализа (ИК, ¹H и ¹³C ЯМР, масс), чистота была подтверждена данными элементного анализа.

ИК спектр бис (пиридин-2,6-дикарбоксилат) германия получен на приборе "Bruker IFS 113v". ¹H ЯМР и ¹³C ЯМР были получены на спектрометре "Bruker AC-200". Масс-спектр (EU) был получен на приборе "Finnigan AT Incos 50" при 70 эВ.

Пример 1.

6,4 г (0,038 моль) 2,6-Пиридиндикарбоновой кислоты, 4,0 г (0,02 моль) тетраметоксигермания и 25 мл абсолютного метанола в атмосфере азота нагревали с обратным холодильником при энергичном помешивании при температуре кипения (64^oC) в течение 3 ч. Осадок отфильтровывали на Shott фильтре, промывали метанолом (2х10 мл) и высушивали при температуре 40^oC в вакууме (133,322 Па - 1 Торр) в течение 3 ч. Выход составлял 6,88 г (90%) соединения на основе 2,6-пиридиндикарбоновой кислоты.

Полученное соединение представляло собой бесцветные кристаллические иглы с температурой плавления 303-305^oC (разложение). Оно средне растворимо в воде, диэтилформамиде и диметилсульфоксиде и нерастворимо в углеводородах, хлороформе, сложном эфире, этаноле.

ИК (v, см^-1 таблетки в KBr): 667, 768, 922, 1095, 1148, 1304, 1368, 1493, 1600, 1732, 3097, 2800-3100.

¹H ЯМР ( δ, м.д., 200, 13 МГц, D₂O): 8,35 (м, 6Н, Н-ароматические).

¹³C ЯМР ( δ, м.д., 50,32 МГц, D₂O): 129,7 ( β -C, 143,2 ( ν - C), 147,8 ( α -C), 167,4 (C=О).

Масс-спектр (m/z), (⁷⁴Ge): 360 [M-CO₂]+, 272, 228, 195, 171, 154, 139, 122, 112, 93, 84, 77.

Элементный анализ для C₁₄H₆GeN₂O₈:
Найдено,%: C 41,47; H 1,68; Ge 17,86; N 6,60.

Вычислено,%: C 41,75; H 1,50; Ge 18,02; N 6,95.

Молекулярная масса 402,76.

Пример 2
К 1,1 г (0,048 моль) Na и 25 мл абсолютного метанола при комнатной температуре в атмосфере азота добавляли 2,6 г (0,012 моль) тетрахлоргермания в течение 5 мин. Реакционную массу нагревали с обратным холодильником в течение 1,5 ч, затем охлаждали до 20^oC. Осадок (NaCl) отфильтровывали на Shott фильтре и промывали метанолом (3х15 мл). К полученному фильтрату, содержащему раствор тетраэтоксигермания в этаноле, добавляли 3 г (0,18 моль) 2,6-пиридиндикарбоновой кислоты. Далее обрабатывают, как описано в Примере 1. Выход составлял 3,45 г (95%) в расчете на 2,6-пиридиндикарбоновую кислоту.

Спектральные характеристики соединения, полученного этим путем, по существу такие же, как описаны выше в примере 1.

Пример 3
Раствор для инъекции готовили путем растворения бис(пиридин-2,6-дикарбоксилата) германия в воде при комнатной температуре. Одна ампула этого раствора содержит:
Бис(пиридин-2,6-дикарбоксилат) германия - 0,01 г
Вода для инъекций - 2 мл
Пример 4
Таблетки готовили путем растирания компонентов в ступке и формования в прессовочной машине. Одна таблетка содержит:
Бис(пиридин-2,6-дикарбоксилат) германия - 25 мг
Натрий метилцеллюлоза - 350 мг
Сахароза - 125 мг
Исследование индукции α,β,γ-интерферонов в мышиной сыворотке in vivo
Самцам мышей СВА массой 12-14 г прививали внутрибрюшинно соединение I в виде водного раствора в дозах 0,005-50 мг/кг. Уровень синтеза интерферона в сыворотке крови определяли с различными интервалами (5, 24, 48, 72 ч). Титрование интерферона проводили в L-929 клеточных культурах. Тест-вирусом являлся вирус мышиного энцефаломиокардита. Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, соединение I индуцировало продукцию сывороточного интерферона, причем в первые 5 ч после прививки были выявлены интерфероны α и β, а в последних интервалах - γ-интерферон. Оптимальная доза соединения составляла 0,5 мг/кг.

Исследование действия на клетки, чувствительные к интерферону.

(а) Клеточную культуру диплоидных фибробластов человека (М-19), высокочувствительную к интерферону, засевали в лунки 96-луночной плашки со средой Игла с 10%-ной телячьей эмбриональной сывороткой. На третий день роста культуре прививали соединение I в количестве 1 мкг/мл. После 24-часовой инкубации (37^oC, 5% CO₂), проводили титрование α- интерферона (реаферон с начальной активностью 2•10⁶ ИЕ/мл против 100 TCD вируса везикулярного стоматита). Восприимчивость клеток к интерферону определялась путем цитопатического действия на вирус. Результаты представлены в таблице 2.

(б) Клетки непрерывной линии J-41 с пониженной чувствительностью к α- интерферону засевали в концентрации 10⁵ клеток/мл в 96-луночную плашку со средой 199 с 10% телячьей эмбриональной сывороткой. На следующий день добавляли в культуру соединение I в количестве 1 мкг/мл. Титрование интерферона и определение чувствительности проводят, как описано выше в (а).

Как видно из таблицы 2, после 24-часовой обработки клеток М-19 соединением I, чувствительность клеток к α-интерферону (реаферон) возрастала в 8 раз. После 24-часовой обработки клеток J-41 соединением I их чувствительность к интерферону возрастала в 4 раза.

Вышеуказанные результаты показывают, что соединение может использоваться в клинической практике для коррекции интерферона и усиления чувствительности пациентов к препаратам интерферона.

Исследование действия на гемопоэтические стволовые клетки
Соединение I разбавляли физиологическим раствором в концентрации 2,5 или 0,5 мкг/мл. Мышам экспериментальной группы прививали внутрибрюшинно 0,2 мл один из полученных растворов (0,5 и 1 мкг/мышь, соответственно). Контрольным животным вводили инъекции физиологического раствора. В 1, 2, 3, 4 и 7 дни после введения исследуемого соединения животным вводили гепарин (40 единиц/мышь) и затем брали образцы периферической крови, селезенки и костного мозга из бедренной кости. Кровь разводили 1:1 физиологическим раствором. Суспензии костного мозга и селезенки готовили обычным методом. Содержание гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в крови, костном мозге и селезенке животных, обработанных препаратом, исследовали методом экзогенного колонеообразования в селезенке сингенных летально облученных реципиентов; более конкретно, разбавленную периферическую кровь (0,1 мл), клетки костного мозга (3-5 • 10⁴ клеток) или клетки селезенки (5•10⁵ клеток) прививали летально облученным сингенным реципиентам, которых забивали на 8-9 день; их селезенки извлекали, фиксировали в растворе Боуина и подсчитывали количество видимых бляшек или развивающихся колоний ГСК.

Для определения действия препарата на пролиферацию ГСК, суспензию клеток костного мозга или клеток селезенки обрабатывали in vitro оксимочевиной в количестве 1 мг/мл в течение 2 ч при 37^oC перед прививанием облученным реципиентам. Количество ГСК, перешедших в S-фазу, определялось формулой: A=(a-b) • 100/a, где a - количество ГСК колоний без обработки оксимочевиной и b - количество ГСК колоний, обработанных оксимочевиной. Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, соединение I увеличивает количество ГСК в крови. Было показано, что отсутствует способность стимулировать выход ГСК в S-фазу.

Исследование стафилококковой активности
Препарат прививали подкожно мышам СВА в дозах от 0,1 до 10 мкг на мышь, после чего животному прививали 1,25 • 10⁵ микробных клеток Staphylococcus aureus Wood 46. Степень выживания определяли как процент по отношению к контрольной группе мышей, которые не получали соединения I. Результаты были, соответственно, 39,8%, 60,0% и 80,7% при дозах 0,1, 1,0 и 10,0 мкг. Таким образом, доза 1 мкг повышает устойчивость мыши к стафилококку.

Исследование противогриппозной активности
Модельная система была экспериментальной инфекцией гриппа у мышей, вызванной лабораторным штаммом WSN вируса гриппа A (H1N1). Вирус развивался в течение 9 дней в куриных эмбрионах. Мышам C57B1/6 под действием эфирного наркоза прививали интраназально каждой 50 мкл ЛД₅₀ вируса, разбавленного 1: 100. Препарат был привит в дозе 100 мкл (20 мкг/мышь) внутримышечно в день инфицирования. Контрольная группа животных получала раствор плацебо. Каждая группа состояла из 10 самцов мышей массой 14-16 г. Смерть животных регистрировали каждый день в течение 14 дней, и в конце эксперимента были определены среднее время выживаемости и летальность. Данные представлены в таблице 4.

Вышеуказанные данные показывают высокое противогриппозное действие.

Исследование клинической эффективности на собаках, пораженных чумкой
Собакам с установленным диагнозом чумки (продолжительность заболевания от 10 до 30 дней; у 3 животных - кишечная форма болезни, у 2 - легочная форма и у 3 животных нейропаралитическая стадия) прививали внутримышечно 2-4 мл (зависит от массы животного) 0,5% раствор исследуемого соединения I в дистиллированной воде дважды в день в течение 3-10 дней. После этого курса лечения все животные выздоровели.

Описывается новый германиевый комплекс германия и ароматической или неароматической, циклической или гетероциклической 1,3-дикарбоновой кислоты, например, бис(пиридин-2,6-дикарбонат)германия, обладающий антибактериальной интерферониндуцируемой и иммуномоделирующей активностью. Описывается также способ его получения и фармацевтическая композиция. 3 с. и 1 з.п.ф-лы, 4 табл.

1. Комплекс 1:2 германия и 2,6-пиридиндикарбоновой кислоты. 2. Комплекс по п.1, который представляет собой бис(пиридин-2,6-дикарбоксилат)германия. 3. Фармацевтическая композиция, обладающая антибактериальной, интерферон-индуцирующей и иммуномоделирующей активностью, включающая активный ингредиент и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента содержит эффективное количество комплекса германия по п.1. 4. Способ получения комплекса по п. 1 или 2, который заключается во взаимодействии тетраметоксигермания или тетраэтоксигермания с 2,6-пиридиндикарбоновой кислотой.