ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЦИТОКИНОВОГО И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ Российский патент 2004 года по МПК A61K38/19 A61K39/39 A61P37/00 

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается медико-биологических лекарственных препаратов и их композиций, обладающих цитокиновым и иммуномодулирующим действием, используемых для профилактики и лечения заболеваний, обусловленных нарушениями иммунологических функций. Так как любая патология имеет в своей основе или связана с изменением реакций системы иммунитета, лекарственное средство согласно изобретению может быть применено во всех областях клинической медицины, наиболее важных из них: стоматология, ЛОР, дерматология, аллергология, иммунология, офтальмология и др.

Достижения современной иммунологии и молекулярной биологии позволили выявить ряд биологически активных веществ, которые с успехом могут использоваться для коррекции патологических состояний, обусловленных нарушениями функций иммунной системы.

Эти вещества названы цитокинами, т.е. вырабатываемые клетками (cytos-клетка). Цитокины - это низкомолекулярные белки, вырабатываемые преимущественно активированными клетками иммунной системы. Они являются медиаторами межклеточных коммуникаций при иммунном ответе, гемопоэзе, воспалении, а также межсистемных взаимодействиях. Известные в настоящее время цитокины подразделяются на четыре основных типа: иммуномодуляторные, хемотактильные, регуляторы фиброгенеза, пептидные факторы роста. Обладая широким спектром биологической активности, они определяют не только адекватный уровень иммунореактивности, но и регулируют взаимодействия главных биологических интегративных систем организма: нервной, иммунной и эндокринной. Структура и механизм действия большинства цитокинов достаточно полно охарактеризованы. С использованием методов генной инженерии и современной биотехнологии многие цитокины в настоящее время получают в виде рекомбинантных (биоинженерных) препаратов, полностью идентичных эндогенным молекулам, а количества выделяемых цитокинов достаточны для их клинического применения.

В настоящее время иммунотерапия рекомбинантыми цитокинами и препаратами на их основе является одним из наиболее перспективных и постоянно расширяющихся направлений иммунофармакологии (1. Ройт А. Основы иммунологии (пер. с англ. ). - М.: Мир, 1991. 328 с.; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А. А. Эндогенные иммуномодуляторы. - СПб: Гиппократ, 1992. 256 с.; Фрейдлин И.С. Система мононуклеарных фагоцитов. - М.: Медицина, 1984. 272 с.).

При использовании рекомбинантных цитокинов и препаратов на их основе эффективность иммунотерапии значительно возрастает, обеспечивая адекватную и целенаправленную медикаментозную коррекцию иммунных дисфункций. Вводимые в организм цитокины, восполняя дефицит эндогенных регуляторных молекул, полностью воспроизводят их эффекты. Это особенно важно в условиях тяжелой или хронической патологии, когда применение традиционных иммуномодуляторов или индукторов синтеза цитокинов бесполезно из-за истощения компенсаторных возможностей иммунной системы.

Однако препараты на основе цитокинов не удовлетворяют клиницистов, поскольку имеют много недостатков: быстрое разрушение в организме, что вынуждает значительно увеличивать дозу и частоту введения; плохое прохождение в ткани; побочные, в том числе аллергические, реакции и пр. Это диктует необходимость поиска новых лекарственных форм применения цитокинов для достижения лучшего биологического эффекта. Одним из результатов такого поиска было создание пегилятов, то есть соединений цитокинов, в первую очередь интерферонов, с "полиэтиленгликолем" (далее - ПЭГ) (Clin Pharmacokinet 2001; 40(7): 539-51. Pegylation: a novel process for modifying pharmacokinetics. Harris JM, Martin NE, Modi М.). Этот процесс получил название "пегилирование".

ПЭГ - в данном случае название собирательное для множества изомеров полиэтиленгликоля, а также его химических модификаций (оксиды ПЭГ - полиэтиленоксид, ацетаты и др.). ПЭГ - химическое вещество, обладающее свойствами, которые позволяют использовать его в качестве носителя для биоорганических молекул или соединений. Например, на нем (в нем) агломерируются молекулы, что позволяет создавать депо лекарственного вещества. Кроме того, вследствие локальной повышенной концентрации действующего вещества усиливается его проведение внутрь тканей. ПЭГ и соединения на его основе широко используются в косметологии (А. Н. Децина. Теория мягких косметологических воздействий. Современная косметология. - Новосибирск, 2001, 507 с.). Пегилирование позволяет пролонгировать действие цитокинов: получить длительный терапевтический эффект при однократном применении лекарственного средства; избежать колебаний концентрации лекарственных веществ в крови, вызывающих нежелательные побочные явления; снизить токсичность лекарственного вещества (О.Н. Минушкин, Л.В. Масловский. Этиотропная терапия хронических вирусных гепатитов. - "Кремлевская медицина. Клинический вестник", 2000, 1).

Известны, например, следующие виды пегилятов:
1) Фармацевтическая композиция цитокинового и иммуномодулирующего действия, активное вещество которой состоит из эритропоэтина (цитокин), а ПЭГ используется в качестве носителя (дополнительное химическое вещество, которое выполняет функцию улучшения лекарственной формы) (BrJ Haematol 1999 Jan; 104(1):119-26. The in vitro effect of pegylated recombinant human megakaryocyte growth and development factor (PEGrHuMGDF) on megakaryopoiesis in patients with aplastic anaemia. Brereton ML, Adams JA, Briggs M, Liu Yin JA.; (Clin Pharmacokinet 2001;40(7):539-51. Pegylation: a novel process for modifying pharmacokinetics. Harris JM, Martin NE, Modi M.).

2) Фармацевтическая композиция цитокинового и иммуномодулирующего действия, активное вещество которой состоит из мегакариоцитарного ростового фактора (цитокин), а ПЭГ используется в качестве носителя (BrJ Haematol 1999 Jan; 104(1):119-26. The in vitro effect of pegylated recombinant human megakaryocyte growth and development factor (PEGrHuMGDF) on megakaryopoiesis in patients with aplastic anaemia. Brereton ML, Adams JA, Briggs M, Liu Yin JA. ).

3) Фармацевтическая композиция цитокинового и иммуномодулирующего действия, активное вещество которой состоит из интерферона альфа (цитокин), а ПЭГ используется в качестве носителя (Blood 2001 Sep 15;98(6):1708-13. Phase 1 study of polyethylene glycol formulation of interferon alpha-2B (Schering 54031) in Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia. Talpaz M, O'Brien S, Rose E, Gupta S, Shan J, Cortes J, Giles FJ, FaderI S, Kantarjian HM.; Rev Clin Esp 2001 Apr;201(4):205-12. [Pegylated interferons: preliminary review of their pharmacokinetic characteristics.] Azanza Perea JR. ; BioDrugs 2001; 15(7):419-29. Kozlowski A, Charles SA, Harris JM. Development of pegylated interferons for the treatment of chronic hepatitis C. BioDrugs. 2001; 15(7):419-29. Review. PMID: 11520253 [PubMed - indexed for MEDLINE].

В примерах приведенных ссылок, освещающих как частные примеры конъюгатов, так и общие принципы соединения "цитокин-ПЭГ", ПЭГ присоединяется к цитокину ковалентной связью (конъюгация), в результате чего получается химическое вещество - конъюгат ПЭГ-цитокин. В качестве ПЭГ выступает полиэтиленгликоль или его дериваты (продукты на его основе, также служащие в виде инертных носителей).

Действие пегилятов по отношению ко всем цитокинам не изучено, в основном - это интерфероны. Но доказано, что за счет пегилирования не происходит достаточного улучшения биологического эффекта, отсутствует модуляция цитокинового эффекта, а также не проявляются какие-либо новые дополнительные биологические свойства фармкомпозиции, не присущие входящим в нее цитокинам, их соединениям и ПЭГ.

Полностью доказано, что характер и частота эффектов и отклонений лабораторных показателей сходны как при употреблении ПЭГ-интерферона, так и обычного интерферона, что свидетельствует о том, что пегилирование не улучшает и не расширяет иммуномодулирующего эффекта цитокинов (Ready KR, Weight TL, Pockros PS et al. Efficacy and safety of pegylated (40-kd) interferon alpha-2a compared with interferon alpha-2a in noncirrhotic patients with chronic hepatitis С (Эффективность и безопасность применения ПЭГ-(40-kd) интерферона альфа-2а в сравнении с интерфероном альфа-2а у пациентов с хроническим гепатитом С без цирроза печени). Hepatology 2001 Feb; 33(2): 433-438).

Наиболее близким лекарственным веществом того же назначения к заявленному изобретению по совокупности признаков является ПегИнтрон (международное непатентованное наименование - Пегинтерферон-2b): фармацевтическая композиция цитокинового и иммуномодулирующего действия, активное вещество которой состоит из рекомбинантного интреферона альфа-2b (цитокин), конъюгированного с монометоксиполиэтиленгликолем (ПЭГ), используемого в качестве носителя.

Фармакологическое действие. Обладает иммуностимулирующим и иммуномодулирующим свойствами (ПегИнтрон обладает иммуномодулирующим действием как интерферон альфа-2б (противовирусное действие)). Биологическая активность пегилированных изомеров в качественном отношении сходна с таковой свободного интерферона альфа-2б, но более слабая. Связываясь с клеточной оболочкой, интерферон инициирует последовательность внутриклеточных реакций, которые включают в себя индукцию определенных ферментов, что приводит к подавлению репликации вируса в инфицированных клетках, ингибированию пролиферации клеток, усилению фагоцитарной активности макрофагов и специфичной цитотоксичности лимфоцитов в отношении клеток-мишеней.

Показания. Гистологически подтвержденный хронический гепатит С (в качестве монотерапии при непереносимости рибавирина или наличия противопоказаний к его применению).

Противопоказания. Гиперчувствительность (в т.ч. к др. интерферонам), аутоиммунный гепатит, аутоиммунное заболевание в анамнезе; нарушение функции щитовидной железы, не поддающееся медикаментозной коррекции; тяжелые нарушения функции почек и/или печени, тяжелое психическое заболевание, выраженные психические нарушения в анамнезе, эпилепсия и др. нарушения функции ЦНС, беременность, период лактации, детский и подростковый возраст до 18 лет (безопасность и эффективность применения не изучались). С осторожностью: застойная сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, аритмии, хронические обструктивные заболевания легких, нарушения свертываемости крови, в т.ч. тромбофлебит, тромбоэмболия легочной артерии, выраженная миелодепрессия, псориаз, сахарный диабет, склонный к развитию кетоацидоза.

Побочные эффекты:
Со стороны нервной системы: головокружение, гиперестезия, парестезия, эмоциональная лабильность, нервозность, сонливость, депрессия; редко - суицидальные мысли и попытки самоубийства, возбуждение, спутанность сознания.

Со стороны пищеварительной системы: сухость во рту, метеоризм, рвота, диарея или запор и др. диспепсические явления; редко - боли в правом подреберье, гепатопатия. Со стороны сердечно-сосудистой системы: снижение или повышение артериального давления, аритмия.

Со стороны дыхательной системы: заложенность носа, синусит; редко - кашель, одышка, инфильтраты в легких неясной этиологии.

Со стороны органов чувств: конъюнктивит, в редких случаях - боль в глазах, снижение остроты или ограничение полей зрения, кровоизлияния в сетчатку, очаговые изменения сетчатки, обструкция артерии или вены сетчатки, нарушение слуха.

Со стороны эндокринной системы: нарушение функции щитовидной железы, сахарный диабет, нарушения менструального цикла (включая меноррагию).

Аллергические реакции: зуд, сухость кожи, сыпь, крапивница, эритема, ангионевротический отек, бронхоспазм, анафилактический шок.

Лабораторные показатели: нейтропения, гранулоцитопения, тромбоцитопения, появление аутоантител.

Прочие: недомогание, потливость, лихорадка, боль в груди, гриппоподобный синдром, вирусные инфекции, приливы, снижение либидо.

Взаимодействие. Фармацевтически не совместим с другими лекарственными средствами. Однократное введение препарата не оказывает влияния на активность цитохромов CYP1A2, CYP2C8/C9, CYP2D6 и печеночных CYP3A4 и N-ацетилтрансферазы. Однако необходимо иметь в виду, что другие формы интерферона альфа вызывали снижение клиренса теофиллина (который является субстратом CYP1A2) на 50% и увеличение его концентрации в плазме в 2 раза. При одновременном применении с рибавирином признаков фармакокинетического взаимодействия не выявлено.

В 2000 г. группой EORTC (European Organization for Research and Treatment of Cancer) по изучению меланомы было начато исследование эффективности ПегИнтрона в качестве средства адъювантной терапии больных IIB-III стадиями меланомы.

Известно, что препарат переносился неудовлетворительно. Более чем у 1/3 пациентов приходилось снижать дозы и/или делать перерывы в связи с токсическими эффектами, характерными для интерферонотерапии; всего же у 77% пациентов во время терапии отмечалась токсичность 3-4 степени (American Joint Committee on Cancer. Manual for Staging of Cancer, 4th edn. JB Lipincott Co. , Philadelphia, 1992, pp. 143-148. Kirkwood JM, Strawderman MH, Ernstoff MS et al. Interferon alfa-2b adjuvant therapy of high-risk resected cutaneous melanoma: the Eastern Cooperative Oncology Group trial. J Clin Oncol 1996; 14: 7-17. Grob JJ, Dreno В, de la Salmoniere P et al. Randomised trial of interferon a2a as adjuvant therapy in resected primary melanoma thiker than 1.5 mm without clinically detectable node metastases. Lancet 1998, 351: 1905-1910. Pehamberger H, Soyer HP, Steiner A et al. Adjuvant interferon a2a treatment in resected primary stage II cutaneous melanoma. J Clin Oncol 1998, 16: 1425-1429).

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при применении известной фармацевтической композиции, принятой за прототип, относится то, что несмотря на некоторые преимущества по сравнению с непегилированными цитокинами данный препарат недостаточно активен, отсутствует модуляция цитокинового эффекта и тормозятся ей способствующие механизмы, имеются нежелательные побочные эффекты. Это объясняется, в частности, тем, что ПЭГ - инертен как иммуномодулятор (не имеет собственного положительного биологического действия). ПЭГ просто служит структурной решеткой и позволяет получать конгломераты молекул, но сам не является иммуномодулятором (кроме того, сам по себе ПЭГ может быть токсичным).

Предлагаемое изобретение решает задачу расширения арсенала эффективных биологически активных средств.

Поставленная задача решается созданием новых более эффективных иммунотерапевтических препаратов на основе цитокинов, обладающих модуляцией цитокинового эффекта, а также новыми дополнительными биологическими свойствами.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что активное вещество известной фармацевтической композиции цитокинового и иммуномодулирующего действия, состоящее из, по крайней мере, одного цитокина, дополнительно содержит сополимер N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида.

Сополимер N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида (далее - СОПОЛИМЕР), используемое для иммунокоррекции химически синтезируемое вещество (торговое название ПОЛИОКСИДОНИЙ, разрешен к применению с 1996 г., регистрационный номер 96/302/9, Фармакопейная статья ФС 42-3906-00).

Сам по себе СОПОЛИМЕР обладает многочисленными иммуномодулирующими эффектами (Механизм действия и клиническое применение отечественного иммуномодулятора полиоксидония. - Москва, Государственный научный центр - Институт иммунологии МЗ РФ, 2001 г., 110 с.), но поскольку не схож ни с одной из известных молекул цитокинов, цитокиновым действием не обладает. Следует обратить внимание на выраженный положительный эффект СОПОЛИМЕРА как адъюванта - средства, усиливающего иммунный ответ на определенный, добавленный и/или присоединенный к нему антиген.

Итак, СОПОЛИМЕР - это активное вещество, которое усиливает (улучшает фармакодинамику и фармакокинетику цитокина) и модулирует (регулирует и модифицирует) цитокиновый эффект, а также сам обладает активными свойствами в отношении регуляции иммунитета. За счет этого в фармацевтической композиции согласно изобретению при взаимодействии активных веществ (цитокин - СОПОЛИМЕР) проявляются новые дополнительные биологические свойства, которые не присущи активным веществам (цитокин и СОПОЛИМЕР) фармкомпозиции, а являются результатом нового биологически активного комплекса (смеси и/или соединения биологически активных молекул). Модуляция - это регуляция: приведение к оптимальному соотношению количества и функций цитокина(ов) применительно к данному состоянию организма.

Получение при использовании изобретения технического результата, заключающегося в модуляции цитокинового эффекта, а также проявлении фармацевтической композицией новых дополнительных биологических свойств, демонстрируется следующими примерами.

Пример 1
Проведена оценка кинетики вируса гепатита С (HCV) и клинических данных при терапии интерфероном альфа-2б (реальдирон), ПЕГ-интерфероном альфа-2б (ПегИнтрон) и смесью интерферона альфа-2б с Сополимером.

Обследовано 38 пациентов хроническим гепатитом С. Всех пациентов разделили на 4 группы. 1 группа (12 человек) получала препарат Реальдирон (интерферон альфа-2б) по 3 млн ME трижды в неделю. 2 группа (10 человек) получала ПегИнтрон по 1 мкг/кг веса 1 раз в неделю. 3 группа (10 человек) получала смесь Реальдирона (5 млн ME) и Сополимера (0,012 г) 1 раз в неделю. 4 группа (6 человек) получала Сополимер (0,006 г) 3 раза в неделю.

Эффективность лечения оценивали, определяя с помощью реакции ПЦР (полимеразной цепной реакции) РНК HCV на протяжении 12 недель после начала терапии.

Полученные данные сопоставляли с данными общеклинического обследования.

Через 2, 6, 12 недель производили исследование содержания РНК HCV в сыворотке крови пациентов.

Снижение концентрации РНК HCV (содержание вируса в крови) через 2 недели от начала лечения отмечено у 13 процентов больных 1 группы, 18 процентов - 2 группы, 29 процентов 3 группы. В 4 группе снижения РНК HCV не отмечено, в связи с чем больные переведены на стандартное лечение.

Установлено, что в группе, получавшей интерферон по стандартной схеме (1 группа), время достижения полной негативности по виремии (полного исчезновения вируса из крови) превышало 12 недель, ПегИнтрон (2 группа) - от 42 до более 84 дней, интерферон + сополимер (3 группа) - от 25 до 45 дней.

Биохимический ответ в 1-й и 2-й группах был практически одинаковым. В 3-й группе уровень трансаминаз к концу 2-й недели был недостоверно выше, чем в первых двух группах, однако в дальнейшем был достоверно ниже (Р<0,05).

Выраженные побочные эффекты, требующие медицинского вмешательства, развились у 8 из 12 (66%) пациентов 1-й группы, у 5 из 10 (50%) пациентов 2-й группы и у 3 из 10 (33%) больных 3-й группы.

Кроме того, у 6 больных 1-й группы (50%), 5 больных 2-й группы (50%) и 1 больного 3-й группы (10%) отмечено нарушение всасывания в кишечнике, сопровождаемое стеатореей. Характер и частота побочных эффектов и отклонений лабораторных показателей были сходными во всех группах.

Сополимер в указанном исследовании в отдельности противовирусным эффектом не обладал. Противовирусным эффектом в разной степени обладали препараты Интерферона альфа-2в. Наибольшим эффектом обладала комбинация Интерферон (Реальдирон) + Сополимер. Интерферон (Реальдирон) в отдельности обладал менее выраженным эффектом.

Таким образом, если просто суммировать эффект Сополимера и Интерферона в группах 1 и 4, то эффект будет равен изолированному использованию Интерферона. Тогда как смесь Сополимера с Интерфероном обладала значительно более выраженным эффектом. Следовательно, в данном случае речь идет о получении синергического сверхсуммарного противовирусного эффекта. При этом следует указать, что соединение Интерферона с другим носителем (ПЭГ - полиэтиленгликоль) (группа 2) такого эффекта не давало.

Исходя из данных примера можно заключить, что Сополимер усиливает противовирусное действие ИФН и за счет этого идет снижение уровня трансаминаз. Краткое повышение свидетельствует о массивном разрушении вируса и клеток, пораженных вирусом, что доказывает синергизм действия.

Снижение уровня всасываемости и стеаторея - это последствия поражения печени и поджелудочной железы, в данном случае, вирусом. Уменьшение выраженности этих симптомов - следствие успешного лечения, в первую очередь, элиминации вируса.

Так же, как и в отношении трансаминаз, уменьшение выраженности этих симптомов в первую очередь связано со снижением концентрации вируса и, как следствие, уровня поражения печени под влиянием Интерферона. Согласно примеру (группа 3) наибольшее улучшение достигнуто при использовании композиции Интерферон-Сополимер, что никак не связано с прямым действием Сополимера на вирус, а достигается усилением эффекта Интерферона.

Побочные эффекты - новое качество, снижение токсичности. Сополимер - антиоксидант, но он не обладает прямой противовирусной активностью; интерферон - токсичен.

Таким образом, при использовании смеси сополимер - интерферон альфа-2б наблюдается более выраженный клинический и биохимический эффект по сравнению с другими способами интерферонотерапии, а также проявляются новые дополнительные биологические свойства фармацевтической композиции: устранение побочного эффекта интерферона альфа-2, значительное усиление противовирусного действия, уменьшение деструкции тканей.

Пример 2
Активность интерферона альфа-2в (Реальдирон) изучали in vitro по общепринятой методике угнетения цитопатогенного действия (ЦПД) вируса везикулярного стоматита (ВВС) в культуре клеток Л41 (лимфоидные клетки человека) и выражали в международных единицах МЕ/мл. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы, сополимер не обладал интерфероноподобным действием и не оказывал угнетающего влияния на цитопатогенное действие вируса. Интерферон альфа-2в таким эффектом обладал. А вот смесь Интерферон-Сополимер давала резко выраженный эффект, который более чем в 2 раза превосходил эффект Интерферона.

Таким образом использование смеси Цитокин (Интерферон альфа-2в) - Сополимер давало выраженный сверхсуммарный эффект.

Пример 3
Изучение противовирусной активности смеси Интерферона альфа-2б и Сополимера
Проведено изучение Препарата смеси Интерферона альфа-2б и Сополимера с целью выявления как прямого его антивирусного действия, так и опосредованного посредством индукции интерферона клетками.

Для этого в опыте использовали культуру клеток Тr (перевиваемые клетки трахеи крупного рогатого скота) с тест-вирусом VVS (вирус везикулярного стоматита) в рабочей дозе. Препарат смеси Интерферона альфа-2б и Сополимера, Контроли: 1. Сополимер (1 мкг/мл), 2. Интерферон альфа-2б (Реальдирон - 300 МЕ/мл) в количестве по 0,2 мл вносили в пробирки за 30 минут до и после внесения тест-вируса. Опыт сопровождали контролями культуры клеток - ЦПД без внесения Препаратов и вируса (3) и вируса - ЦПД без внесения препаратов (4) и препаратов - ЦПД без внесения вируса (5, 6, 7). Учет производили после срабатывания вируса в контроле. Результаты представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы, ни один из препаратов не обладал собственным цитопатогенным действием (контроли 5, 6, 7). При внесении вируса без препаратов цитопатогенный эффект (разрушение клеток-мишеней) был максимально выражен. Как видно из таблицы, внесение Сополимера в культуру клеток до заражения давало снижение цитопатогенного эффекта вируса. Внесение после заражения такого эффекта не давало. Использование Интерферона давало равный эффект как до заражения клеток, так и после внесения вируса. Наибольшей активностью обладала смесь Сополимера и Интерферона, когда использование препарата позволяло снять цитопатогенное действие вируса при внесении препарата до заражения и значительно снизить его при внесении после заражения.

Таким образом, смесь Интерферона и Сополимера обладала значительным сверхсуммарным эффектом.

Пример 4
Определение биологической активности препаратов эритропоэтина с использованием нормоцитемических мышей
Исследование основано на измерении стимуляции образования ретикулоцитов у нормоцитемических мышей и выполнено в соответствии с требованиями Фармакологической статьи ФС 42-3658-98 от 11.02.1999 г.

За 2 дня до начала исследования рассаживали мышей линии F1 (CDF*C57BL) 7-9 недельного возраста по 6 животных в каждую клетку.

Готовили растворы: рекомбинантного эритропоэтина человека + Полиэтиленгликоль (м.в. 2000) (далее ЭПО-ПЭГ), рекомбинантного эритропоэтина человека + Сополимер (далее ЭПО-ПОЛ) и стандартного, промышленного образца человеческого рекомбинантного эритропоэтина ("Эритростим", далее СОЭ) в фосфатно-альбуминовом буере (рН 7,2) с концентрациями: 80, 40 и 20 МЕ/мл.

Каждой группе мышей вводили подкожно по 0,5 мл раствора одной из концентраций.

Контрольной группе 1 мышей вводили по 0,5 мл фосфатно-альбуминового буфера рН 7,2.

Контрольной группе 2 мышей вводили по 6 мкг препарата Сополимер.

Через 4 дня после инъекций брали образцы крови у животных и определяли число ретикулоцитов.

Для этого добавляли 1 мкл цельной крови к 1 мл раствора тиазола оранжевого в концентрации, удобной для определения ретикулоцитов. После окраски в течение 3-10 минут производили подсчет ретикулоцитов микролуорометрически в проточном цитометре с помощью анализа красной флюоресцирующей гистограммы. Расчет действительного значения активности эритропоэтина (Ад, МЕ/мл) производили, используя количество ретикулоцитов на 1 млн клеток.

Методом регрессионного анализа рассчитывали зависимость между логарифмом концентрации эритропоэтина (ЭПО) в каждой группе и СОЭ и количеством ретикулоцитов. Сопоставляя регрессионную зависимость для эритропоэтина с такой же зависимостью для СОЭ, рассчитывали коэффициенты соотношения номинальных концентраций эритропоэтина и соответствующих им по эффективности концентраций СОЭ
Ki = Yi/Xi,
где Ki - коэффициент соотношения концентраций СОЭ/ЭПО при разведении i;
Xi - номинальное значение концентрации ЭПО при разведении i (Xi=80; 40; 20 МЕ/мл);
Yi - значение концентрации СОЭ, соотвествующее по эффективности (т.е. по количеству ретикулоцитов) концентрации ЭПО в разведении i, МЕ/мл.

На основании как минимум трех вычисленных коэффициентов определяли его среднее значение

где Кср - средний коэффициент соотношения концентраций СОЭ/ЭПО;
К1, К2, К3 - коэффициенты соотношения концентраций СОЭ при определенном разведении ЭПО;
3 - количество взятых для сравнения с СОЭ концентраций ЭПО.

Умножив номинальное значение активности ЭПО (Аном) на средний коэффициент (Кср), получали действительное значение активности ЭПО (Ад) в МЕ/мл
Ад = Кср • Аном.

Установлено, что действительное значение активности ЭПО для группы ЭПО+ПЭГ составило 2238 ME; для группы ЭПО+ПОЛ - 2648 ME, активность ЭПО в стандартном образце (СОЭ) (Аном) была 2000 ME.

Таким образом, добавление сополимера к цитокину (эритропоэтин) значительно увеличивало его биологическую активность в отношении стимуляции эритроопоэза.

Ниже в таблице 3 приводится уровень ретикулоцитов у мышей исследуемых групп, в том числе контрольных. Количество ретикулоцитов на 1000 эритроидных клеток (см. таблицу 3).

Как видно из таблицы, введение фосфатно-альбуминового буфера, равно как и Сополимера не вызывало прироста числа ретикулоцитов и, таким образом, не стимулировало эритропоэз.

Таким образом, Сополимер не обладает свойствами стимулировать продукцию ретикулоцитов и эритропоэз. При исследовании активности ЭПО + Сополимер установлено, что эта активность значительно повышается в сравнении со стандартным образцом ЭПО, а также и в сравнении с соединением ЭПО - Полиэтиленгликоль.

Учитывая отсутствие эффекта Сополимера, более низкую активность изолированного ЭПО можно считать, что композиция ЭПО-Сополимер обладает синергическим сверхсуммарным эффектом.

Для подтверждения этого эффекта в лаборатории иммунологии Института биотехнологии Литовской Республики было проведено исследование активности препаратов в международном стандартном тесте изучения активности человеческого рекомбинантного эритропоэтина (International Standard for Human Recombinant EPO, NIBSC code 87/684) in vitro с использованием TF-1 линии клеток). Результаты представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы, Сополимер не влияет на эритропоэз и не обладает эритропоэтиновой активностью. Использование конъюгата ЭПО-Сополимер давало значительно большую активность, чем использование стандартного ЭПО. Это свидетельствует о том, что соединение Сополимера с ЭПО значительно улучшает свойства последнего.

При исследованиях, описанных в примере 3, в забранных образцах крови определяли уровень цитокинов и, используя метод высвобождения радиоактивного хрома определяли естественную киллерную активность (МК-активность) спленоцитов мышей против линии опухолевых клеток Yac-1.

Полученные данные представлены в ниже таблицах 5 и 6.

Уровень цитокинов в плазме приведен в таблице 5.

Как видно из таблицы, под влиянием Сополимера происходят значительная стимуляция синтеза Интерлейкина 6 (IL-6) и снижение синтеза Интерлейкина 12 (IL-12). Уровень Фактора некроза опухолей альфа (TNFa) практически не изменился.

Влияние эритропоэтинов (Эритропоэтина стандартного и Эритропоэтина пегилированого) практически между собой не различалось и выражалось в снижении концентрации ФНО альфа (TNFa).

Под действием ЭПО-ПОЛ (эритропоэтин-сополимер) равномерно возрастало количество ИЛ-6, ИЛ-12 и ФНО альфа. (Модуляция - это восстановление нормального количественного и функционального соотношения звеньев системы иммунитета. В данном случае наибольшим иммуномодулирующим эффектом обладала именно смесь ЭПО-ПОЛ, так как поскольку мыши были нормальные (здоровые), то избирательно стимулировать какое-то одно из звеньев системы иммунитета не надо и важно сохранить нормальное соотношение между ними. Введение других препаратов в данном случае давало стимулирующий (ПОЛ) или депрессивный (ЭПО, ЭПО-ПЭГ) эффект).

Интерлейкин 6 в зависимости от исходного состояния системы иммунитета может выступать как в роли про-, так и противовоспалительного цитокина. Кроме того, он участвует в стимуляции тромбоцитопоэза и противоопухолевого иммунитета.

Интерлейкин 12 обладает способностью стимулировать образование Т-лимфоцитов (Т-хелперов - помощников 1 типа), стимулировать противоопухолевые цитотоксические реакции, потенциировать действие вакцин и противоопухолевый иммунитет.

Фактор некроза опухолей участвует в процессах лизиса опухолевых клеток, является провоспалительным цитокином, участвует в процессах стимуляции атеросклеротических поражений.

Из приведенных данных следует, что Сополимер обладал иммуномодулирующим эффектом, который проявлялся в основном в виде активации провоспалительных реакций. Эритропоэтины, наоборот, оказывали мягкое противовоспалительное действие. Наиболее гармоничный эффект в данном случае отмечен у комплекса ЭПО-ПОЛ (СОПОЛИМЕР). Это выражалось в стимуляции уровня всех изучаемых цитокинов при сохранении их нормального соотношения.

Кроме того, следует отдельно отметить стимуляцию под влиянием комплекса ЭПО-ПОЛ продукции IL-12. Поскольку IL-12 является весьма перспективным иммунотерапевтическим средством, но применение его в чистом виде невозможно вследствие высокой токсичности, факт стимуляции продукции этого цитокина комплексом ЭПО-ПОЛ открывает новые перспективы для иммунотерапии.

"NК"-активность (естественная цитотоксичность) приведена в таблице 6.

Как видно из таблицы, стимуляция противоопухолевого цитотоксического действия отмечена лишь в группах ПОЛ и ЭПО-ПОЛ, но не отмечена в других группах.

Следует указать, что стимуляция эритропоэза в комплексе со стимуляцией противоопухолевого иммунитета является очень важным положительным качеством, так как большинство опухолей протекают на фоне анемии, которая усугубляется химио- и лучевой терапией. Данный факт подчеркивает новизну и практическую ценность предлагаемой композиции.

Таким образом, Сополимер не обладает свойствами стимулировать продукцию ретикулоцитов и эритропоэз. При исследовании активности ЭПО + Сополимер установлено, что эта активность значительно повышается в сравнении со стандартным образцом ЭПО, а также и в сравнении с соединением ЭПО - Полиэтиленгликоль.

Учитывая отсутствие эффекта Сополимера, более низкую активность изолированного ЭПО можно считать, что композиция ЭПО-Сополимер обладает синергическим сверхсуммарным эффектом.

Для подтверждения этого эффекта в лаборатории иммунологии Института биотехнологии Литовской Республики было проведено исследование активности препаратов в международном стандартном тесте изучения активности человеческого рекомбинантного эритропоэтина (International Standard for Human Recombinant EPO, NIBSC code 87/684) in vitro с использованием TF-1 линии клеток. Результаты представлены в таблице 7.

Как видно из таблицы, Сополимер не влияет на эритропоэз и не обладает эритропоэтиновой активностью. Использование конъюгата ЭПО-Сополимер давало значительно большую активность, чем использование стандартного ЭПО. Это свидетельствует о том, что соединение Сополимера с ЭПО значительно улучшает свойства последнего.

В приведенных примерах эффект комплекса ЭПО-ПОЛ существенно отличался как от Эритропоэтина (ЭПО) в чистом виде, Сополимера в чистом виде, так и от аналога - ЭПО-ПЭГ. При этом отличия распространялись как на эритропоэз, так и на иммуномодуляцию, что подчеркивает новизну биологического эффекта данной фармацевтической композиции.

В приведенном примере 4, кроме модуляции цитокинового эффекта, проявляются следующие новые дополнительные биологические свойства фармацевтической композиции: значительная стимуляция эритропоэза и противоопухолевого эффекта, стимуляция выработки IL-12, равномерная гармоничная стимуляция выработки интерлейкинов.

Для более широкого понимания взаимодействия Цитокинов и Сополимера было проведено дополнительное исследование: изучалось влияние соединения Сополимера и одного из важнейших цитокинов - Фактора некроза опухолей альфа. Полученные данные представлены ниже.

Исследование влияния фактора некроза опухолей альфа (ФНОа), Сополимера и их конъюгата на Фагоцитоз
Использовали следующие Препараты:
1. ФНО альфа 10 и 50 пг/мл
2. Сополимер 1 и 0,1 мкг/мл
3. Конъюгат, соответствующий смеси 10 пг/мл ФНОа + 0,1 мкг/мл Сополимера
4. Конъюгат, соответствующий смеси 50 пг/мл ФНОа + 1 мкг/мл Сополимера
5. Смесь 10 пг/мл ФНОа + 0,1 мкг/мл Сополимера
6. Смесь 50 пг/мл ФНОа + 1 мкг/мл Сополимера
7. Физиологический раствор (контроль)
Изучение фагоцитоза с использованием крови здоровых доноров проводилось при постановке метода с латексом (0,05 мл латекса, столько же крови и Препарата), выдерживая пробы в термостате 30 мин, центрифугируя 5 мин при 1500 об/мин и делая затем мазки. Исследование НСТ-теста проводилось стандартным способом с нитросиним тетразолием [1]. Данные экспериментов представлены в таблице 8.

Как видно из таблицы 7, добавление всех изучаемых препаратов приводило (за исключением Сополимера в дозе 0,1 мкг/мл) к достоверной стимуляции фагоцитарной активности по сравнению с контролем.

При анализе различий между отдельными группами установлено, что использование Конъюгата 10 пг/мл ФНОа + 0,1 мкг/мл Сополимера приводило к достоверному увеличению фагоцитарного числа и, что особенно важно, фагоцитарного индекса (Р<0,05) по сравнению как с сополимером в любой используемой дозе, так и с ФНОа в любой используемой дозе. Аналогичные различия (Р<0,05) выявлены и для Конъюгата 50 пг/мл ФНОа + 1 мкг/мл Сополимера, Смеси 10 пг/мл ФНОа +0,1 мкг/мл Сополимера, Смеси 50 пг/мл ФНОа + 1 мкг/мл Сополимера.

Следует указать, что данный эффект не может считаться просто сложением отдельных эффектов. Во-первых, само по себе использование смеси и/или конъюгатов Сополимера и цитокина - ФНОа давало больший эффект как в отношении фагоцитарного числа, так и, особенно, фагоцитарного индекса, чем каждый из используемых препаратов в отдельности. Сополимер в дозе 0,1 мкг/мл вообще не дал достоверного эффекта. Кроме того, обращает на себя внимание более выраженный эффект Смеси (конъюгата) ФНОа и Сополимера в отношении стимуляции фагоцитарного индекса, характеризующего переваривающую способность фагоцитов. Этот эффект и более выражен, и более клинически важен, так как указывает не только на способность фагоцита захватывать микроорганизм (фагоцитарное число), но и переваривать его.

Эти данные подтвердились при оценке функции ферментных систем фагоцитов с помощью НСТ-теста.

Как видно из таблицы 9, ни ФНОа, ни Сополимер в малых дозах 10 пг/мл и 0,1 мкг/мл соответственно не обладали действием в НСТ-тесте. При этом и смесь ФНОа-Сополимер и их конъюгаты в аналогичных дозах обладали достоверным эффектом. А в больших дозах этот эффект достоверно превосходил результаты, полученные при отдельном использовании препаратов.

Таким образом, смесь или конъюгат Цитокина - ФНОа и Сополимера обладали сверхсуммарным эффектом, а также новыми свойствами, выражающимися в более избирательной стимуляции фагоцитоза.

Итак, из вышеприведенных исследований следует, что речь идет о новом явлении, когда добавление Сополимера ведет не только к сверхсуммарному эффекту, но и появлению принципиально новых свойств у цитокинов.

При этом следует указать, что соединение цитокинов с Сополимером образует новые вещества, которые обладают, наряду с известными, новыми физико-химическими и биологическими свойствами, еще требующими своего изучения.

Литература
1. С. А. Кетлинский, Н.М. Калинина. Иммунология для врача. - СПб, 1998, 156 с.

2. Войткевич К.Л. Определение общей окислительно-восстановительной активности нейтрофилов с помощью гистохимического красителя нитросинего тетразолия// Лаб. дело. - 1977. - N3. - С. 147-148.

Ниже приведены примеры конкретных фармацевтических композиций и способов их получения, подтверждающие возможность осуществления изобретения с получением вышеуказанного технического результата.

Пример 5
Фармацевтическая композиция, представляющая собой смесь с ЭПО и с СОПОЛИМЕРОМ, в качестве активных веществ содержащая следующие ингредиенты при следующем их соотношении, мас.%:
ЭПО - 0,001-5,5
Сополимер - 0,001-7,0
Маннит - 0,001-30
Поливинилпирролидон низкомолекулярный медицинский - 10-20
Бета-каротин - 0,01
Дистиллированная вода - До 100
Способ приготовления
Эритропоэтин - вещество получают биотехнологическим способом путем введения клонированного гена эритропоэтина человека в составе плазмиды в клетки перевиваемой линии яичника китайского хомячка. Готовят раствор ЭПО в фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) с активностью не менее 2000 ME в 1 мл. К полученному раствору ЭПО добавляют в стерильных условиях раствор Сополимера. Сополимер получают путем химического синтеза. Затем производят фильтрование и расфасовку.

Пример 6
Фармацевтическая композиция, представляющая собой суппозитории (ректальные, вагинальные), палочки уретральные, с Интерфероном альфа-2 и сополимером в качестве активных веществ и с наполнителем на жировой основе, содержащая следующие ингредиенты при следующем их соотношении, мас.%:
Интерферон альфа-2 - 0,000001-0,01
СОПОЛИМЕР - 0,0005-0,07
Твердая жировая основа - До 100
Средство готовят следующим образом. Активные вещества получают описанным выше способом (Интерферон альфа-2 - путем биотехнологического, а Сополимер - путем химического синтеза). Затем к части ИФН присоединяют Сополимер путем ковалентного связывания (конъюгации). Другую часть смешивают: в раствор ИФН добавляют раствор Сополимера. Затем компоненты смешивают и подают через дозаторы в автомат для изготовления и упаковки суппозиториев. Однородная масса перемешивается при комнатной температуре. После чего производят фильтрование и расфасовку.

Пример 7
Фармацевтическая композиция, представляющая собой раствор для ингаляций, с Эритропоэтином, Интерфероном альфа-2, Интерлейкином 4, Сополимером в качестве активных веществ и с наполнителем на водной основе, содержащая следующие ингредиенты при следующем их соотношении, мас.%:
ЭПО - 0,000005-0,018
ИФН альфа-2 - 0,000001-0,01
Интерлейкин 4 - 0,000001-0,01
Сополимер - 0,0005-0,07
Хлорид натрия - 2-5
Вода - До 100
Средство готовят следующим образом. Цитокины (эритропоэтин, интерферон альфа-2, интерлейкин) получают биотехнологическим способом. Сополимер - способом химического синтеза. Затем каждый в отдельности цитокин присоединяют путем конъюгации к сополимеру. После этого к раствору ЭПО-Сополимер добавляют раствор ИФН-Сополимер и раствор ИЛ-4 - Сополимер. Перемешивают. Стерилизуют фильтрованием. Затем добавляют раствор Сополимера. Перемешивают, фильтруют. Способ получения раствора для ингаляций включает следующую последовательность операций: получение суммарного раствора биологически активных веществ, растворение хлорида натрия, перемешивание растворов, стерилизующая фильтрация полученного раствора, розлив раствора во флакон и его герметизация.

Пример 8
Фармацевтическая композиция, представляющая собой глазные капли (капли в нос), с Интерфероном альфа-2в и Сополимером в качестве активных веществ и с наполнителем на водной основе, содержащая следующие ингредиенты при следующем их соотношении, мас.%:
Интерферон альфа-2в - 0,000001-0,01
Сополимер - 0,0005-0,07
Хлорид натрия - 0,9-1
Вода - До 100
Средство готовят следующим образом. Активные вещества получают описанным выше способом. Способ получения заявляемой лекарственной формы включает следующую последовательность операций: присоединение (путем ковалентного связывания - конъюгации) Интерферона к Сополимеру, растворение активного вещества и хлорида натрия в воде для инъекций с нагреванием раствора до t 25^oC, стерилизующая фильтрация полученного раствора, разлив раствора во флакон и его герметизация.

Таким образом, вышеизложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании заявленного изобретения следующей совокупности условий:
- фармацевтическая композиция, воплощающая заявленное изобретение при его осуществлении, предназначена для использования в медицине, а именно для профилактики и лечения заболеваний, обусловленных нарушениями иммунологических функций;
- для заявленной фармацевтической композиции в том виде, как она охарактеризована в независимом пункте изложенной формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке и известных до даты приоритета средств и методов;
- средство, воплощающее изобретение при его осуществлении, способно обеспечить достижение указанного технического результата: создание нового более эффективного по сравнению с известными аналогами иммунотерапевтического препарата на основе цитокинов, обладающего возможностью модуляции цитокинового эффекта, а также новыми дополнительными биологическими свойствами.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается фармацевтической композиции, обладающей цитокиновым и иммуномодулирующим действием, используемых для профилактики и лечения заболеваний, обусловленных нарушениями иммунологических функций. Добавление сополимера N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида к активному веществу фармацевтической композиции, состоящему из, по крайней мере, одного цитокина или конъюгация с ним позволяет создать новый более эффективный по сравнению с известными аналогами иммунотерапевтический препарат. Преимущество изобретения заключается в создании препарата, обладающего возможностью модуляции цитокинового эффекта, а также новыми дополнительными биологическими свойствами. 9 табл.

Фармацевтическая композиция на основе цитокинов, отличающаяся тем, что она представляет собой смесь или конъюгат цитокина с сополимером N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида.