СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2001 года по МПК C12N7/04 C12N7/06 

Изобретение относится к способу подавления репродукции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) путем химической обработки.

Проблема подавления репродукции ВИЧ связана с профилактикой и терапией ВИЧ-инфекции и этиологически связанного с ней синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). В результате скрининга большого числа синтетических и природных соединений были выявлены препараты с высокой анти-ВИЧ активностью: ингибиторы обратной транскриптазы нуклеозидной (De Clercq E., New acquisitions in the development of anti-HIV agents // Antiviral Res., 1989, v. 12, p. 1-19; Yurchoan R. , Pluda J. M. , Thomas R.V., et al., Long-term toxicity/activity profile of 2',3'-dideoxyinosine in AIDS-related complex // Lancet, 1990, Sept., 1, p. 526-529; Карамов Э.В., Лукашов В.В., Тарусова Н.В. и др. , Подавление вируса иммунодефицита человека в культуре клеток 5'-фосфитами 3'-азидо-2', 3'-дидезоксинуклеозидов // Молекулярная биология, 1990, т. 24, N 6, с. 1695 - 1701; Карамов Э.В., Лукашов В.В., Горбачева А.П. и др. Ингибирование репродукции вируса иммунодефицита человека в культуре клеток 5'-фосфитами 3'-азидо-2', 3'-дидезоксинуклеозидов // Молекулярная биология, 1992, т. 26, N 1, с. 201-207) и ненуклеозидной природы (De Clercq E., The role of NNRTIs in the therapy of HIV-infections // Antiviral Res., 1998, Jun. 38 (3), p. 153-179), ингибиторы протеаз (Mazumber A., et al., Antiretroviral agents as inhibitors of both human immunodificience virus type I integrase and proteasе // J. Med. Chem., 1996, v. 39 (13), p. 2472-2481), ингибиторы гликозилирования (Dedera D., Heyden N.V., Ratner L., Attenuation of HIV-I infectivity by inhibitor of oligosacharide processing // AIDS Res. Hum. Retrovir., 1990, v. 6 (6), p. 785-794) и проникновения вируса в клетку (Moelling K. , Schulze T., Diringer H., Inhibition ofhuman immunodeficiency virus type I RNasc H by sulfated poly anions // J. Virol., 1989, v. 63, p. 5489 - 5491; Tatarintsev A.V., Vrzheshch P.V., Schegolev A.A., et al., Ajoene antagonizes integrin-dependent processes in HIV-infected T-lymphoblasts // AIDS, 1992, v. 6, N 10, p. 1212-1215; Chan D.C., Kim P.S., HIV entry and its inhibition // Cell, 1998, v. 93, p. 681-684).

Общим недостатком использования большинства препаратов, подавляющих репродукцию ВИЧ, является быстрое возникновение у вируса резистентности, что делает необходимым поиск новых анти-ВИЧ препаратов и их комбинаций для преодоления резистентности.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для ингибирования репродукции ВИЧ.

Этот результат достигается тем, что в способе подавления репродукции вируса иммунодефицита человека, предусматривающем введение химических веществ, согласно изобретению, в качестве химических веществ используют композицию, содержащую компоненты в следующем соотношении по массе с точностью ± 10%:
Продукты гидролиза и окисления лигнина - 25
Пирофосфат - 17
NaCl - 3
HCl - До pH 7,0
Вода - До 1000
Этот способ позволяет расширить арсенал средств подавления репродукции ВИЧ.

Композиция, используемая в предлагаемом способе для подавления репродукции ВИЧ, известна под названием Олипифат и производится по известной технологии (RU, 2141335, C1, 20.11.1999).

Опыты по подавлению репродукции ВИЧ проводили in vitro с использованием клеток перевиваемой T-лимфобластоидной линии CEM SS и бластстимулированных мононуклеаров периферической крови (МПК), изолированных из протестированной на анти-ВИЧ, анти-ЦМВ, анти-HBS, анти-HCB, анти-EVB крови донора, и двух штаммов ВИЧ-I: HIV-I_BRU - референс-штамма, активно репродуцирующегося в Т-лимфобластоидных клеточных линиях, чувствительного к действию азитотимидина (AZT), и HIV-I_A216 - выделенного из пациента, так называемого первичного изолята ВИЧ, эффективно размножающегося в Т-клеточных и моноцитарных линиях, с высокой устойчивостью к AZT.

Линия CEM SS была получена из коллекции NIH и культивировалась согласно рекомендациям в пластиковых флаконах 25 см³ (Costar, США) при 37^oC и 5% CO₂ в ростовой среде следующего состава: RPMI-1640 (Sigma, США) с 10% фетальной телячьей сыворотки (Bioclot, Германия), 2 mM L-глутамина (Sigma, США). Каждые 3-4 дня проводили рассев клеток, заменяя 3/4 клеточной суспензии свежей ростовой средой, при этом посевная доза составляла 2-3•10⁵ клеток в мл. В целях стандартизации условий экспериментальной ВИЧ-инфекции и сохранения постоянных характеристик клеточной модели через каждые 30 пассажей (в среднем 4 месяца) клеточную линию CEM SS восстанавливали из криоконсервированных отвивок.

МПК выделяли из цельной гепаринизированной (12,5 ед./мл гепарина, Sigma, США) крови серонегативного в отношении вышеперечисленных инфекций донора путем седиментационного разделения при центрифугировании в растворе фиколл-paq. Отделенную фракцию МПК дважды отмывали в среде RPMI-1640 и ресуспендировали в концентрации 1-2•10⁶ клеток в мл в ростовой среде RPMI-1640 с 20% фетальной телячьей сыворотки и культивировали в тех же условиях.

Возможность использования Олипифата для подавления репродукции ВИЧ определяется химиотерапевтическим индексом, который считают как отношение 50% цитотоксической дозы (ЦТД₅₀) к 50% ингибирующей дозе (ИД₅₀).

Цитотоксическую дозу определяли методом линейно-логарифмической интерполяции по опытным данным. В опытах клетки CEM SS и МПК культивировали в присутствии разных доз Олипифата в течение 5-9 суток, а затем определяли их жизнеспособность методом МТТ. Метод заключается в измерении способности исследуемых клеток превращать хорошо растворимый желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)- 2,5-дифенилтетразолия (МТТ) в нерастворимые внутриклеточные кристаллы МТТ-формазина. Эффективность этого превращения отражает общий уровень дегидрогеназной активности исследуемых клеток и, в известных пределах, прямо пропорционален концентрации живых клеток. Количество оптически (540 нм) определяемого формазина прямо пропорционально количеству живых клеток. Результаты представлены в таблицах 1 и 2.

Анализ таблиц 1 и 2 показывает, что Олипифат является малотоксичным препаратом.

В исследованиях по определению анитивирусной активности использовали вирусные стоки, полученные при культивировании хронически зараженных клеточных линий CEM/BRU и THP-1/A-216. Вируссодержащую культуральную жидкость освобождали от клеток центрифугированием, собирали и хранили при температуре -70^oC. Биологическую активность вирусных стоков оценивали путем титрования TCID₅₀.

Для определения TCID₅₀ 2•10⁴ клеток Sup T1 в 100 мкл ростовой среды разливали в 96-луночные планшеты. Равный объем 100 мкл приготовленных десятикратных разведений от 10^-1 до 10^-9 вирусных образцов добавляли к клеткам по 6 точек на каждое разведение и инкубировали при 37^oC и 5% CO₂, отслеживали цитопатический эффект (ЦПЭ) по мере развития инфекции. Каждые 3-5 дня 1/2 объема ростовой среды заменяли свежей. По истечении 4-5 дней, когда развитие ЦПЭ приостанавливается, проводили учет лунок с ЦПЭ по каждому разведению. TCID₅₀, то есть доза вируса, при которой заражаются клетки 50% лунок, рассчитывалась по методу Рида и Менча. Определенная таким методом величина TICD₅₀ для HIV-I_BRU и HIV-I_А216 составила 10⁴ и 10⁵ соответственно.

При исследовании антивирусной активности Олипифата клетки в течение 2 ч инкубировали при 37^oC с различными концентрациями Олипифата и затем заражали вирусом с множественностью заражения 10³ TCID₅₀. После 24-часовой инкубации клеток с вирусом в присутствии Олипифата несвязавшийся вирус удаляли путем центрифугирования, осадок клеток ресуспендировали в свежей ростовой среде с соответствующими концентрациями Олипифата. За развитием инфекции наблюдали в течение 5 суток, оценивали цитопатический эффект. О концентрации вируса судили по накоплению p24 антигена. Вирусный ядерный антиген p24, будучи мажорным и высококонсервативным белком, признан как маркер ВИЧ-инфекции. Концентрацию коровьего антигена p24 ВИЧ определяли с помощью иммуноферментного анализа Innogenetics, Бельгия. В таблицах 3 и 4 приведены данные по действию Олипифата на ВИЧ-инфекцию. 50%-ная эффективная доза ИД₅₀ определялась методом линейно-логарифмической интерполяции.

Представленные в таблицах данные показывают, что Олипифат обладает выраженной анти-ВИЧ активностью, как для AZT-чувствительных, так и для AZT-резистентных вариантов ВИЧ.

Значения химиотерапевтического индекса представлены в таблице 5.

Рассчитанный химиотерапевтический индекс подтверждает возможность использования Олипифата для подавления репродукции ВИЧ.

Для подавления репродукции ВИЧ предложен способ, предусматривающий использование препарата Олипифат, содержащего продукт гидролиза и окисления лигнина, пирофосфат, NaCl, НСl и воду. Олипифат обладает выраженной анти-ВИЧ активностью, как для AZT-чувствительных, так и для AZT-резистентных вариантов ВИЧ. Способ по подавлению репродукции ВИЧ используют in vitro. Способ позволяет расширить арсенал средств подавления репродукции ВИЧ. 5 табл.

Способ подавления репродукции вируса иммунодефицита человека, предусматривающий введение химических веществ, отличающийся тем, что в качестве химических веществ используют композицию, содержащую компоненты в следующем соотношении по массе с точностью ±10%:
Продукты гидролиза и окисления лигнина - 25
Пирофосфат - 17
NaCl - 3
HCl - До pH 7,0
Вода - До 1000р