СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1 ТИПА (ВИЧ-1) Российский патент 2003 года по МПК A61K31/45 A61P31/18 

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и может быть использовано в комбинированной терапии ВИЧ-инфекции.

Проблема профилактики и терапии ВИЧ-инфекции является в настоящее время актуальной во всем мире в связи с тем, что масштабы распространения этой инфекции приобрели характер пандемии, а связанное с ней заболевание - СПИД - неизлечимо. Поиск анти-ВИЧ препаратов, специфически блокирующих вирусную инфекцию, является важной и сложной задачей. В результате скрининга большого числа синтетических и природных соединений, а также целенаправленного синтеза были выявлены препараты с высокой анти-ВИЧ активностью: ингибиторы обратной транскриптазы нуклеозидной [De Clercq et al., 1989; Yarchoan R. et al. , 1990; Карамов Э.В. с соавт., 1990, 1992] и ненуклеозидной природы [De Clercq E. , 1998], ингибиторы протеаз [Mazumber A., 1996], ингибиторы гликозилирования [Dedera D. et al., 1990] и проникновения вируса в клетку [Moelling, К. et al., 1989, Tatarintsev A.V., Karamov E.V., 1992,ChanD. et al., 1998].

Опыт применения подавляющего большинства анти-ВИЧ препаратов показывает их основной недостаток - быстрое возникновение (в течение нескольких месяцев после начала соответствующей терапии) резистентности [Карамов Э.В., Лукашов В. В. , 1994]. В целях преодоления резистентности необходимо продолжение широкого скрининга анти-ВИЧ препаратов различной природы, а также их комбинаций.

В 1988 году обнаружена высокая анти-ВИЧ активность алкалоидов, выделенных из плодов австралийского каштана Castanospermus australe -каштаноспермина 1, ноджуэримицина 2 и его N-алкильных аналогов 3-5, свансонина и других [1].

Биологическая активность каштаноспермина оказалась весьма многосторонней: каштаноспермин является потенциальным ингибитором различных глюкозидаз, ингибирует экспериментальные метастазы некоторых видов рака. Наиболее значимым свойством каштаноспермина является ингибирование репликации вируса иммунодефицита человека и других вирусов [2].

Задачей патента является устранение недостатков, которыми отмечены известные анти-ВИЧ средства, т.е. преодоление быстро возникающей резистентности использованием новых ингибиторов.

Предлагаемый способ состоит в том, что для ингибирования ВИЧ-инфекции используют ингибиторы, относящиеся к цис- и транс-гидроксилированным производным пиперидина общей формулы цис-I и транс-II, индивидуальные цис- и транс-изомеры I и II которых применяют как в рацемической, так и в оптически активной форме и которые имеют следующие значения заместителей:
R является Н, алкил от С₁ до С₁₀, 2-оксиэтил, 2-оксипропил.

К раствору 7,4 г (31,6 ммоль) 1-этилпиридиний иодида в 60 мл этанола при 0^oС при интенсивном перемешивании прибавляют порциями 3 г (79 ммоль) борогидрида натрия. После окончания прибавления перемешивают еще 1 час, охлаждают до 0^oС и прибавляют 7 мл конц. соляной кислоты. Этанол упаривают на роторном испарителе, к остатку прибавляют 10 мл воды, охлаждают до 0^oС, прибавляют твердый NaOH до рН 11 и экстрагируют эфиром (10•5 мл), объединенные эфирные вытяжки сушат MgSО₄. Эфир отгоняют с насадкой Вигре при атмосферном давлении, отстаток перегоняют и получают 2,02 г (58%) 1-этил-1,2,5,6-тетрагидропиридина, Т. кип. 119-120^oС, n_D ²⁰=1,4621, ИК спектр (в тонком слое) см^-1: 1675(С=С).

1.3.1 -Этил-3,4-дигидроксипиперидин
К раствору 0,8 г (7,2 ммоль) 1-этил-1,2,5,6-тетрагидропиридина в 5,44 мл 98% муравьиной кислоты прибавляют 3,56 мл 25%-ного раствора перекиси водорода и реакционную смесь перемешивают 5 дней при комнатной температуре, затем прибавляют 9 мл ледяной уксусной кислоты и упаривают раствор на роторном испарителе. К остатку прибавляют раствор 0,7 г (17,5 ммоль) NaOH в 3 мл этанола. Полученный раствор наносят на колонку, заполненную оксидом алюминия в CCl₄, элюируют системой CCl₄ - этанол, 4:1. Хроматографически одногодные фракции объединяют, осторожно упаривают, получают 0,45 г (43%) 1-этил-1,2,5,6-тетрагидропиридина в виде светло-желтого масла, R_f=0,5 (Alufol, CCl₄ - этанол, 1:2). ИК спектр (в тонком слое) см^-1: 3025-3700 (связ. ОН). Хроматомасс-спектр: М⁺ 145, М_выч 145.

Серия синтезированных таким образом цис-I и транс-II гидроксилированных производных пиперидина была исследована с целью определения токсических и антивирусных свойств. Результаты исследований описаны в примерах 2, 3.

Пример 2. Изучение цитотоксических свойств производных пиперидина (ПП) на Т-лимфобластоидной клеточной линии СЕМ SS.

Цитотоксические свойства ПП были изучены на клетках перевиваемой Т-лимфобластоидной линии СЕМ SS [Nara P.L., et al., 1987], которые в дальнейшем служат моделью для экспериментальной ВИЧ-инфекции in vitro, а также на клетках перевиваемой Т-лимфобластоидной линии Sup T1. Клетки культивируют согласно рекомендациям в пластиковых флаконах 25 см² ("Costar", США) при 37^oС и 5% CO₂, в ростовой среде следующего состава: RPMI-1640 ("Sigma", США), 10% фетальной телячьей сыворотки ("Bioclot", Германия), 2 mM L-глутамина ("Sigma", США). Каждые 3-4 дня проводят рассев клеток, заменяя 3/4 клеточной суспензии свежей ростовой средой, при этом посевная доза составляла 2-3•10⁵ клеток в мл.

В целях стандартизации условий экспериментальной ВИЧ-инфекции и сохранения постоянных характеристик клеточной модели через каждые 30 пассажей (в среднем 4 месяца) обе клеточные линии восстанавливают из криоконсервированных отвивок, хранящихся в жидком азоте. Криоконсервацию проводят по общепринятой методике, кратко: клетки с концентрацией 5-10•10⁶ в мл ресуспендировали в среде RPMI-1640 с 50% фетальной телячьей сыворотки, 2 mM L-глутамина, 100 мкг/мл гарамицина ("KRKA", Югославия), 10% глицерина ("Sigma", США), отбирали по 1,5 мл в пробирки для замораживания ("Costar", США) и хранили в жидком азоте. Деконсервацию клеток осуществляют путем быстрого оттаивания и последующего центрифугирования в 7 мл ростовой среды при 1000 об/мин и далее культивируют, как описано выше.

При исследовании цитотоксических свойств клетки СЕМ SS и Sup T1 культивируют в присутствии разных доз препарата в течение 5-7 дней. Цитотоксичность ПП определяют, сравнивая жизнеспособность клеток в присутствии различных доз препарата с жизнеспособностью клеток без препарата. Жизнеспособность клеток определяют МТТ-методом [Mossman Т, 1993]. Содержание этого метода заключается в измерении способности исследуемых клеток превращать хорошо растворимый желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) в нерастворимые внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана. Эффективность такого превращения отражает общий уровень дегидрогеназной активности исследуемых клеток и, в известных пределах, прямо пропорциональна концентрации живых (но не мертвых) клеток. Количество оптически (540 нм) определяемого формазана прямо пропорционально количеству живых клеток. Результаты этих исследований представлены в табл. 1. 50%-ую цитототоксическая доза (CD₅₀) рассчитывают с помощью линейно-логарифмической интерполяции.

Среди изученных соединений присутствуют как слаботоксичные соединения (Г1, Г1/1, Г5, Г13) с CD₅₀ > 1000 мкг/мл, так и высокотоксичные (Г18, Г24, Г26, Г27, Г29) с CD₅₀ < 100 мкг/мл, приводящие к значительной гибели клеток уже при 10 мкг/мл; остальные соединения (Г3, Г4, Г9, Г8, ПО, Г22/1, Г23/1, Г6, Г7, Г8/1, Г11, Г12, Г28) обладают умеренной токсичностью.

Пример 3. Исследование антивирусной активности ПП на модели лимфобластоидной клеточной линии СЕМ SS.

Вирус
В работе использован референс-штамм ВИЧ-1 - HIV-1_BRU, активно реплицирующийся в Т-лимфобластоидных клеточных линиях, чувствительный к действию AZT (азидотимидин).

Вируссодержащий материал, используемый для заражения (вирусные стоки), получают при культивировании хронически зараженной клеточной линии CEM/BRU. Вируссодержащую культуральную жидкость освобождают от клеток центрифугировали 1000 об/мин 10 мин, собирали и хранили при температуре -70^oС. Биологическую активность вирусных стоков оценивали путем титрования ТСID₅₀.

Титрование ТСID₅₀ (Tissue culture infectious dose - 50).

Для определения TClD₅₀ 2•10⁴ клеток Sup T1 в 100 мкл ростовой среды разливают в 96-луночные планшеты. Равный объем (100 мкл) приготовленных десятикратных разведений (от 10^-1 до 10^-9) вирусных образцов добавляют к клеткам (по 6 точек на каждое разведение) и инкубируют при 37^oС и 5% СО₂, отслеживая цитопатический эффект (СПЭ) по мере развития инфекции. Каждые 3-4 дня 1/2 объема ростовой среды (10 мкл) замещают свежей средой. Но истечении 4-5 дней, когда развитие СПЭ приостанавливается, проводят учет лунок СПЭ по каждому разведению. ТСID₅₀ , т.e. доза вируса, при которой заражаются клетки 50% лунок, рассчитывают по методу Рида и Менча. Определенная таким методом величина ТСID₅₀ для HIV-1 BRU и HIV-1 AR216 составляла 10^4,0 и 10^5,0 соответственно.

Определение р24 антигена методом ИФА
Вирусный ядерный антиген р24, будучи мажорным и высококонсервативным белком, признан как маркер ВИЧ-инфекции. Иммуноферментный анализ на основе анти р24 моноклональных антител позволяет измерить концентрацию р24 антигена и судить о концентрации вируса в вируссодержащих материалах. Для определения р24 антигена в образцах использовали коммерческую тест-систему Innogenetics (Belgium).

При исследовании эффективности ПП в системе острой литической инфекции использовалась следующая схема заражения: клетки СЕМ SS (0,3•10⁶ в мл) в течение 2 часов инкубировали при 37^oС с различными концентрациями ПП (100, 10, 1, 0,1 и 0,01 мкг/мл) и затем заражали вирусом с множественностью заражения 10³ ТСID₅₀ (Tissue Culture Infectious Dose - 50).

Для заражения использовали AZT-чувствительный (HIV-l_BRU) вариант ВИЧ-1. После 24-часовой инкубации клеток с вирусом в присутствии ПП, несвязавшийся вирус удаляли путем низкоскоростного центрифугирования (1000 об/мин х 7 мин), осадок клеток ресуспендировали в свежей ростовой среде с соответствующими концентрациями ПП. За развитием инфекции наблюдали в течение 6 суток, оценивая цитопатический эффект (цитолиз, синцитиеобразование) и определяя концентрацию вирусного антигена р24 с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) ("Innogenetics", Бельгия).

В табл. 2 приводятся данные (усредненные по 4-м экспериментальным точкам) подавления репродукции ВИЧ-1_BRU в присутствии исследованных соединений. С помощью линейно-логарифмической интерполяции была рассчитана 50%-ная эффективная доза (EDso), представляющая собой такую концентрацию препарата, при которой имеет место 50%-ное подавление инфекции (см. табл.2).

Среди изученных ПП заметным эффектом в ингибировании ВИЧ-инфекции обладали следующие соединения: Г-1/1, Г-8, Г-22/1, Г-8/1, Г-12, Г-18, Г-24, Г-26, Г-27 и Г-13. Остальные проявили слабовыраженную анти-ВИЧ активность или же полное отсутствие таковой.

Затем рассчитывали терапевтический индекс (индекс селективности; SI) каждого соединения как отношение CD₅₀/ED₅₀ (табл. 3).

Из табл. 3 следует, что наиболее перспективными соединениями являются Г-8 и Г-1/1, имеющие высокий индекс селективности. Соединения Г-8/1, Г-12, Г-13 и Г-27 с индексом селективности порядка 100 (по причине высокой токсичности или невысокого антивирусного эффекта) можно в дальнейшем рассматривать в качестве дополнительных анти-ВИЧ агентов при комбинированной анти-ВИЧ терапии.

Таким образом, среди гидроксилированных производных пиперидина обнаружены эффективные ингибиторы ВИЧ-1, которые могут быть использованы в дальнейшем для химиотерапии ВИЧ-инфекции.

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано для подавления репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1). Для этого в качестве ингибиторов репродукции ВИЧ-1 применяют определенные производные пиперидина. Способ позволяет расширить ассортимент препаратов для преодоления резистентности к другим средствам, используемым для ингибирования репродукции ВИЧ-1. 3 табл.

Способ подавления репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), отличающийся тем, что в качестве ингибиторов репродукции ВИЧ используют производные пиперидина общей формулы цис-1 и транс-II в рацемической и в оптически активной форме


где R является Н, алкил от C₁ до С₁₀, 2-оксиэтил, 2-оксипропил, 3-оксипропил, 1-метил-2-оксиэтил, 1-фенил-2-оксиэтил, 1-бензил-2-оксиэтил, бензил, арилметил, 1-арилэтил, 2-арилметил, 1-алкоксиэтил, 2-алкоксиэтил, 2-арилоксиэтил, 2-арилоксипропил, низшие фенилалкил, арилалкил, ацетил, бензоил, этоксикарбонил;
R₁ является Н, алкил от C₁ до С₅, оксиметил, 2-оксиэтил, алкоксиметил, 1-алкоксиэтил, 2-алкоксиэтил;
R₂ является Н, алкил от C₁ до С₅, оксиметил, 2-оксиэтил, алкоксиметил, 2-алкоксиэтил;
R₃ является Н, алкил от C₁ до С₅, оксиметил, 2-оксиэтил, алкоксиметил, 1-алкоксиэтил,2-алкоксиэтил;
R₄ - Н, алкил от C₁ до С₁₀, СОМе, COEt, COPh, COAryl;
R₅ - Н, алкил от C₁ до C₁₀, COMe, COEt, COPh, COAryl.