ДИ- И ТРИНИКОТИНАТЫ ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ИНГИБИТОР РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2007 года по МПК C07J53/00 C07J63/00 A61P31/18 

Изобретение относится к биологически активным веществам, производным глицирризиновой кислоты, и может использоваться в медицине, вирусологии, фармакологии, например в качестве ингибитора репродукции вируса иммунодефицита человека.

Известно, что глицирризиновая кислота - основной ингредиент экстракта корней солодки голой (Glycyrrhiza glabra) и солодки уральской (Gl. Uralensis), обладает высокой биологической активностью и является высокоэффективным средством в лечении различных заболеваний. Так, она применяется при лечении вирусных гепатитов, входит в перечень препаратов (который насчитывает около 50 наименований), подавляющих репродукцию вируса иммунодефицита человека in vitro. Названная кислота оказывает противовирусное, противовоспалительное, противозудное и иммуномодулирующее действие, действует на разные типы ДНК и РНК вирусов in vitro и in vivo (Varicella zoster; Herpes simplex 1 и 2 типа; различные типы вируса папилломы человека, в т.ч. онкогенные), прерывает репликацию вирусов на ранних стадиях, вызывает выход вириона из капсида, тем самым не допуская его проникновение в клетки, что связано с селективным дозозависимым ингибированием фосфорилирующей киназы Р. Глицирризиновая кислота взаимодействует со структурами вируса (возможно, с белками), изменяя различные фазы вирусного цикла, что сопровождается необратимой инактивацией вирусных частиц, находящихся в свободном состоянии вне клеток, блокирует внедрение активных вирусных частиц внутрь клетки, нарушает способность вируса к индукции синтеза новых вирусных частиц, индуцирует образование интерферона, что является одним из компонентов противовирусного действия, инактивирует указанные вирусы в нетоксичных для нормально функционирующих клеток концентрациях. Мутантные штаммы вирусов, резистентные к ацикловиру и йодоуридину, также высокочувствительны к глицирризиновой кислоте, как и немутантные штаммы. Противовоспалительная активность глицирризиновой кислоты сочетается со стимулирующим влиянием на гуморальные и клеточные факторы иммунитета.

Производные глицерризиновой кислоты так же, как и сама кислота, обладают высокой биологической активностью. В частности, моноаммониевая соль глицирризиновой кислоты (глицирам Г) или пента-o-никотинат глицирризиновой кислоты, 3-(b-D-2,3,4-три-о-никотинилглюкуронпиранозил)1 2(a-D-3,4-ди-О-никотинилглюкуронпиранозил глицирретовой кислоты (ниглизин, НГ) используются для ингибирования репродукции вируса Марбург [Патент РФ №2088232]. Например, гликопептид глицирризиновой кислоты обладает анти-СПИД-активностью [Патент РФ №2024546]. Известны и другие производные глицирризиновой кислоты, проявляющие полезные для лечения различных заболеваний свойства, что указывает на высокую перспективность этих веществ для использования в медицине, фармакологии и биологии. По этой причине получение новых производных глицирризиновой кислоты является актуальной задачей.

В рамках решения этой задачи получено новое вещество, являющееся производным глицирризиновой кислоты, а именно ди- и/или триникотинаты глицирризиновой кислоты общей формулы:

где R - это или Н, причем два и/или три из названных R - это .

Синтез ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты осуществляют в соответствии со следующий схемой:

Для реализации этой схемы никотиновую кислоту растворяют в органическом апротонном растворителе при нагревании реакционной смеси с образованием суспензии, в которую добавляют также при нагревании пятихлористый фосфор, затем суспензию охлаждают. В охлажденную суспензию добавляют глицирризиновую кислоту и затем ее снова нагревают. После окончания протекания реакции и охлаждения полученной реакционной смеси в нее добавляют лед и концентрированную соляную кислоту до слабокислой реакции. Ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты выпадают в виде осадка, представляющего собой их смесь. При необходимости диникотинаты могут быть отделены от триникотинатов и таким образом выделены раздельно.

На практике синтез ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты может быть осуществлен, например, в соответствии с приведенными ниже примерами 1-3.

Исследования токсичности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты показали, что они не токсичны и могут применяться в медицине, фармакологии и биологии - оценка цитотоксичности этих соединений приведена в примерах 4-6 (таблица 1).

Исследования биологической активности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты, проведенные в отношении вируса иммунодифицита человека, показали их высокую эффективность как ингибитора репродукции этого вируса, при том, что проблема лечения ВИЧ-инфекции остается одной из самых актуальных проблем современной медицины.

Для лечения ВИЧ-инфекции на протяжении почти 15 лет в клинической практике широко использовался препарат азидотимидин (АЗТ), являющийся эффективным ингибитором вирусной обратной транскриптазы [Машковский М.Д. «Лекарственные средства». Т.2. Изд. 14-е, М: ООО «Новая волна» - 2000]. Однако в последние годы применение этого препарата снижается в связи с быстро развивающейся в организме ВИЧ-инфицированных пациентов резистентностью к нему вируса [Larder В.A, Kemp S.D. «Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT)». Science, 1989 - V.246, p.1155-1158], а также его высокой токсичностью, в том числе митохондриальной [Chiu D.T. & Duesberg P.H. «The toxicity of azidothymidine (AZT) on human and animal cells in culture at concentrations used for antiviral therapy». Genetica, 1995 - V.95, p.103-109 и Brinkman К., ter Hofstede J.M, Burger D.M. «Adverse effects of reverse transcriptase inhibitors: mitochondrial toxicity as common pathway». AIDS, 1998 - V.12, p.1735-1744]. Кроме того, монотерапия азидотимидином не рекомендована Всемирной Организацией Здравоохранения, поскольку приводит к появлению устойчивых к препарату мутантов вируса. В настоящее время азидотимидин применяют в основном в качестве составляющего компонента в так называемых «коктейлях» в сочетании с 2-4 другими препаратами, воздействующими на другие мишени цикла репродукции вируса [Schmit J.-C., Weber В. «Recent advances in antiretroviral therapy and HIV infection monitoring». Intervirology, 1997, V.40, №5/6, р.304-321 и Кравченко А.В. «Комбинированная антиретровирусная терапия ВИЧ-инфекции». Эпидемиология и инфекционные болезни, 2001, №1, с.59-62], как правило, ингибиторами протеазы ВИЧ, или ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы ВИЧ. Несмотря на эффективность некоторых таких «коктейлей», актуальным остается поиск новых сочетаний и комбинаций азидотимидина с препаратами другой природы и иного механизма действия, достаточно эффективными и дешевыми.

Одним из таких доступных и дешевых препаратов является глицирризиновая кислота, механизм действия которой до конца не ясен, так, некоторые авторы связывают его с ингибированием протеинкиназы, обеспечивающей фосфорилирование Т4 рецептора, необходимого для связывания вируса [Ito M., Sato A., Hirabayashi К., Tanabe P., Shigeta S., Baba M., De Clercq E., Nakashima H., Yamamoto N. «Mechanism of inhibitory effect of glycyrrhizin on replication of human immunodeficiency virus (HIV)». Antiviral Res, 1988, V.10, p.289-298], а другие - с непосредственным блокированием связывания вируса с клеткой [Fields A.P., Bednarik P.P., Hess A., May W.S. «Human immunodeficiency virus induces phosphorylation of its cell surface receptor». Nature (London), 1988, V.333, p.278-280]. Однако очевидно, что она, в отличие от азидотимидина, ингибирует репродукцию вируса на ранних стадиях инфекции [Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В. и др. «Изучение анти-ВИЧ активности β-глицирризиновой кислоты». Вопросы вирусологии, 1992, №5-6, с.235-238].

Исследования противовирусной активности целого ряда производных глицирризиновой кислоты продемонстрировали эффективность их анти-ВИЧ действия в культуре клеток [Покровский А.Г., Плясунова О.А., Ильичева Т.Н., Борисова О.А., Федюк Н.В., Петренко Н.И., Петухова В.З., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. «Синтез производных растительных тритерпенов и исследование их противовирусной и иммуностимулирующей активности». Химия в интересах устойчивого развития, 2001, №9, с.485-491. Патент РФ №2199547, и Патент РФ №2198177]. Например, моноаммониевая соль глицирризиновой кислоты (глицирам) не является антагонистом по отношению к азидотимидину и в сочетании с ним эффективно блокирует репродукцию ВИЧ в культуре клеток как при острой, так и при хронической инфекции при соотношении АЗТ : глицирам, равном 1:10000 [Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В. и др. «Изучение анти-ВИЧ активности β-глицирризиновой кислоты». Вопросы вирусологии, 1992, №5-6, с.235-238].

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения является пента-никотинат глицирризиновой кислоты, показавший самую высокую анти-ВИЧ активность по сравнению с другими производными названной кислоты [Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В. и др. «Изучение анти-ВИЧ активности β-глицирризиновой кислоты». Вопросы вирусологии, 1992, №5-6, с.235-238]. Однако имеется потребность в ингибиторах, анти-ВИЧ активность которых превышает активность прототипа.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание ингибиторов репродукции вируса иммунодефицита человека, имеющих высокую активность.

Поставленная задача решается тем, что предлагается ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека, включающий ди- и/или триникатинаты глицирризиновой кислоты.

Общая формула ди- и/или триникатинатов глицирризиновой кислоты приведена выше.

Как уже упоминалось, названные ди- и триникатинаты глицирризиновой кислоты находятся в смеси, которую получают при их синтезе, но они могут быть выделены и отдельно.

В результате исследований выявлено, что ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты активно влияют на репродукцию ВИЧ, что подтверждается приведенными ниже примерами 7-12 (таблица 2). Активность их существенно выше, чем у других производных глицирризиновой кислоты, включая прототип.

Исследование ингибирования репродукции ВИЧ включает культивирование первично инфицированных лимфоидных клеток линии МТ-4 в присутствии названных соединений, конечные концентрации которых в культуральной среде составляют 0,0001-100 мкг/мл, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток. Об ингибировании репродукции ВИЧ в культуре чувствительных клеток судят по снижению накопления вирусспецифического белка р24 (по данным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток в присутствии препарата по сравнению с контролем, определяемому на 4-е сутки культивирования [Schmit J.-C., Weber В. «Recent advances in antiretroviral therapy and HIV infection monitoring». Intervirology, 1997, V.40, №5/6, р.304-321 и Кравченко А.В. «Комбинированная антиретровирусная терапия ВИЧ-инфекции». Эпидемиология и инфекционные болезни, 2001, №1, с.59-62] при окрашивании 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT).

Исследования противовирусной активности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты в отношении АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1, полученного в культуре клеток и характеризующегося снижением чувствительности к АЗТ в 160 раз и наличием точечных мутаций в гене pol Asp67→Asn; Lys70→Arg; Leu214→Phe, ответственных за резистентность [Покровский А.Г., Плясунова О.А., Киселева Я.Ю., Гашникова Н.М., Федюк Н.В. «Сравнительное исследование возникновения резистентности ВИЧ-1 к АЗТ и Н-фосфонату АЗТ в культуре клеток». ДАН, 2002, Т.384, №2, с.259-252] приведены в примерах 13-14 (таблица 3).

Ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты показали большую эффективность в отношении АЗТ-резистентного мутанта (ID₅₀=0,134 мкМ), чем «дикого» штамма (ID₅₀=0,7 мкМ). Эффективность анти-ВИЧ действия ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты как в отношении «дикого» штамма, так и АЗТ-резистентного мутанта свидетельствует о перспективности использования подобных композиций для лечения ВИЧ-инфекции.

Пример 1

Синтез ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты

Двугорлую колбу емкостью 5 л, снабженную эффективной механической мешалкой, помещают в баню с глицерином с термометром. В колбу наливают 3.5 л органического апротонного растворителя (ДМФА, N-метил-пирролидон, этилендиамин), предпочтительно пиридина, засыпают 500 г никотиновой кислоты и при перемешивании нагревают реакционную смесь до 40-45°С (здесь и далее указана температура бани), затем, не прекращая перемешивания, добавляют к образовавшейся суспензии 265.5 г пятихлористого фосфора. По окончании добавления смесь нагревают до 60±3°С и перемешивают при этой температуре в течение 2 ч (примерно через 30-40 мин светлый цвет реакционной смеси становится темно-коричневым).

Далее колбу с реакционной смесью помещают в ледяную баню и перемешивают реакционную смесь в течение ˜20 мин до ее остывания и добавляют при перемешивании 150 г глицирризиновой кислоты. После этого колбу с реакционной смесью помещают в баню с глицерином и нагревают до 55±5°С, не прекращая перемешивания, и выдерживают при этой температуре в течение 2 ч 50 мин. При нагревании значительная часть осадка растворяется.

По окончании реакции убирают баню и дают остыть колбе до ˜30-40°С, затем полученную суспензию разливают поровну в 2 стакана емкостью 5 л и добавляют в каждый стакан по ˜1.5 л измельченного льда, приготовленного из дистиллированной воды, для перенесения оставшегося на стенках колбы осадка используют дистиллированную воду. Содержимое стаканов перемешивают и добавляют в них концентрированную соляную кислоту (˜1.3 л в каждый стакан) до достижения слабой кислотности (рН˜6), при этом наблюдается выпадение дополнительного количества осадка. Оставляют стаканы на несколько часов для полного выпадения осадка. Выпавший в обоих стаканах коричневый осадок отфильтровывают. Объединенные с обоих стаканов осадки промывают дистиллированной водой (4×1 л) и тщательно высушивают на фильтре. В процессе сушки осадка образуются крупные конгломераты, которые измельчают для повышения эффективности осушки. Вес высушенного светло-коричневого осадка составляет ˜300 г.

Смешивают 2 л хлороформа и 0.4 л метанола (хлороформ: метанол = 5:1) и растворяют в этой смеси полученный ранее осадок. Растворение протекает достаточно медленно и требует выдержки в течение 1-2 ч при интенсивном перемешивании. Полученный раствор отфильтровывают, оставшийся осадок промывают 100 мл смеси хлороформа с метанолом в соотношении 5:1 (дважды по 50 мл), осадок (˜10-15 г) удаляют. К фильтрату добавляют 2.3 л диэтилового эфира, при этом наблюдается интенсивное выпадение осадка. Полученную смесь перемешивают и оставляют на 1 ч для полного формирования осадка. Выпавший осадок отфильтровывают. Осадок промывают 150 мл диэтилового эфира (трижды по 50 мл), высушивают на фильтре. Вес осадка ˜165 г. К полученному осадку добавляют 150 мл этилового спирта, перемешивают, отфильтровывают, высушивают на фильтре.

Вес высушенного светло-коричневого осадка составляет ˜150 г (выход ˜60%). Полученная субстанция представляет собой смесь ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты в соотношении 20:80, соответственно.

Аналитический контроль качества получаемого продукта осуществляют с помощью элементного анализа, ВЭЖХ и ВЭЖХ-хроматомасс-спектрометрии.

Пример 2

Синтез ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты

Двугорлую колбу емкостью 5 л, снабженную эффективной механической мешалкой, помещают в баню с глицерином с термометром. В колбу наливают 3.5 л органического апротонного растворителя (ДМФА, N-метил-пирролидон, этилендиамин), предпочтительно пиридина, засыпают 500 г никотиновой кислоты и при перемешивании нагревают полученную реакционную смесь до 40-45°С (здесь и далее указана температура бани), затем, не прекращая перемешивания, добавляют к образовавшейся суспензии 265.5 г пятихлористого фосфора. После этого смесь нагревают до 50±3°С и перемешивают при этой температуре в течение 1.5 ч (примерно через 40-50 мин цвет реакционной смеси из светлого становится темно-коричневым).

Убирают баню, а колбу с реакционной смесью помещают в ледяную баню, перемешивают реакционную смесь в течение ˜20 мин до остывания и добавляют при перемешивании 120 г глицирризиновой кислоты. Убирают охлаждающую баню, а колбу с реакционной смесью помещают в баню с глицерином и нагревают до 50±5°С, не прекращая перемешивания, и выдерживают при этой температуре в течение 2 ч. При нагревании значительная часть осадка растворяется.

Дальнейшую обработку реакционной смеси проводят так же, как в примере 1. Вес высушенного светло-коричневого осадка составляет ˜160 г (выход ˜65%). Полученная субстанция представляет собой смесь ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты в соотношениии 50:50, соответственно.

Аналитический контроль качества получаемого продукта осуществляют с помощью элементного анализа, ВЭЖХ и ВЭЖХ-хроматомасс-спектрометрии.

Пример 3

Синтез ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты

Двугорлую колбу емкостью 5 л, снабженную эффективной механической мешалкой, помещают в баню с глицерином с термометром. В колбу наливают 3.5 л органического апротонного растворителя (ДМФА, N-метил-пирролидон, этилендиамин), предпочтительно пиридина, засыпают 400 г никотиновой кислоты и при перемешивании нагревают реакционную смесь до 40-45°С (здесь и далее указана температура бани), затем, не прекращая перемешивания, добавляют к образовавшейся суспензии 205 г пятихлористого фосфора. После этого смесь нагревают до 40±3°С и перемешивают при этой температуре в течение 2.5 ч (примерно через 50-55 мин цвет реакционной смеси из светлого становится темно-коричневым).

Убирают баню, а колбу с реакционной смесью помещают в ледяную баню, и перемешивают реакционную смесь в течение ˜ 20 мин до остывания и добавляют при перемешивании 100 г глицирризиновой кислоты. Убирают охлаждающую баню, а колбу с реакционной смесью помещают в баню с глицерином и нагревают до 40±5°С, не прекращая перемешивания, и выдерживают при этой температуре в течение 3 ч 50 мин. При нагревании часть осадка растворяется.

Дальнейшую обработку реакционной смеси проводят так же, как в примере 1. Вес высушенного светло-коричневого осадка составляет ˜120 г (выход ˜45%). Полученная субстанция представляет собой смесь ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты в соотношениии 70:30 соответственно.

Аналитический контроль качества получаемого продукта осуществляют с помощью элементного анализа, ВЭЖХ и ВЭЖХ-хроматомасс-спектрометрии.

Пример 4

Оценка цитотоксичности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты

Цитотоксичность ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 20/80 оценивают путем добавления его разведении в бессывороточной среде RPMI-1640 к клеточной суспензии МТ-4, помещенной в лунки 96-луночного планшета ("Cel-Cult", England), до конечных концентраций 0,001-100 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в течение 4 суток [Ito M., Sato A., Hirabayashi К., Tanabe F., Shigeta S., Baba M., De Clercq E., Nakashima H., Yamamoto N. «Mechanism of inhibitory effect of glycyrrhizin on replication of human immunodeficiency virus (HIV)». Antiviral Res., 1988, V.10, p.289-298]. Посевная концентрация составляет 0,5×10⁶ клеточных частиц в миллилитре. Контролем служат клетки без добавления препарата, вместо которого вносят такое же количество бессывороточной среды. Жизнеспособность клеток подсчитывают на 4 сутки культивирования, пользуясь формазановым методом (прижизненным окрашиванием клеток 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). Токсичность различных доз препарата определяют по жизнеспособности клеток относительно контрольных, а по полученным результатам строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (CD₅₀).

Показатель токсичности исследуемого препарата CD₅₀ - 2600 мкг/мл.

Пример 5

Оценка цитотоксичности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты

То же, что в примере 4, но оценку проводят ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты в соотношении 50/50.

Показатель токсичности исследуемого препарата CD₅₀ - 2100 мкг/мл.

Пример 6

Оценка цитотоксичности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты

То же, что в примере 4, но оценку проводят ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты в соотношении 80/20.

Показатель токсичности исследуемого препарата CD₅₀ - 1500 мкг/мл.

Таким образом, ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты не оказывают токсического воздействия на клетки МТ-4 в эффективных концентрациях: 50% токсичные дозы на 5-6 порядков превышают эффективные в отношении ВИЧ-1 дозы.

Пример 7

Определение влияния ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4

Исследование противовирусной активности соединений в отношении ВИЧ-1 проводят на перевиваемой линии чувствительных клеток МТ-4. Для заражения используют супернатант инфицированных клеток, хранящийся в жидком азоте, множественность заражения составляет 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку.

Суспензию клеток МТ-4 с концентрацией 2,0×10⁶ клеточных частиц в миллилитре и жизнеспособностью не менее 90% помещают в лунки 96-луночного планшета ("Orange") непосредственно после внесения вируссодержащего материала и добавляют ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 20/80, разведенные в среде RPMI-1640 без сыворотки, до конечных концентраций 0,0001-100 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу). Контролями служат инфицированные ВИЧ-1 клетки МТ-4 без добавления препарата (вместо препарата вносят такое же количество среды RPMI-1640 без добавок) и неинфицированные клетки.

Планшет инкубируют в течение часа при 37°С для адсорбции вируса, затем клетки разводят до посевной концентрации (0,5×10⁶ в миллилитре) питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина и 100 мкг/мл гентамицина. Затем планшет помещают в термостат на 37°С в атмосфере 5% CO₂. На 4-е сутки культивирования подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток формазановым методом. По полученным данным строят графики зависимости прироста жизнеспособности клеток относительно контроля под действием возрастающих доз препаратов, т.е. определяют способность препаратов защищать инфицированные клетки от цитопатогенного действия вируса.

Оценку анти-ВИЧ активности соединений проводят с использованием количественного определения вирусспецифического белка р24 методом прямого иммуноферментного анализа, как описано в работе Fields A.P., Bednarik P.P., Hess A., May W.S. «Human immunodeficiency virus induces phosphorylation of its cell surface receptor». Nature (London), 1988, V.333, p.278-280, и строят дозозависимые кривые, по которым рассчитывают концентрации, на 50 и 90% подавляющие прирост вирусного антигена (ID₅₀ и ID₉₀). Терапевтический индекс, или индекс селективности (IS) считают как отношение 50%-ной токсической концентрации соединения к его 50%-ной эффективной дозе.

Полученные результаты: CD₅₀ - 2600 мкМ, ID₅₀ - 1.2 мкМ, IS - 2166/.7

Пример 8

Определение влияния ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4

То же, что в примере 7, но в лунки 96-луночного планшета («Orange») непосредственно после внесения вируссодержащего материала добавляют ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 50/50.

Полученные результаты: CD₅₀ - 2100 мкМ, ID₅₀ - 2.2 мкМ, IS - 954.54.

Пример 9

Определение влияния ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4

То же, что в примере 7, но в лунки 96-луночного планшета («Orange») непосредственно после внесения вируссодержащего материала добавляют ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 80/20.

Полученные результаты: CD₅₀ - 1500 мкМ, ID₅₀ - 4.1 мкМ, IS - 365.9.

Пример 10

Определение влияния глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4

То же, что в примере 7, но в лунки 96-луночного планшета («Orange») непосредственно после внесения вируссодержащего материала добавляют глицирризиновую кислоту.

Полученные результаты: CD₅₀ - 2040 мкМ, ID₅₀ - 212.5 мкМ, IS - 9.6.

Пример 11

Определение влияния моноаммонийной соли глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4

То же, что в примере 7, но в лунки 96-луночного планшета («Orange») непосредственно после внесения вируссодержащего материала добавляют моноаммонийную соль глицирризиновой кислоты.

Полученные результаты: CD₅₀ - 2065 мкМ, ID₅₀ - 46.3 мкМ, IS - 44.6.

Пример 12

Определение влияния пента-никотината глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4

То же, что в примере 7, но в лунки 96-луночного планшета («Orange») непосредственно после внесения вируссодержащего материала добавляют пента-никотинат глицирризиновой кислоты.

Полученные результаты: CD₅₀ - 863 мкМ, ID₅₀ - 15.1 мкМ, IS - 57.0.

Таким образом, полученные количественные показатели ингибирования подтверждают высокую степень подавления репликации ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4 ди- и триникотинатами глицирризиновой кислоты, превышающую, например, тот же показатель у прототипа - пента-никотината глицирризиновой кислоты в 5-15 раз.

Из приведенных примеров видно, что ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты, не оказывая токсического действия на клетки в эффективных концентрациях (50%-е токсические дозы на 5-6 порядков превышают 50%-е ингибирующие дозы), помимо способности защищать клетки от гибели в результате цитопатогенного действия вируса (>50% в дозах 0,1-1,5 мкг/мл), в высокой степени подавляют репродукцию вируса иммунодефицита 1-го типа в культуре клеток МТ-4. Терапевтические индексы ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты (IS) в 10-100 раз больше, чем для других производных глицирризиновой кислоты.

Пример 13

Определение влияния ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты на репродукцию мутанта ВИЧ-1, устойчивого к действию АЗТ в культуре клеток МТ-4.

То же, что в примере 7, но вместо суспензии клеток МТ-4 используют суспензию клеток мутанта ВИЧ-1, устойчивого к действию АЗТ в культуре клеток МТ-4.

Полученные результаты: Для АЗТ-резистентного мутанта ID₅₀ - 0,15 мкг/мл, а для исходного штамм вируса ID₅₀ - 1.2 мкг/мл.

Пример 14

Определение влияния пента-никотината глицирризиновой кислоты на репродукцию мутанта ВИЧ-1, устойчивого к действию АЗТ в культуре клеток МТ-4

То же, что в примере 12, но вместо суспензии клеток МТ-4 используют суспензию клеток мутанта ВИЧ-1, устойчивого к действию АЗТ в культуре клеток МТ-4.

Полученные результаты: Для АЗТ-резистентного мутанта ID₅₀ - 0,11 мкг/мл, а для исходного штамм вируса ID₅₀ - 15.1 мкг/мл.

Таким образом, новые химические соединения - ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты имеют высокую биологическую активность, которая проявляется по меньшей мере в том, что они являются высокоактивными ингибиторами репродукции вируса иммунодефицита человека и могут использоваться в чистом виде или в качестве основы новых высокоэффективных лекарственных форм для лечения СПИДа.

Таблица 1.Цитотоксичность ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты№ примераПрепаратCD₅₀, мкг/мл4ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 20/802600,05ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 50/502100,06ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 80/201500,0Таблица 2.Анти-ВИЧ активность ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты№ примераСоединениеCD₅₀, мкМID₅₀, МКМIS7ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 20/8026001,22166,78ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 50/5021002,2954,549ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 80/2015004,1365,910Глицирризиновая кислота2040212,59,611Моноаммонийная соль глицирризиновой кислоты206546,344,612Пента-никотинат глицирризиновой кислоты86315,157,0

Таблица 3.Количественные характеристики ингибирования АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1 ди- и триникотинатами глицирризиновой кислоты ПрепаратID₅₀, мкг/млАЗТ-резистентный мутантИсходный штамм вируса АЗТ1,120,00713ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 20/800,151,214пента-никотинат глицирризиновой кислоты0,1115,1

Изобретение относится к биологически активным веществам, производным глицирризиновой кислоты, именно: ди- и/или триникотинатам глицирризиновой кислоты общей формулы:

где R - это или Н, причем два и/или три из названных R - это . Описан также ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека, включающий ди- и/или триникотинаты глицирризиновой кислоты. Изобретение решает задачу получения новых производных глицирризиновой кислоты, обладающих высокой биологической активностью, а также повышение анти-ВИЧ активности ингибитора на основе производных глицирризиновой кислоты. 2 н.п.ф-лы, 3 табл.

1. Ди- и/или триникотинаты глицирризиновой кислоты общей формулы

где R - или Н, причем два и/или три из названных R - .