СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОГО МОНОНУКЛЕОЗА, ВЫЗВАННОГО ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА-БАРР, У ДЕТЕЙ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике инфекционного мононуклеоза (ИМ). Раннее прогнозирование характера течения заболевания позволяет оптимизировать проводимую терапию для профилактики развития рецидивов ИМ у детей.

Инфекционный мононуклеоз (ИМ) - это один из вариантов инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ), который относится к семейству герпес-вирусов, подсемейство гамма-герпес-вирусов и род лимфокриптовирусов, содержит две молекулы ДНК и обладает способностью, как и другие вирусы этой группы, пожизненно персистировать в организме человека. В последние годы наблюдается рост числа больных, страдающих хроническими рецидивирующими герпес-вирусными инфекциями, которые во многих случаях сопровождаются выраженным нарушением общего самочувствия и целым рядом терапевтических жалоб. В настоящее время установлено, что ВЭБ, как и другие представители семейства герпес-вирусов, может вызывать хронические манифестные и стертые формы заболевания, протекающие по типу хронического мононуклеоза.

По данным большинства исследователей сегодня примерно 80-90% населения инфицировано ВЭБ. Первичная инфекция чаще возникает в детском или молодом возрасте. После заражения ВЭБ репликация вируса в организме человека и формирование иммунного ответа могут протекать бессимптомно либо проявляться в виде незначительных признаков ОРВИ. Но при попадании большого количества инфекта и/или наличии в данный период значимого ослабления иммунной системы у пациента может развиться картина инфекционного мононуклеоза. Возможно несколько вариантов исхода острого инфекционного процесса:

- выздоровление (ДНК вируса можно выявить только при специальном исследовании в единичных В-лимфоцитах или эпителиальных клетках);

- бессимптомное вирусоносительство или латентная инфекция (вирус определяется в слюне или лимфоцитах при чувствительности метода ПЦР 10 копий в пробе);

- хроническая рецидивирующая инфекция: а) хроническая активная ВЭБ инфекция по типу хронического инфекционного мононуклеоза; б) генерализованная форма хронической активной ВЭБ инфекции с поражением ЦНС, миокарда, почек и др.; в) ВЭБ-ассоциированный гемофагоцитарный синдром; г) стертые или атипичные формы ВЭБ - инфекции: длительный субфебрилитет неясного генеза, клиника вторичного иммунодефицита - рецидивирующие бактериальные, грибковые, часто микст-инфекции респираторного и желудочно-кишечного тракта, фурункулез и другие проявления;

- развитие онкологического (лимфопролиферативного) процесса (множественные поликлональные лимфомы, назофарингеальная карцинома, лейкоплакии языка и слизистых ротовой полости, рак желудка и кишечника и др.);

- развитие аутоиммунного заболевания - системной красной волчанки, ревматоидного артрита, синдрома Шегрена и др. (следует отметить, что две последние группы заболеваний могут развиваться через большой промежуток времени после инфицирования);

- ВЭБ может играть важную роль в возникновении синдрома хронической усталости.

Ближайший и отдаленный прогноз для больного с острой инфекцией, вызванной ВЭБ, зависит от наличия и степени выраженности иммунной дисфункции, генетической предрасположенности к тем или иным ВЭБ-ассоциированным заболеваниям.

Многие исследователи связывают процесс хронизации с нарушением баланса между популяциями клонов CD4+Т-лимфоцитов-хелперов 1 (Th1) и 2 (Th2) типов и изменением выработки различных цитокинов. Однако механизмы формирования рецидивирующего течения ВЭБ-инфекции остаются малоизученными, и, соответственно, плохо прогнозируемыми.

В связи с этим не вызывает сомнения необходимость точного и раннего прогноза характера течения ВЭБ-инфекции у детей. Возможность прогнозирования рецидивирующего течения заболевания позволит своевременно корректировать терапию больных уже на ранних сроках болезни, грамотно, опираясь на конкретные иммунологические показатели, применить иммуномодулирующие препараты и тем самым предотвратить развитие рецидивирующего течения заболевания.

Широко известен факт, что наиболее выраженный терапевтический эффект отмечается при раннем назначении препаратов. При лечении ИМ используются целый ряд иммунокорригирующих препаратов, обладающих противовирусным действием. Подавляющее большинство из них представляют собой препараты интерферона или его индукторы, оказывающие серьезное вмешательство в иммунную систему организма и имеющими большое количество побочных эффектов. Некорректное применение такого вида лечения часто способно нанести непоправимый вред больному, например, запустить тяжелый аутоиммунный процесс у лиц часто и длительно болеющих и имевших до такого вмешательства минимальные клинические и иммунологические признаки нарушения аутоиммунитета или надолго «парализовать» продукцию собственных интерферонов, по существу, обезоружить больного, заблокировав его противовирусную терапию. В целом у 10,7% пациентов развиваются побочные реакции, требующие отмены препарата. Также имеются данные об отдаленных осложнениях интерферонотерапии. Поэтому важно определить четкие показания для назначения подобной терапии.

С целью более рационального применения иммунокорригирующей терапии ранее предпринимались попытки прогнозирования течения инфекции. Известны клинико-иммунологические, серологические критерии, по которым определяется развитие тяжелого и затяжного течения ИМ. Попыток прогноза рецидивирующего течения заболевания в острый период инфекции по литературным данным мы не встретили.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования тяжелого затяжного течения ИМ у детей, приведенный в работе Родионовой О.В. и Букиной А.А. "Клинико-этиологические аспекты и новые подходы к терапии инфекционного мононуклеоза у детей", С-Пб, 2000 г. Так, по данным этих авторов, в ранние сроки прогностически значимыми являются размеры гепато- и спленомегалии, концентрация специфических иммунных комплексов с превалированием антигена (ИКАГ), количество атипичных мононуклеаров, концентрация α-интерферона, активность лимфоцитов в реакция бласттрансформации лимфоцитов на фитогемаглютинин (РБТЛ на ФГА). С учетом коэффициента каждого параметра высчитывался суммарный балл, по величине которого прогнозировали тяжесть течения ИМ. Однако недостатком данного способа является сложность разработанного алгоритма, включающего большое количество параметров. Необходимость использовать 4 варианта количественной РСК (реакции связывания комплемента), основанной на количественном учете показателя лизиса эритроцитов барана, для выявления в крови суммарных метод неприменимым на практике из-за сложности, длительности и трудоемкости выполнения. Данный способ применялся для прогноза тяжелого затяжного течения ИМ, тогда как известно, что рецидивы встречаются в одинаковом проценте случаев как после тяжелой, так и среднетяжелой формы ИМ. Следовательно, он не может эффективно использоваться для прогноза рецидивирующего течения ИМ. Указанные недостатки существенно ограничивают возможность раннего и точного прогноза течения ИМ, критерии не показывают изменений такого важного звена иммунитета, как система цитокинов, отражающая соотношение клонов Тh1 и Th2 типов, а именно нарушения Т-клеточного ответа определяют развитие неблагоприятного течения заболевания.

С целью устранения этих недостатков авторы предлагают способ прогнозирования течения ИМ, основанный на клинико-иммунологическом обследовании и отличающийся тем, что на ранних сроках заболевания классическим методом ИФА определяют комплекс сывороточных концентраций цитокинов - интерлейкина-4 (ИЛ-4), фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) и гамма-интерферона (γ-ИФН), устанавливают уровни этих цитокинов, при которых прогнозируют рецидивирующее течении инфекции:

при первом обследовании (с 2 по 10 день болезни) - гамма-интерферона ниже 400 пг/мл, фактора некроза опухоли альфа ниже 50 пг/мл, интерлейкина 4 выше 150 пг/мл, при выписке (с 12 по 20 день болезни) - гамма-интерферона ниже 250 пг/мл.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении доступности и точности прогноза развития рецидивирующего течения ИМ у детей на ранних сроках болезни, что крайне важно для своевременного назначения иммуномодулирующих препаратов и определения длительности лечения. Этот результат достигается тем, что прогноз осуществляется сразу при поступлении в клинику на основе комплексного анализа цитокинового статуса на основании трех цитокинов интерлейкина 4, фактора некроза опухоли-альфа и гамма-интерферона. Именно цитокиновый статус является основной характеристикой Т-клеточного иммунного ответа, от состоятельности которого зависит, произойдет ли быстрая элиминация вируса из организма с исчезновением клинических симптомов болезни и появлением протективного антительного ответа, или же заболевание примет затяжное, а впоследствии и хроническое течение, с длительной репликацией вируса. Известно, что характер иммунного ответа зависит от доминирующего участия клонов CD4+Т-лимфоцитов-хелперов 1-го или 2-го типа, которые различаются по продуцируемым ими цитокинам и роли в стимулировании развития иммунного ответа по клеточному или цитокинам и роли в стимулировании развития иммунного ответа по клеточному или гуморальному типу. Определение уровней цитокинов, свойственных для Т-лимфоцитов 1-го (γ-ИФН) или 2-го типа (ИЛ-4) дает информацию, по какому пути пойдет развитие иммунного ответа. В случае получения показателей, говорящих о возможном неблагоприятном течении и исходе болезни, можно стимулировать выработку необходимых цитокинов, и, тем самым, повернуть развивающийся иммунный ответ в благоприятную сторону.

Таким образом, авторы впервые предлагают способ прогнозирования, который основан не на определении клинико-серологических критериев, а на оценке комплекса иммунологических показателей, выявленных в самом начале острого инфекционного мононуклеоза, отражающих индивидуальный тип иммунного ответа и показывающих на ранних сроках заболевания, уже со 2-го дня заболевания, дальнейший ход развития болезни. Авторы впервые установили спектр и уровни цитокинов, при которых можно прогнозировать течение заболевания уже при поступлении больного в клинику. Высокие уровни ФНО-альфа и ИФН-гамма при низком содержании в крови ИЛ-4 в острую фазу болезни свидетельствуют об адекватном Тh1-подобном ответе на инфекцию и прогнозируют выздоровление, тогда как слабая продукция ФНО-альфа (ниже 50 пг/мл) и ИФН-гамма (ниже 400 пг/мл) при, напротив, повышенном содержании в крови ИЛ-4 (выше 150 пг/мл) служат маркером иммунного ответа Тh2-типа и предсказывают развитие рецидивов ИМ. Принципиальным моментом в предлагаемом способе прогнозирования течения острого инфекционного мононуклеоза у детей является оценка цитокинового звена иммунной системы, что отличает предлагаемый способ прогнозирования от использованных ранее.

Способ осуществляется следующим образом: используя сыворотку крови детей, больных острым инфекционным мононуклеозом на ранних сроках (первые 10 дней) болезни, в классическом ИФА с использованием коммерческих тест-систем производства Санкт-Петербургских фирм "Цитокин" определяются уровни цитокинов-интерлейкина 4, фактора некроза опухоли - альфа и гамма-интерферона.

При получении следующих показателей: при первом обследовании (с 2 по 10 день заболевания) - гамма-интерферона (IFN-γ) ниже 400 пг/мл, фактора некроза опухоли - альфа (TNF-α) ниже 50 пг/мл, интерлейкина- 4 (IL-4) выше 150 пг/мл, при выписке в фазу ранней реконвалесценции (с 10 по 20 день болезни) - гамма-интерферона ниже 250 пг/мл, прогнозируют развитие рецидивирующего течения ВЭБ-инфекции у детей.

Описываемый способ прогнозирования был применен у 64 детей (табл.1).

Таблица 1
Уровень цитокинов у детей с разным течением ИМ в острый период (с 2 по 10 день болезни) и фазу ранней реконвалесценции (с 12 по 20 день болезни). IFN-γ (пг/мл)TNF-α (пг/мл)IL-4 (пг/мл) При поступленииПри выпискеПри поступленииПри выпискеПри поступленииПри выпискеБезрецидивное течение n=41742±158^**524±135^*115±3293±3581±13^**73±12Рецидивирующее течение n=23201±5295,4±3431±744,8±9430±118^**52±15Р<0,01<0,05<0,05 <0,05 К92±2419±451±7Примечания: К - здоровые дети;
^* - достоверные отличия (р<0,05) в сравнении с контрольной группой;
^** - достоверные отличия (р<0,01) в сравнении с контрольной группой;
/достоверность (р) определялась по критерию Стьюдента (t) по формуле
где при t=2-р<0,05, при t=2,8-р<0,01 и при t=3,6-р<0,001/
М - среднее арифметическое значение, m - стандартная ошибка среднего арифметического. /В.И.Юнкеров, С.Г.Григорьев Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований, С-Пб. 2002/.
Например, достоверность отличия уровней IFN-γ в двух группах при поступлении определялось следующим образом - соответственно р<0,01.
Для расчета формулы применили стандартный способ «исчисления доверительного интервала», при котором показатель в формуле равен M-2m / например, при расчете уровня IFN-γ при поступлении M-2m=742-158×2=426 пг/мл (примерно 400 пг/мл)

Способ можно проиллюстрировать на конкретных примерах:

Пример 1. Больной К., 3 года. История болезни №2147. Диагноз:

Инфекционный мононуклеоз, среднетяжелая форма, рецидивирующее течение.

Поступил в клинику НИИДИ на 2 день болезни (д.б.) с жалобами на вялость, лихорадку до 38,5°, выраженное затруднение носового дыхания, храп во сне.

При поступлении состояние средней тяжести за счет выраженной интоксикации, температура 38°, носовое дыхание затруднено, дышит носом, в зеве разлитая гиперемия, на обоих миндалинах, гипертрофированных 2 степени, рыхлые белые налеты, островчатые, размером до 1,5×1 см. Язык обложен белым налетом. Пальпируются увеличенные до 2×1,5 см переднешейные лимфоузлы в виде пакетов, и заднешейные до 1,5×1 см в виде цепочки, твердоватоэластичной консистенции. Печень пальпируется на 2 см ниже реберной дуги. Селезенка выступает из-под реберной дуги на 2 см. В клиническом анализе крови - лейкоцитоз 23,5×10 /л, атипичных мононуклеаров 35%, СОЭ 35 мм/ч. В крови с помощью модифицированной РСК выявлен маркер ВЭБ-вирусной инфекции - антиген ВЭБ, в иммуноцитохимическом тесте - реакция на 4 креста (лимфоциты «нафаршированы» крупными гранулами).

Больной получил курс симптоматической терапии и 5-дневный курс виферона. В ходе лечения состояние улучшилось - налеты в зеве исчезли и нормализовалась температура к 5 д.б., носовое дыхание восстановилось к 8 д.б., уменьшились лимфоузлы шейных групп. При выписке, к 11 дню болезни, сохранилась гепатоспленомегалия (печень 2 см из-под реберной дуги, селезенка - край из-под реберной дуги). В клиническом анализе крови лейкоцитоз снизился до 10×10⁹/л, атипичные мононуклеары до 15%, СОЭ до 14 мм/ч. В течение года после данной госпитализации ребенок 6 раз переносил респираторное заболевание, сопровождающееся выраженным затруднением носового дыхания лимфоаденопатией, гепатоспленомегалией (печень до 2 см, селезенка - край из-под реберной дуги), при лор-осмотрах были диагностированы хронический тонзиллит и аденоидит. В иммуноцитохимическом тесте сохранялась реакция на 3 креста (множественные крупные гранулы в слипшихся лимфоцитах, наличие перинуклеарной экспрессии антигена). Ретроспективное исследование сыворотки крови, взятой при поступлении и через 1 неделю, выявило следующие результаты (табл.2):

Таблица 2
Показатели цитокинов больного К., 3 года, при поступлении и через 1 неделю  IFN-γ TNF-αIL-4  пг/млБ-ной К.При поступлении13935546При выписке67  Норма 92±2419±451±7

По данным цитокинового статуса, определенных на ранних сроках болезни, уровню гамма-интерферона ниже 400 пг/мл, фактора некроза опухоли-альфа ниже 50 пг/мл; интерлейкина-4 выше 150 пг/мл при поступлении и гамма-интерферона ниже 250 пг/мл при выписке, мы можем прогнозировать рецидивирующее течение инфекционного мононуклеоза, вызванного ВЭБ, что и подтвердилось в дальнейшем клинико-лабораторными и вирусологическими данными.

Пример 2. Больной 3, 2 года. История болезни №2506. Диагноз: Инфекционный мононуклеоз, тяжелая форма, гладкое течение.

Поступил в клинику НИИДИ на 4 день болезни с жалобами на вялость, лихорадку до 39,5°, выраженное затруднение носового дыхания, храп во сне, увеличение шейных лимфоузлов.

При поступлении состояние средней тяжести за счет выраженной интоксикации, температура 38,5°, носовое дыхание затруднено, дышит носом, в зеве разлитая гиперемия, на обеих миндалинах, гипертрофированных до 2-3 степени, рыхлые белые налеты, островчатые, размером до 2×1 см. Язык обложен белым налетом. Пальпируются увеличенные до 3×2 см переднешейные лимфоузлы в виде пакетов и заднешейные до 1,5×1 см в виде цепочки, твердоватоэластичной консистенции. Печень пальпируется на 3 см ниже реберной дуги. Селезенка +1,5 см. В клиническом анализе крови - лейкоцитоз 24×10⁹/л, атипичных мононуклеаров 28%, СОЭ 27 мм/ч. В крови выявлены маркеры ВЭБ - инфекции - иммунный комплекс с преобладание антигена ВЭБ - ИКАГ, в иммуноцитохимическом тесте - реакция на 3 креста (перинуклеарная экспрессия в слипшихся по 3-4 в группе лимфоцитах, множественные крупные гранулы в 10% лимфоцитов).

Больной получил курс симптоматической терапии и 5-дневный курс виферона. В ходе лечения состояние улучшилось - налеты в зеве исчезли и нормализовалась температура к 10 дню болезни, носовое дыхание восстановилось к 11 д.б., уменьшились лимфоузлы шейных групп, селезенка из-под края реберной дуги не выступает. При выписке, к 18 дню болезни, сохранилась гепатомегалия (печень +2 см). В клиническом анализе крови лейкоцитоз снизился до 9,2×10⁹/л, атипичные мононуклеары до 6%, СОЭ до 16 мм/ч. За последующий месяц лимфопролиферативный синдром купировался, в иммуноцитохимическом тесте снижение реакции до 2 крестов. В течение года после данной госпитализации ребенок перенес 2 раза ОРВИ без симптомов инфекционного мононуклеоза.

Ретроспективное исследование сывороток крови, взятых при поступлении и через 2 недели, выявило (табл.3):

Таблица 3
Показатели цитокинов больного 3., 2 года, при поступлении и через 2 недели  IFN-γTNF-αIL-4  пг/млБ-ной К.При поступлении87514791При выписке632  Норма 92±2419±451±7

Ретроспективное исследование сывороток крови, взятых при поступлении и через 2 недели, выявило (табл.3) высокие показатели активности клеточного иммунитета (уровень гамма-интерферона выше 400 пг/мл, фактора некроза опухоли альфа выше 50 пг/мл; интерлейкина-4 ниже 150 пг/мл при поступлении и гамма-интерферона выше 250пг/мл при выписке). Это позволило прогнозировать гладкое течение инфекционного мононуклеоза, вызванного ВЭБ, что и подтвердилось в дальнейшем клинико-лабораторными и вирусологическими данными.

Настоящий способ прогнозирования течения инфекционного мононуклеоза, вызванного ВЭБ, у детей позволяет предположить развитие рецидивирующего течения болезни, вовремя провести адекватную противовирусную и иммуномодулирующую терапию и может использоваться в работе инфекционных отделений детских больниц.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для определения характера течения острого инфекционного мононуклеоза, вызванного ВЭБ, ранних сроках. Сущность способа заключается в том, что на ранних сроках заболевания определяют комплекс цитокинов - гамма-интерферона, фактора некроза опухоли - альфа, интерлейкина-4, устанавливают следующие уровни этих цитокинов: при первом обследовании (с 2 по 10 день болезни) - гамма-интерферона ниже 400 пг/мл, фактора некроза опухоли альфа ниже 50 пг/мл, интерлейкина 4 выше 150 пг/мл, при выписке (с 12 по 20 день болезни) - гамма-интерферона ниже 250 пг/мл, на основании которых прогнозируют развитие у детей рецидивирующего течения инфекционного мононуклеоза, вызванного ВЭБ. Техническим результатом является прогнозирование течения заболевания, что позволяет оптимизировать проводимую терапию для профилактики развития рецидивирующей формы заболевания. 3 табл.

Способ прогнозирования течения инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, у детей, включающий оценку иммунологических параметров методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что на ранних сроках заболевания определяют комплекс цитокинов - гамма-интерферона, фактора некроза опухоли - альфа и интерлейкина-4, устанавливают уровни этих цитокинов и при следующих показателях: в период разгара болезни (с 2 по 10 день болезни) - гамма-интерферона ниже 400 пг/мл, фактора некроза опухоли - альфа ниже 50 пг/мл, интерлейкина 4 выше 150 пг/мл, в период ранней реконвалесценции (с 12 по 20 день болезни) - гамма-интерферона ниже 250 пг/мл; прогнозируют развитие рецидивирующего течения инфекционного мононуклеоза, вызванного ВЭБ.