СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ЭПШТЕЙН- БАРР Российский патент 2005 года по МПК G01N33/577 

Изобретение относится к области медицины, в частности медицинской диагностики, а именно диагностики инфекционного мононуклеоза.

Инфекционный мононуклеоз (ИМ) - один из вариантов течения инфекционного процесса, вызванного вирусом Эпштейн-Барра (ВЭБ).

В последние годы отмечается постоянный рост показателей заболеваемости ИМ. В России в 2000 году зарегистрировано 6,77 случаев ИМ на 100 тыс. населения, причем среди детского населения заболеваемость составляет 29,41 на 100 тыс., что на 6,3% больше, чем в 1999 году. Для ИМ характерна системность поражения с вовлечением в процесс лимфоидной и ретикулярной ткани, нервной системы, костного мозга, глаз, сердца, легких и других органов. Тяжесть течения ИМ определяется по совокупности выраженности симптомов интоксикации, лимфопролиферативного синдрома и изменений в анализе крови. ИМ может иметь острое, хроническое и рецидивирующее течение (Vyosevic M., Gvozdenovic E. 1994).

Вирус Эпштейн-Барра ассоциирован с онкологическими и онкогематологическими заболеваниями, такими как назофарингеальная карцинома, лимфогранулематоз, некоторые В-клеточные и периферические Т-клеточные лимфомы. Установлено, что у лиц, перенесших ИМ в 2-5 раз повышается риск развития в дальнейшем лимфогранулематоза.

Одним из важнейших белков, экспрессирующих ВЭБ, является латентный мембранный протеин (LMP-1). Обычно он экспрессируется в острую фазу ИМ и при лимфопролиферативных заболеваниях. Кроме того, он обладает прямой онкогенной активностью. Данный антиген является маркером острого периода ИМ, выявление LMP-1 в периоде реконвалесценции ИМ может расцениваться как неблагоприятный прогностический признак для развития лимфопролиферативных заболеваний.

В связи с этим необходима точная диагностика инфекции, вызванной ВЭБ для проведения адекватной терапии.

Наиболее распространенным методом специфической диагностики ВЭБ инфекции является серологическая диагностика с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Сыворотки обследованных больных инкубируют с рекомбинантным белком-антигеном ВЭБ. Далее связавшиеся антитела выявляют при инкубации с конъюгатом антител к иммуноглобулинам с пероксидазой хрена. Учет результата проводят по измерению оптической плотности растворов при длине волны 450 нм.

Но серологическое обследование имеет существенные недостатки: с одной стороны, наличие антител к ВЭБ в крови не является четким признаком активности инфекционного процесса (антитела к ВЭБ выявляются до 85-90% у здоровых доноров), с другой стороны, при угнетении иммунного ответа антителогенез может быть нарушен, у новорожденных определение серологических маркеров малоэффективно вследствие несформировавшейся иммунной системы, кроме того, в начальной стадии болезни антител может не быть, так как они образуются отсрочено. Выше указанные недостатки снижают точность диагностики инфекции, вызванной ВЭБ, серологическим методом.

В связи с этим наиболее информативным является определение самого инфекционного агента - антигена ВЭВ.

Наиболее близким к предлагаемому нами способу диагностики является иммуногистохимическое выявление антигена ВЭБ (LMP-1). (Е.Е.Леенман, Б.В.Афанасьев, К.М.Пожарисский. О роли вируса Эпштейн-Барр в патогенезе лмфогрануломатоза Иммуногистохимическое и молекулярно-биологическое (гибридизация in situ) исследование //Архив патологии 1999 №1).

Биоптаты лимфоузлов получают при оперативном вмешательстве, фиксируют в формалине, заливают в парафин. Далее парафиновые срезы для восстановления антигенной реактивности тканей перед нанесением первичных антител обрабатывают в бытовой скороварке в течение 1 мин после достижения максимальных давления и температуры. Срезы инкубируют с первичными антителами в течение 18 ч при 4°С. На следующем этапе используют АВС Elite kit ("Vector", США), в качестве хромогена применяют 3,3′-диамино-бензидин. Препараты докрашивают гематоксилином и после стандартной обработки заключают в бальзам, препараты смотрят при помощи светового микроскопа.

В данном способе имеются следующие недостатки: травматичность, так как биоптаты возможно взять только в процессе оперативного вмешательства. Проведение всех этапов способа достаточно длительно по времени. Взятие биоптата, его фиксация, заливка в парафин, приготовление гистологических срезов занимает 6-7 часов и более 18 часов уходит на проведение иммунопероксидазной реакции. За счет высокого фонового окрашивания при работе с парафиновыми срезами снижается точность результата.

Устранению указанных недостатков может помочь предлагаемый авторами способ выявления антигена ВЭБ.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности. Этот результат достигается тем, что при проведении непрямой иммунопероксидазной реакции согласно изобретению берут 0,05 мл лимфоцитарной взвеси крови больного, которую наносят тонким слоем на предметное стекло, через 5-7 минут фиксируют в ацетоне в течение 3-5 минут, затем обрабатывают нормальной сывороткой, инкубируют с моноклональными антителами в течение 45 минут, после чего наносят биотилинированную сыворотку, и по характеру экспрессии антигена определяют форму инфекции: при наличии 5-6 мелких гранул в свободнолежащих лимфоцитах диагносцируют легкую форму, при наличии перинуклеарной экспрессии в слипшихся лимфоцитах и 6-7 крупных гранул как в слипшихся, так и в свободнолежащих лимфоцитах диагносцируют тяжелую форму, а при наличии перинуклеарной экспресии и 15 гранул и более в слипшихся лимфоцитах - рецидивирующее течение инфекционного мононуклеоза.

Определение антигена ВЭБ в лимфоцитарной взвеси крови является патогенетически оправданным, так как ВЭБ обладает тропизмом к В-лимфоцитам. После внедрения вируса в геном В-лимфоцитов они трансформируются в ВЭБ презентирующие клетки и приобретают способность к неограниченной пролиферации, в результате чего ВЭБ длительное время персистирует в организме.

0,05 мл лимфоцитарной взвеси достаточно для нанесения на предметное стекло тонким слоем и для этого необходим забор минимального количества крови у больного (1 мл).

Метод является неинвазивным и позволяет многократно в течение периода наблюдения контролировать наличие ВЭБ в крови

Фиксация в ацетоне в течение 3-5 минут позволяет сохранить структуры, сделать более доступными для проникновения антител и устранить фоновое окрашивание при пероксидазной реакции.

Нанесение нормальной сыворотки также способствует устранению фонового окрашивания.

В результате такая подготовка позволяет сократить время инкубирования с моноклональными антителами до 45 минут. Этого времени достаточно для реакции антигена со специфическими антителами и устранения чужеродных антител.

Таким образом, постановка реакции занимает около 3-4 часов.

Добавление биотинилированной сыворотки необходимо для последующей обработки в растворе super ABC, что обеспечивает высокую чувствительность и точность метода.

Сущность способа заключается в следующем:

Лимфоцитарную взвесь крови, наносят тонким слоем на предметное стекло, через 5-7 минут фиксируют в ацетоне в течение 3-5 минут, промывают в фосфатно-солевом буфере (рН 7.2-7.4) в течение 3-4 минут, обрабатывают в 1% растворе бихромата калия 3-4 минуты, затем обрабатывают 0,03% перекиси водорода в течение 20 минут и повторно промывают в двух порциях фосфатно-солевого буфера (рН=7.2), по 5 минут в каждой, инкубируют в 0,3% Тритон Х-100, при температуре 37°С в течение 15 минут, после чего наносят нормальную сыворотку и инкубируют при температуре 37°С в течение 20 минут, затем снова промывают в двух порциях фосфатно-солевого буфера (рН=7.2), по 5 минут в каждой, и на мазки наносят моноклональные антитела к антигену ВЭБ и инкубируют при температуре 37°С в течение 45 минут, промывают в двух порциях фосфатно-солевого буфера (рН=7.2) по 5 минут в каждой, наносят биотилинированную сыворотку, инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, промывают в двух порциях фосфатно-солевого буфера (рН=7.2) по 5 минут в каждой, наносят реагент ABC и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут, промывают в двух порциях фосфатно-солевого буфера (рН=7.2) по 5 минут в каждой, обрабатывают в водном растворе, содержащем 0,05% 3,3-диаминобензидин тетрахлорида (ДАВ) и 0,025% перекиси водорода, в течение 3 минут в заключение окрашивают гематоксилином. Выявление антигена проводят под световым микроскопом. По характеру экспрессии АГ определяют форму инфекции: при наличии 5-6 мелких гранул в свободнолежащих лимфоцитах диагносцируют легкую форму, при наличии перинуклеарной экспрессии в слипшихся лимфоцитах и 6-7 крупных гранул как в слипшихся, так и в свободнолежащих лимфоцитах диагносцируют тяжелую форму, а при наличии перинуклеарной экспресии и 15 гранул и более в слипшихся лимфоцитах - рецидивирующее течение инфекционного мононуклеоза.

Для получения достоверных результатов и исключения возможности неспецифических реакций обязательным условием является проведение контролей на качество реактивов и специфичность антисыворотки.

1. Для проведения контроля специфичности антисыворотки в качестве специфического антигена наносят неиммунную сыворотку или буфер (результаты должны быть отрицательными).

2. Неспецифичность сыворотки устраняют посредством максимального разведения высококонцентрированной сыворотки и укорочения времени инкубации.

Описанный способ подкреплен примерами конкретного выполнения. Было произведено исследование мазков с лимфоцитарной взвесью 37 детей в остром периоде ИМ. Установлено, что у больных с легкой формой ИМ (12 человек) ИЦХМ выявлялась экспрессия АГ в виде мелких гранул в среднем в 5-6 лимфоцитах по 6-7 гранул в каждом. У детей с тяжелой формой (17 больных) характер экспрессии АГ различен, у 4 больных (23,5%) АГ выявляется перинуклеарно в агломератах лимфоцитов, у 7 (41,1%) детей в виде крупных гранул в 7-8 агломирированных лимфоцитах на 100 кл в п/з по 8-9 гранул в каждом. У 6 (35,2%) больных с тяжелой формой ИМ в препаратах выявляются крупные гранулы в свободнолежащих лимфоцитах. У детей с рецидивирующим течением ИМ (8 больных) наблюдается перинуклеарная экспрессия в агломератах лимфоцитов и в 5-6 лимфоцитах на 100 кл в п/з 15-20 крупных гранул.

В качестве контрольной группы были обследованы 4 ребенка с ОРВИ в возрасте 1 года и 8 детей с лимфогранулематозом. У детей с ОРВИ не выявлялась экспрессия антигена. У больных ЛГМ наблюдается массивная диффузная экспрессия АГ в виде множественных крупных гранул свободнолежащих лимфоцитах.

Параллельно производилось обследование методом ПЦР, в 64,8% случаев ПЦР была отрицательной.

Пример 1: Дамир Ч. 5 лет, находился на 4 отделении НИИДИ с 5.02.01-9.02.01.

Анамнез болезни. Мальчик поступил в НИИДИ на 9 день остро начавшегося заболевания. Жалобы при поступлении: повышение температуры до 39 в течение 6 дней, вялость, головная боль, увеличение шейных ЛУ, боль в горле и затруднение носового дыхания, сыпь. Дома 3 дня получал флемоксин-солютаб в возрастной дозировке.

Объективное обследование при поступлении. Состояние средней тяжести. Выражены симптомы интоксикации. На кожных покровах лица, туловища, конечностей грубая, сливная пятнисто-папулезная сыпь. В зеве яркая разлитая гиперемия. Миндалины рыхлые, I-II степени гипертрофии. На миндалинах белые рыхлые налеты, не выходящие за пределы миндалин. Отека в зеве нет. Верхние переднешейные ЛУ справа пакетами 4,0×5,0 см, слева 2,0×3,0 см, плотные, болезненные при пальпации. Заднешейные ЛУ 2,0×3,0 см, цепочкой. Пальпируются мелкие затылочные, подчелюстные, подмышечные и паховые ЛУ. Носовое дыхание резко затруднено, во сне отмечается храп. Живот мягкий, безболезненный. Печень увеличена до 2 см ниже края реберной дуги. Край печени эластичный, умеренно чувствительный при пальпации. Селезенка увеличена до 1,5 см ниже края реберной дуги, плотноватая, безболезненная.

В анализе крови при поступлении (на 9-й д. б.) L - 15×10⁹/л, э - 0%, п - 4%, с - 36%, л - 50%, м - 2%, ат. мон. - 8%, СОЭ-19 мм/час. АЛТ на день болезни - 83 ед/л. Реакция Пауля-Буннеля 1/16 (отрицательная), ПЦР на ВЭБ отрицательная.

Больному было проведено иммуноцитохимическое исследование мазков крови предлагаемым способом: лимфоцитарную взвесь крови, полученную путем центрифугирования, нанесли тонким слоем на предметное стекло, высушили при комнатной температуре, фиксировали в ацетоне в течение 3-5 минут, нанесли нормальную сыворотку и инкубировали при температуре 37°С в течение 20 минут, мазки наносили моноклональные антитела к антигену ВЭБ и инкубировали при температуре 37°С в течение 45 минут, наносили биотилинированную сыворотку, инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут, наносили реагент АВС и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут, обрабатывали в водном растворе, содержащем 0,05% 3,3-диаминобензидин тетрахлорида (ДАБ) и 0,025% перекиси водорода, в течение 3 минут в заключение окрашивали гематоксилином. У больного выявлена диффузная перинуклеарная экспрессия антигена LMP1 в "слипшихся" лимфоцитах и 6 лимфоцитов на 100 кл в п/з с 15-20 крупными гранулами в одном лимфоците. Таким образом, на основании данных ИЦХ исследования и клинических проявлений был поставлен диагноз инфекционный мононуклеоз, тяжелая форма.

При диспансерном наблюдении в течение 1 года установлено, что у ребенка дважды (через 1 месяц и через 8 месяцев после выписки из стационара) клинически наблюдался возврат симптомокомплекса острого инфекционного мононуклеоза: повышение температуры до 39, резкое затруднение носового дыхания, увеличение шейных ЛУ до 3,5×4,0 см, гепатомегалия до 2 см, спленомегалия до 1,5 см. При иммуноцитохимическом исследовании выявлялась экспрессия антигена в виде крупных гранул в свободнолежащих лимфоцитах.

Пример 2: Елена А., 7 лет, находилась на 4 отделении НИИДИ с 12.03.00-21.03.00.

Анамнез болезни. Девочка поступила в НИИДИ на 4 день остро начавшегося заболевания. Жалобы при поступлении: повышение температуры до 39 в течение 4 дней, вялость, головная боль, увеличение шейных ЛУ, боль в горле и затруднение носового дыхания.

Объективное обследование при поступлении. Состояние средней тяжести. Выражены симптомы интоксикации. В зеве яркая разлитая гиперемия. Миндалины рыхлые, I-II степени гипертрофии. На миндалинах белые рыхлые налеты, не выходящие за пределы миндалин. Отека в зеве нет. Верхние переднешейные ЛУ 2,0×1,5 см, плотные, болезненные при пальпации. Заднешейные ЛУ 1,0×1,5 см, цепочкой. Пальпируются мелкие затылочные, подчелюстные, подмышечные и паховые ЛУ. Носовое дыхание резко затруднено, во сне отмечается храп. Живот мягкий, безболезненный. Печень увеличена до 2 см ниже края реберной дуги. Край печени эластичный, умеренно чувствительный при пальпации. Селезенка увеличена до 0,5 см ниже края реберной дуги, плотноватая, безболезненная.

В анализе крови при поступлении (на 4-й д. б.) L - 15×10⁹/л, э - 0%, п - 4%, с - 36%, л - 55%, м - 2%, ат. мон. - 5%, СОЭ - 10 мм/час. АЛТ на 4 день болезни - 56 ед/л. Реакция Пауля-Буннеля 1/16 (отрицательная), ПЦР на ВЭБ отрицательная.

Больной было проведено иммуноцитохимическое исследование лимфоцитарной взвеси крови предлагаемым способом и выявлена экспрессия антигена LMP1 в виде 4-5 мелких гранул в свободнолежащих лимфоцитах. Таким образом, на основании данных ИЦХ исследования и клинических проявлений был поставлен диагноз инфекционный мононуклеоз, легкая форма.

В результате проведенных нами исследований можно сделать следующие выводы:

1) предложенный нами способ диагностики ВЭБ инфекции в 90-100% позволяет с высокой степенью точности, специфичности и достоверности выявить наличие АГ ВЭБ в крови у больных с ИМ;

2) позволяет определить форму заболевания;

3) диффузная перинуклеарная экспрессия АГ и более 15 крупных гранул в агломератах лимфоцитов расценивается в качестве прогностического критерия рецидивирующего течения ИМ.

Метод достаточно прост, возможно его широкое применение в практическом здравоохранении для быстрого определения экспрессии антигена ВЭБ и соответственно оценки тяжести заболевания и своевременной иммунокорригирующей терапии.

Изобретение относится к области медицины, в частности к диагностике инфекции, вызванной вирусом Эпштейн-Барр. Сущность изобретения состоит в том, что проводят непрямую иммунопероксидазную реакцию с последующим гистохимическим окрашиванием и выявлением антигена вируса Эпштейн-Барр. Дополнительно диагностируют тяжесть течения инфекционного мононуклеоза по характеру экспрессии антигена вируса Эпштейн-Барр. Техническим результатом является повышение точности диагностики инфекции, вызванной вирусом Эпштейн-Барр, и определение тяжести течения инфекционного мононуклеоза. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ диагностики инфекции, вызванной вирусом Эпштейн-Барр путем проведения непрямой иммунопероксидазной реакции с последующим гистохимическим окрашиванием и выявлением антигена вируса Эпштейн-Барр под световым микроскопом, отличающийся тем, что на предметное стекло тонким слоем наносят 0,05 мл лимфоцитарной взвеси крови больного, через 5-7 мин фиксируют в ацетоне в течение 3-5 мин, промывают, обрабатывают нормальной сывороткой, инкубируют с моноклональными антителами к антигену вируса Эпштейн-Барр в течение 45 мин, с последующей инкубацией с биотинилированной сывороткой в течение 20 мин при комнатной температуре.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при выявлении антигена вируса Эпштейн-Барр в виде 5-6 мелких гранул в свободнолежащих лимфоцитах диагностируют легкую форму инфекционного мононуклеоза, при наличии перинуклеарной экспрессии в агломератах лимфоцитов и 6-7 крупных гранул как в агломератах, так и в свободнолежащих лимфоцитах диагностируют тяжелую форму инфекционного мононуклеоза, а при наличии перинуклеарной экспрессии и более 15 гранул в агломератах лимфоцитов - рецидивирующее течение инфекционного мононуклеоза.