МНОГОФЕРМЕНТНЫЙ ПРОДУКТ ДЛЯ КОРМОВЫХ СМЕСЕЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2001 года по МПК A23K1/00 A23K1/165 

Настоящее изобретение касается производства высокоактивных ферментов с использованием различных зерен. Более точно, настоящее изобретение касается способа производства ферментов с высокой активностью, основанного на идее, что когда зерна злаков и масличных культур проращивают при подходящих условиях среды, может быть получено большое количество ферментов с высокой активностью.

В отличие от генно-инженерных технологий, которые не обеспечивают массового производства ферментов с низкой стоимостью, известные способы проращивания зерен, предусматривающие отбор некачественных зерен, замачивание отобранных семян и их проращивание (см. а. с. СССР 360065, кл. A 23 L 1/164 или патент РФ 2057775, кл. С 12 С 1/18), позволяют получить ферментный материал очень низкой стоимости и, следовательно, могут широко использоваться для получения недорогих, богатых ферментами кормовых добавок.

Тем не менее, содержание ферментов в пророщенном зерновом материале обычно невысоко, и было бы желательно повысить значение ферментативной активности на единицу веса ферментного продукта в виде пророщенных семян, в частности фермента фитазы, как поясняется ниже, для лучшего усвоения фосфорорганических соединений корма.

Поставленные задачи решаются изобретением, предлагающим многоферментный продукт для кормовых смесей из пророщенных злаковых или масличных культур, таких как кукуруза, ячмень, пшеница, рис, соевые бобы и канола, который обладает фитазной активностью 31,9 - 305,6 ед/кг.

В другом объекте, изобретение предлагает способ получения вышеуказанного многоферментного продукта, предусматривающий стадии отбора и удаления некачественных зерен путем погружения в 1,5-3,0%-ный раствор хлорида натрия, замачивание отобранных зерен в воде до влажности зерна 40-60%, их инкубирование при температуре 25-30^oC и относительной влажности 90-95% в течение 24-36 часов и сушку пророщенных зерен воздухом при температуре 25-80^oC в течение 24-36 часов до влажности 9-12%.

Для повышения скорости проращивания зерна могут быть дополнительно погружены на 4-12 часов в 0,05-10,0%-ный раствор полисорбата 80, используемого в качестве неионного гидрофильного эмульгатора.

Отдельные ферменты могут быть экстрагированы из раздробленных пророщенных зерен с использованием буферного раствора, содержащего 0,5-1,0 М хлорида магния, а затем полученный буферный экстракт может быть центрифугирован при 5000 G.

Кроме фитазной активности ферментный продукт по изобретению из злаковых или масличных культур, таких как кукуруза, ячмень, пшеница, рис, соевые бобы и канола, также обладает амилазной, протеазной, пектиназной, β-глюконазной, липазной, целлюлазной, карбоксиметилцеллюлазной ферментативной активностью.

На чертеже: а-б представлена блок-схема способа по изобретению.

Автор изобретения обнаружил, что достигается максимум активности у таких ферментов как амилаза, целлюлаза, пектиназа, карбоксиметилцеллюлаза, бета-глюконаза, ксиланаза, протеиназа, во время периода проращивания зерен злаковых и масличных культур, таких как ячмень, пшеница, кукуруза, соевые бобы и канола. Повышение активности фитазы также наблюдалось в период проращивания этих зерен. Изобретение предлагает способ производства ферментов с использованием пророщенных зерен и сбора их на оптимальной стадии ферментативной активности. Злаковые культуры, являющиеся источником питательных материалов и поставляющие крахмал для корма животных, содержат большое количество органического фосфата. Животные с однокамерным желудком, такие как куры, свиньи или собаки испытывают недостаток в ферментах, которые гидролизуют органические фосфаты в пищеварительном тракте. Таким образом, органический фосфат не может быть переварен этими животными. Для компенсации этого недостатка при производстве кормовых смесей добавляют неорганические фосфаты. Это ведет к повышению стоимости корма и загрязнению окружающей среды из-за чрезмерного использования неорганического фосфата. Так как указанные животные не могут усваивать органические фосфаты, применение фитазы, которая гидролизует органические фосфаты, в кормовой смеси приведет к повышению усвояемости пищи этими животными, максимально увеличит продуктивность и понизит стоимость корма для животных и также уменьшит загрязнение среды органическими фосфатами.

Недавно, основываясь на подобном рассуждении, было сделано несколько попыток добавлять фитазу и другие ферменты в корм животным не только для одножелудочных животных, но также для жвачных животных, таких как крупный рогатый скот, олени, овцы и козы. В этой области было проведено много исследований в США, Канаде, Японии, Нидерландах, Германии, Объединенном Королевстве и Финляндии. В Нидерландах фитазу в пищу животным добавляют в обязательном порядке.

В этих странах с высокой плотностью населения на небольшой территории, с пропорционально более высоким числом домашних животных имеется целый букет проблем, связанных с сильным загрязнением окружающей среды, рек и почвы органическими фосфатами из навоза животных, потому что многие животные не могут их переварить. Настоящее изобретение способствует лучшему усвоению корма животными, снижению загрязнения окружающей среды, значительному снижению стоимости корма и ускорению роста животных благодаря использованию фитазы и других ферментов из пророщенных семян зерновых культур. Кроме того, изобретение предлагает эффективный и экономичный способ получения ферментов в период проращивания зерен различных растений. К настоящему моменту нет сообщений, которые бы описывали практическое использование фитазы посредством проращивания зерен.

Изобретение предлагает способ производства ферментов путем проращивания семян зерновых культур, основываясь на следующих принципах. Растения производят семена для размножения. Для более быстрого роста проростков из зерен, особенно на ранних стадиях проращивания, гидролизуются и используются различные аккумулированные в зернах питательные вещества. Зерна содержат в качестве питательных веществ крахмал, масла и белки как источники энергии, и минералы, такие как фосфаты, необходимые для роста. Ферменты крайне необходимы для эффективного использования аккумулированных в зернах питательных веществ. Таким образом, секретирование различных ферментов начинается тогда, когда наступают определенные условия для проращивания. В начале появления ростков из зерен при определенных условиях окружающей среды различные ферменты гидролизуют аккумулированные в зернах питательные вещества, чтобы получить энергию и необходимые минералы для роста, и в то же время различные ферменты наиболее активно продуцируются в зернах. Для метаболизма особенно важен аденозинтрифосфат (АТФ). АТФ поставляется путем гидролиза органического фосфата при воздействии фитазы. Кроме того, бета-глюконаза, протеиназы и другие ферменты производятся и функционируют для переработки различных аккумулированных питательных веществ. Количество и активность производимых ферментов зависит от классификации зерен, условий проращивания, таких как температура, влажность, содержание влаги в зернах и длительность инкубации. Даже в зернах одного вида, например в зернах риса, количество и активность ферментов различно в зависимости от количества белков, структурных различий крахмала, сорта и обработки зерен.

Авторы изобретения определили оптимальные условия проращивания различных зерен путем экспериментального выбора наилучших условий для продуцирования ферментов с тем, чтобы в животноводстве и в пищевой промышленности можно было эффективно использовать эту технологию. В этом изобретении особое внимание уделено производству фитазы, а другие ферменты рассматриваются как вспомогательные.

Последующее описание показывает стадии способа, которые могут быть легко модифицированы, включающие отбор зерен, обработку, сушку, измельчение и упаковку (cм. чертеж). Производство сырьевого материала для корма происходит в фазе 1; производство высокоочищенного пищевого материала происходит в фазе 2; производство ферментного продукта происходит в фазе 3.

Первая стадия отбора зерен
Зерно, хранящееся в зернохранилище, подают на устройство для просеивания, на котором при первом просеивании удаляют разрушенные и поврежденные зерна, а при втором просеивании удаляют также зерна с задержкой прорастания и инфицированые грибками. Зерна, прошедшие просеивание, помещают в солевой раствор, и в дальнейшем используют только те зерна, которые полностью погружаются в раствор. Плавающие зерна выбрасывают после их сбора соответствующим приспособлением (5). Отобранные после первого и второго просеивания зерна погружают в сосуд, содержащий неионный гидрофильный эмульсификатор и затем передают в инкубатор для проращивания, снабженный термометром (9) и гигрометром (10).

Вторая стадия: проращивание и инкубация
Отобранные, как сказано выше, зерна равномерно распределяют и инкубируют при нужной влажности и температуре. Ко времени, когда продуцируется максимальное количество ферментов, инкубирование заканчивают и начинают стадию сушки.

Третья стадия: сушка
В конце второй стадии пророщенные зерна (далее они упоминаются как "ферментный продукт") собирают и подвергают высушиванию с использованием устройства, генерирующего сухой воздух (12).

Четвертая стадия: измельчение и упаковка
Из сухого ферментного продукта, полученного на третьей стадии, получают три вида продуктов, как проиллюстрировано на чертеже. Первый продукт представляет собой высокочистый ферментный продукт, полученный после удаления шелухи с использованием отделяющего шелуху механизма 16, дробления на фрагменты размером 0,1 мм и упаковки с использованием вакуумного упаковочного механизма 18 (путь 1). Второй продукт производят для подкормки животных. Ферментный продукт вместе с шелухой измельчит в дробилке 14 и упаковывают 15 (путь 2). Третий продукт представляет собой жидкий ферментный продукт, полученный путем погружения порошкообразного продукта высокой чистоты, полученного на первом пути, в буферный раствор 20, 21, экстрагирования ферментов, используя экстрактор 19, и получения надосадочной жидкости после центрифугирования 23 (путь 3). Эти три продукта хранят в сухом месте при комнатной температуре.

Ниже описаны примеры практического осуществления способа получения ферментных и кормовых продуктов.

Пример 1
После просеивания зерна ячменя погружают в 1,5%-ный раствор хлорида натрия, затем заменяемого на воду. После того, как содержание влаги в ячмене достигнет 50%, зерна ячменя инкубируют в течение 30 часов при 25-30^oC, поддерживая относительную влажность в инкубаторе в пределах 90-95%. Процесс проращивания заканчивают при длине ростка в 2,0 см и высушивают при 40^oC в течение 36 часов.

Содержание влаги в пророщенных и высушенных ячменных зернах - 9%.

Пример 2
Все процедуры идентичны приведенным выше в примере 1, за исключением того, что ячмень погружают на 12 часов в 0,05%-ный полисорбат, используемый в качестве неионного гидрофильного эмульгатора с тем, чтобы повысить скорость проращивания. Это сокращает период проращивания до 12-24 часов. Содержание влаги в пророщенных и высушенных зернах ячменя составляло 12%.

Пример 3
По примеру 1, за исключением того, что используют зерна риса. Содержание влаги в пророщенных и высушенных зернах риса составляло 9%.

Пример 4
По примеру 1, за исключением того, что используют зерна пшеницы. Содержание влаги в пророщенных и высушенных зернах пшеницы составляло 9%.

Пример 5
Соевые бобы после просеивания погружают в 3,0%-ный раствор хлорида натрия. Когда содержание влаги в бобах достигнет 60%, их инкубируют в течение 36 часов при 30^oC и относительной влажности в инкубаторе 90-95%. Когда ростки достигают 1 см в длину, инкубирование прекращают, и бобы сушат при 80^oC в течение 24 часов горячим воздухом. Содержание влаги в продукте составляло 12%.

Пример 6
По примеру 5, за исключением того, что используют зерна канолы. Содержание влаги в пророщенных и высушенных зернах канолы составляло 9%.

Пример 7
По примеру 5, за исключением того, что бобы погружали на 4 часа в 10%-ный полисорбат-80, используемый в качестве неионного гидрофильного эмульгатора с тем, чтобы повысить скорость проращивания. Это сокращало период проращивания до 24-36 часов. Содержание влаги в конечном продукте составляло 12%.

Пример 8
По примеру 5, за исключением того, что используют кукурузу. Длина ростков кукурузы составляла 1,5 см, и содержание влаги в конечном продукте составляло 10%.

Чтобы стабилизировать ферментативную активность ферментного экстракта, полученного из измельченного ферментного продукта, в жидкие ферментные экстракты вводят MqCl₂ в концентрации 0,5-1,0 М. Жидкие ферментные продукты получают после центрифугирования этих ферментных продуктов при 5,000 G. Для экстрагирования ферментов используют биологический буферный раствор.

Эксперимент 1
Для стабилизирования ферментной активности жидкие ферментые продукты обрабатывали 0,5-1,0 М MgCl₂, CaCl₂ и CoCl₂. Эффект ферментной стабилизации в результате воздействия MgCl₂ оказался в 200 раз выше, чем при использовании CaCl₂ и позволяет хранить жидкие ферментные продукты более чем 4 месяца.

Эксперимент 2
Чтобы определить активность амилазы, экстрагированной из пророщенного ячменя, полученного способом по изобретению, эксперимент проводили in vitro. Количество глюкозы, выделенной из таких субстратов, как кукуруза, пшеница и ячмень, составляло 223 мкМ, 288 мкМ и 318 мкМ соответственно. В этом эксперименте используемые в качестве субстратов непророщенные кукуруза, пшеница и ячмень измельчали так, чтобы они просеивались через 0,5 мм ячейки, и инкубировали при 38^oC в течение 24 часов.

Эксперимент 3
Для определения активности фиразы, экстрагированной из пророщенного ячменя, полученного способом по изобретению, эксперимент in vitro проводили как эксперимент 2, описанный выше. Из вышеназванных субстратов количество выделенного фосфата из кукурузы, пшеницы и ячменя составляло соответственно 613,7 мкг, 373,9 мкг и 1,573 мкг.

Эксперимент 4
В таблице 1 представлены сравнительные данные амилазной активности из непророщенных и пророщенных зерен злаковых и масличных культур, полученных способом по изобретению. Повышение амилазной активности находится в интервале от минимального значения 210% у пшеницы и соевых бобов до максимального значения 1300% у кукурузы.

Эксперимент 5
В таблице 2 представлены сравнительные данные фитазной активности непророщенных и пророщенных зерен злаковых и масличных культур, полученных способом по изобретению. Повышение амилазной активности варьирует от минимального значения 120% у соевых бобов до максимального значения 470% у кукурузы.

Эксперимент 6
Для определения ферментативной активности различных ферментов, экстрагированных из пророщенного ячменя, эксперимент проводился, как описано выше в эксперименте 4, с использованием непророщенного ячменя в качестве контроля. По сравнению с непророщенным ячменем активность различных ферментов пророщенного ячменя была выше и составила, например, для целлюлазы 300%, для пектиназы 500%, для карбоксиметилцеллюлазы 500%, для гемицеллюлазы 300% и для протеазы 400% соответственно.

Эксперимент 7
Используя бобы, эксперимент проводился так же, как вышеописанный эксперимент 6. По сравнению с непророщенными соевыми бобами активность различных ферментов пророщенных соевых бобов была повышена и составляла, например, для амилазы - 1,500%, целлюлазы - 400%, пектиназы - 600%, карбоксиметилцеллюлазы - 500%, гемицеллюлазы - 200%, протеазы -600% и фитазы - 450% соответственно.

Эксперимент 1 по кормлению свиней
Свиней кормили раздробленными ферментными продуктами из ячменя, полученными по примеру 1 в виде грубого крахмального пищевого материала. За три месяца кормления отмечено повышение веса тела на 20% по сравнению с контрольной группой, которой давали обычный корм.

Состав корма, %:
Крахмальный корм (сырьевой материал по изобретению) - 40-50
Целлюлозный корм - 20
Белковый корм - 20
Наполнители, фармацевтические средства и минералы - 10-20
Эксперимент 2 по кормлению бройлерных цыплят
Бройлерных цыплят кормили раздробленными ферментными продуктами, из соевых бобов, полученными по примеру 5, с тем же составом корма, который описан выше, за исключением того, что в качестве источника белка использовали раздробленный продукт из соевых бобов. Через 8 недель кормления наблюдалось увеличение веса тела на 15% по сравнению с контрольной группой, которую кормили общеупотребляемой пищей.

Эксперимент 3 по кормлению куриц-несушек
По эксперименту 2 по кормлению цыплят, за исключением того, что использовали куриц несушек. Относительный уровень кладки яиц повышался на 8-19% по сравнению с контрольной группой, которой давали обычный корм. Курицы начинали откладывать яйца приблизительно на 2 недели раньше обычного срока.

Эксперимент 4 по кормлению собак, норок и лис
Эксперимент с собаками, норками и лисами проводили аналогично эксперименту 2 для цыплят. Наблюдалось увеличение относительного веса тела собак, норок и лис на 15%, 13% и 20% соответственно. Отмечено, что норки и лисы экспериментальной группы имели более блестящий мех, чем животные контрольной группы. Ферментный продукт из пророщенных зерен содержит большое количество различных высокоактивных ферментов, и таким образом ожидается, что различные субстраты будут одновременно гидролизованы. Мы подтвердили прекрасный заместительный эффект при добавлении 0,5% (весовых) ферментного продукта в фармацевтические препараты для животных по сравнению с добавлением наполнителей.

В данном изобретении производство ферментов основано на проращивании зерен культур. Изобретение использует природные процессы и позволяет получить максимальное количество ферментов по низкой цене. Ферментный продукт безопасен и нетоксичен для животных, если он получен из зерен, обычно употребляемых в пищу человеком и животными. Ферментный продукт не только содержит максимальное количество фитазы, но также и большое количество других ферментов: ожидается, что различные субстраты могут быть одновременно гидролизованы. Ферментный продукт демонстрирует прекрасный заместительный эффект, если ферментный продукт содержит различные питательные вещества в качестве неочищенного пищевого материала для производства кормовых смесей по сравнению с другими пищевыми материалами.

При использовании ферментного продукта нет необходимости добавлять фитазу в корм для жвачных животных, а также для животных с однокамерным желудком для переваривания органических фосфатов. Следовательно, это делает настоящее изобретение очень полезным в животноводстве, так как его использование экономично и значительно снижает стоимость корма.

Изобретение относится к производству многоферментного продукта из пророщенных злаковых или масличных культур, таких как ячмень, пшеница, рис, соевые бобы и канола. Многоферментный продукт обладает фитазной активностью 31,9 - 305,6 ед/кг. Способ предусматривает отбор и удаление некачественных зерен путем их погружения в 1,5 - 3,0%-ный раствор хлорида натрия, замачивание отобранных зерен в воде до влажности зерна 40 - 60%, их инкубирование при температуре 25 - 30°С и относительной влажности 90 - 95% в течение 24 - 36 ч, сушку пророщенных зерен воздухом при температуре 25 - 80°С в течение 24 - 36 ч до влажности 9 - 12%. Способ позволяет повысить фитазную активность многоферментного препарата от 31,9 до 305,6 ед/кг, т.е. способствует получению сбалансированной кормовой добавки, которая увеличивает продуктивность животных при общем снижении стоимости корма. 2 с. и 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Многоферментный продукт для кормовых смесей из пророщенных злаковых или масличных культур, таких, как кукуруза, ячмень, пшеница, рис, соевые бобы и канола, обладающий фитазной активностью 31,9-305,6 ед/кг. 2. Способ получения многоферментного продукта для кормовых смесей из злаковых или масличных культур, таких, как кукуруза, ячмень, пшеница, рис, соевые бобы и канола, обладающего фитазной активностью 31,9-305,6 ед/кг, предусматривающий отбор и удаление некачественных зерен путем их погружения в 1,5-3,0%-ный раствор хлорида натрия, замачивание отобранных зерен в воде до влажности зерна 40-60%, их инкубирование при температуре 25-30^oC и относительной влажности 90-95% в течение 24-36 ч и сушку пророщенных зерен воздухом при температуре 25-80^oC в течение 24-36 ч до влажности 9-12%. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что для повышения скорости проращивания зерна дополнительно погружают на 4-12 ч в 0,05-10,0%-ный раствор полисорбата 80, который используют в качестве неионного гидрофильного эмульгатора. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно предусматривают дробление пророщенных зерен и экстрагирование ферментов из них с использованием буферного раствора, содержащего 0,5-1,0 М хлорида магния. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что дополнительно предусматривают центрифугирование экстракта.