ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ФИТАЗЫ А И ЭНДО-1,4-β-КСИЛАНАЗЫ Е И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ ДОБАВКИ В КОРМАХ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/15 C12N9/16 C12N9/30 C12N15/80 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к созданию и производству комплексных высокоэффективных ферментных препаратов (ФП), содержащих высокоактивные термостабильные ферменты. Изобретение может быть использовано в кормовой отрасли в качестве добавки к кормам сельскохозяйственных животных и птицы, например, поросят или кур-бройлеров, ведущей к уменьшению негативного воздействия некрахмальных полисахаридов (НПС) и фитатов кормов на основе зерновых и бобовых.

В состав полисахаридов клеточной стенки растений входят целлюлоза, гемицеллюлозы и пектиновые вещества. Гемицеллюлозы составляют около 20% (по сухой массе) клеточной стенки растений, а содержание пектиновых веществ может достигать 5-12%. Функциональная роль гемицеллюлоз заключается в том, чтобы обеспечивать взаимосвязь основных компонентов клеточной стенки.

Их соотношение и содержание различно в зависимости от вида корма. Арабиноксиланы в большом количестве находятся в пшенице, рапсе, ячмене, кукурузе (около 7%), β-глюканы - в ячмене и овсе (около 4%). Много пектинов содержится в подсолнечнике, рапсе, горохе и сое (около 6%), галактоолигосахаридов - в сое (4%), а также рапсе (3%). Большое количество НПС также содержит рожь. В отдельных растительных продуктах переработки (например, отрубях) содержание НПС может превышать 20%, а в злаковых их содержание колеблется от 5 до 13%.

Попадая в пищеварительный тракт моногастричных животных (поросят и птицы), НПС затрудняют переваривание и всасывание питательных веществ. В итоге образуется застой желеобразной кормовой массы, которая служит субстратом для развития условно-патогенной микрофлоры. НПС, в большом количестве присутствующие во многих кормах, травмируют слизистые кишечника, могут увеличивать вязкость кормовой массы в кишечнике, затрудняя тем самым процессы всасывания питательных веществ. Большое количество сырой клетчатки в корме сроки прохождения пищи в пищеварительном тракте, препятствуя ферментативным процессам, эвакуируя из кишечника полезную микрофлору.

Моногастричные животные, в силу особенностей пищеварения, отличающиеся от жвачных, практически не могут разрушать межклеточные стенки зерновых компонентов, содержащие в своем составе различные НПС, в связи с этим особую актуальность приобретают использование комплексных ферментных добавок в рационах этих видов животных.

Продукты расщепления НПС могут служить пребиотиком и стимулировать развитие и рост полезной микрофлоры. Применение ферментных препаратов снижает вязкость кормовых масс (химуса) в подвздошной кишке, что позволяет животным лучше переваривать жиры, аминокислоты и минеральные компоненты [Jacob J.P., Pescatore A.J. // Annals of Translational Medicine, 2014, Vol.2, No.2. doi: 10.3978/j.issn.2305-5839.2014.01.02.].

Одним из необходимых минеральных веществ для развития здорового организма является фосфор, составляющий основу костной ткани, нуклеиновых кислот, фосфолипидов, молекул-энергоносителей. В зерновых и бобовых растениях около 60-80% общего фосфора находится в форме фитатов - недоступной для питания высших эукариот формой фосфорорганических соединений. Поэтому фосфор является необходимым компонентом комбикормов. Для поддержания здоровья, продуктивности и нормального функционирования организма животных и птицы этот макроэлемент должен поступать с кормом в достаточных количествах. Особенно остро нуждается в фосфоре молодняк, в частности бройлеры. Селекция мясной птицы по скорости роста привела к тому, что развитие костяка отстаёт от формирования мышечной ткани. В связи с этим у цыплят часто отмечаются аномалии ног незаразной этиологии. Однако, фосфор, в виде фитиновой кислоты и ее солей - фитатов, усваивается взрослой птицей на 50, молодняком - на 30 процентов. Кроме того, фитаты связывают положительно заряженные ионы металлов, относящиеся к макро- и микроэлементам (ионы кальция, цинка, железа, марганца, магния), а также белки, аминокислоты и крахмал, снижая их биодоступность. Фитаза не вырабатывается животными организмами, а в растениях её содержится мало, вследствие чего фосфор практически не доступен птице и другим животным [В.Р. Каиров, Н.Ш. Дзигоева // Известия Горского государственного аграрного университета. Т.49, ч.3, Владикавказ, 2012. - С. 119-121.].

Поэтому для удовлетворения потребностей в фосфоре в комбикорма приходится включать дорогостоящие препараты неорганического фосфора [Ленкова Т.Н., Егорова Т.А., Сысоева И.Г., Кривопишина Л.В. Отечественная фитаза // Птицеводство. 2015. №10. С.2-6]. [Синицын, А. Ферментные препараты на основе фитазы [Текст] / А. Синицын, О. Синицына // Птицеводство. - 2005. - №9. - С.35.].

Таким образом, основным способом уменьшения негативного влияния НПС и фитатов кормов является использование экзогенных ферментов, которые будучи включёнными в состав корма дополняют ферментную систему птицы, обеспечивают переваривание и в результате способствуют улучшению использования питательных веществ рациона, а также улучшают здоровье сельскохозяйственных животных и птицы.

Фитаза переводит связанный, неусвояемый фосфор зерна в доступную для усвоения форму, увеличивает доступность энергии, протеина, макро- и микроэлементов из зерновых, жмыхов и шротов.

В условиях рыночной экономики главной задачей сельскохозяйственных предприятий становиться увеличение экономической эффективности производства, повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы и снижение ее себестоимости. Успехи, достигнутые в области изучения роли микрофлоры кишечника в гидролизе сложных органических соединений кормов и всасывания их метаболитов через слизистую оболочку кишечника, в формировании и развитии ферментативного звена пищеварительной системы, явились предпосылкой разработки и использования кормовых ферментных препаратов. Поэтому проблема обеспечения промышленного птицеводства высококачественными ферментными препаратами, подходящими для различного состава рациона, является важной прикладной задачей.

Мицелиальный гриб Penicillium verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) обладает гидролитическим комплексом внеклеточных ферментов, способным к эффективной биоконверсии полисахаридов растительной биомассы, в том числе антипитательной составляющей кормов в виде НПС. В этот комплекс входят целлобиогидролазы, эндоглюканазы и β-глюкозидаза. На основе реципиентного штамма P.verruculosum 537 (ΔniaD) создана экспрессионная система [Патент RU 2378372 С2, опубликовано 10.01.2010, Бюл. №1], что позволяет использовать данный гриб как основу для получения рекомбинантных штаммов - продуцентов ферментов для практического применения в различных областях промышленности и сельского хозяйства [Skomarovsky, A.A., Gusakov, A.V., Okunev, O.N., Solov’eva, I.V., Bubnova, T.V., Kondrat’eva, E.G., Synitsyn, A.P. // Applied Biochemistry and Microbiology. 2005. Vol. 41. P. 182-184; Martins, L.F., Kolling, D., Camassola, M., Dillon, A.J., Ramos, L.P. // Bioresource Technology. 2008. Vol. 99. P. 1417-1424; Gusakov A.V., Sinitsyn A.P. // Biofuels. 2012. Vol. 3(4). P.463-477].

Для кормовой отрасли наиболее востребованы ферменты, действующие при низких значениях рН. К ним относятся фитазы, синтезируемые представителями рода Aspergillus, которые являются промышленными продуцентами многочисленного ряда пищевых микроингредиентов.

Фитаза А А.niger является высокоактивным ферментом, способным осуществлять деструкцию фитата до мио-инозит-2-монофосфата и устойчивым к протеолитической деградации пепсином [Golovan S., Wang G., Zhang J., Forsberg C.W. Characterization and overproduction of the Escherichia coli appA encoded bifunctional enzyme that exhibits both phytase and acid phosphatase activities // Can. J. Microbiol. 2000. V. 46. P. 59-71; Wyss, M., Brugger, R., Kroneneberger, A., Remy, R.,Fimbel, R., Oesterhelt, G., Lehmann, M., and van Loon, A.P.G.M. Biochemical Characterization of Fungal Phytases (myo-Inositol Hexakisphosphate Phosphohydrolases): Catalytic Properties // Appl. Environ. Microbiol. 1999. 65. Р. 367-373.].

Таким образом, наличие фитазы А в комплексе ферментов, секретируемых штаммом P.verruculosum, позволит значительно увеличить биодоступность фосфора и минеральных веществ кормов на основе зерновых культур.

Известно, что эндо-β-1,4-ксиланазы, катализирующие неупорядоченный гидролиз ксилозидных связей между остатками D-ксилозы в основной цепи ксиланов, широко применяются в кормовой промышленности для разрушения НПС злаковых культур, используемых в кормлении моногастричных животных и птицы.

Стоит, однако, отметить, что применяемые на практике ФП ксиланаз не обладают необходимыми свойствами: достаточной термостабильностью, высокой удельной активностью, а также устойчивостью по отношению к белковым ингибиторам злаков (последние оказывают негативное действие на ксиланазы при гидролизе ксиланов, содержащихся в зерне злаков [Гусаков А.В. // Биохимия. 2010. Т. 75. № 10. С. 1331.]).

Обнаружено, что эндо-1,4-β-ксиланаза E P.canescens, принадлежащая 10-й семье гликозид-гидролаз, является весьма перспективным ферментом для использования в качестве добавки к комбикормам на основе злаков, поскольку она устойчива к действию белковых ингибиторов, присутствующих в злаках, таких как рожь, пшеница, ячмень, а также обеспечивает глубокую степень гидролиза арабиноксилана [Ю.А. Денисенко, Д.А. Мерзлов, А.В. Гусаков, А.В. Чекушина, А.П. Синицын. // Сравнительная характеристика ксиланаз XylA И XylE из гриба Penicillium canescens. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2015. Т. 56. № 6. С.348-353, Патент РФ №2653429 С1 от 08.05.2018, Бюл. №13].

В связи с этим, наличие в составе нового ФП термостабильной, неингибируемой ксиланазы, позволит значительно уменьшить вязкость НПС кормов за счёт гидролиза высоковязких растворимых в водной среде ксиланов и уменьшения их степени полимеризации, что приведет к улучшению усвояемости животными питательных веществ кормов на основе пшеницы и ржи, а совместно с фитазой А А.niger позволит эффективно использовать в рационе животных соевые и подсолнечные шроты.

Таким образом, создание нового рекомбинантного штамма P.verruculosum с высоким уровнем экспрессии гетерологичных фитазы А А.niger и эндо-1,4-β-ксиланазы E P.canescens увеличит выход целевых ферментов, способных значительно снизить вязкость НПС и увеличить усвояемость питательных веществ корма, снизив тем самым стоимость конечного продукта.

Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, состоит в получении комплексных ФП на основе новых штаммов P.verruculosum серии PhyXyl, содержащих гетерологичные гены с увеличенной экспрессией:

Штамм P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) - продуцент гетерологичных фитазы А A.niger, относящейся к мио-инозит-гексакисфосфат-3(6)фосфогидролазам, (КФ 3.1.3.8, мол. масса 63 кДа) и эндо-1,4-β-ксиланазы Е P.canescens, относящаяся к 10-й семье гликозид-гидролаз (КФ 3.2.1.8, мол. масса 40 кДа) для применения в кормопроизводстве в качестве кормовой добавки для улучшения усвояемости питательных веществ кормов, содержащих зерновые и зернобобовые культуры, пшеничные отруби и шроты за счёт снижения вязкости кормов за счёт деструкции ксиланов и разложения фитатов.

Технический результат от предлагаемого изобретения состоит улучшении усвояемости питательных веществ кормов, снижении вязкости кормов, содержащих НПС злаков и повышении кормовой ценности рационов для сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы при обработке корма новым комплексным ФП, содержащим сочетание высокоактивных ферментов как фитазу А A.niger, эндо-1,4-β-ксиланазы Е P.canescens и комплекс сопутствующих карбогидраз P.verruculosum.

Методы определения активности ферментов. В предлагаемом изобретении метод определения фитазной активности основан на скорости образования свободного фосфата при гидролизе фитата Na (из риса). Для определения фитазной активности используют 1,4 мМ раствор фитата Na в 0,1 M Na-ацетатном буфере, рН 5,0. Раствор субстрата (300 мкл) смешивают с 33 мкл раствора фермента и инкубируют 30 мин при 37°С. Реакцию останавливают добавлением 335 мкл 10%-ного раствора ТХУ (трихлоруксусной кислоты). Концентрацию свободного фосфата (Pi) определяют с помощью аммоний-молибденового реагента (13 мМ FeSO₄*7H₂O/ 8,1 мМ (NH₄)₆Mo₂O₂₄*4H₂O/0,533 М H₂SO₄). Реакционную смесь инкубируют с 665 мкл свежеприготовленного реагента в течение 30 мин при комнатной температуре. Светопоглощение измеряют при 750 нм. Концентрацию Pi определяют исходя из калибровочного графика, полученного с помощью KH₂PO₄ (0-0,2 г/л). За единицу активности принимают количество фермента, способного высвободить 1 мкмоль Pi в 1 мин [Engelen, A.J., van der Heeft, F., Randsdorp, P.H., and Smit, E.L. (1994) J. AOAC Int., 77, 760-764.].

Для определения ксиланазной активности используют метод, основанный на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС) методом Шомоди-Нельсона при гидролизе полисахаридного субстрата - ксилана из древесины бука. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС в минуту при рН 5,0 и 50°C [Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.А. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. - М.: МГУ, 1995. - 144 с].

Сущность изобретения заключается в получении нового штамма-продуцента P.verruculosum:

Изобретение заключается в получении нового штамма-продуцента P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D), который обеспечивает получение ФП комплексного действия, включающего высокоактивную гетерологичную фитазу А A.niger и эндо-1,4-β-ксиланазу Е P.canescens и комплекс сопутствующих карбогидраз P.verruculosum. Активность фитазы в КЖ после окончания ферментации в лабораторных ферментёрах составляет 1900 ед/мл по фитату натрия (рН 5,0, 40°С) и 900 ед/мл по ксилану (рН 5,0, 50°С). Комплекс сопутствующих карбогидраз представлен целлобиогидролазой I, целлобиогидролазой II и β-глюкозидазой.

Способ получения ФП предусматривает глубинное культивирование штамма - продуцента P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) на питательной среде, содержащей МКЦ, пшеничные отруби и кукурузный экстракт, глюкозу и соли с последующей распылительной сушкой КЖ и получении сухого ФП со стандартизованными до 5000 ед/г фитазной и до 3000 ед/г ксиланазной активностями. Применение нового комплексного ФП позволит повысить кормовую ценность рационов на основе зерновых и зернобобовых культур.

Изобретение реализуется следующим образом.

Штамм P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) получают из исходного штамма P.verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) путем котрансформации плазмидами pCBHI-PhyAsp, pCBHI-XylE и pSTA10 с последующей селекцией на агаризованной среде с 10 мМ NaNO₃. Получение плазмиды pCBHI-XylE описано в патенте RU 2653429.

Штамм P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) характеризуется теми же культурально-морфологическими признаками, что и описанные выше для штамма P.verruculosum PhyEG-76 - (ВКМ-4895D).

Штамм P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) отличается от исходного штамма повышенной продукцией фитазы А A.niger и неингибируемой белковыми ингибиторами злаков эндо-1,4-β-ксиланазы Е P.canescens

Новый комплексный ФП, полученный с помощью штамма P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) обладает улучшенными эксплуатационными характеристиками, что обусловлено наличием в его составе фитазы А A.niger, эндо-1,4-β-ксиланазы Е P.canescens и сопутствующих ферментов целлюлазного комплекса P.verruculosum, что является отличием данного ФП в сравнении с имеющимися на рынке коммерческими аналогами.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1 . Получение рекомбинантного штамма P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D).

Реципиентный штамм P.verruculosum PV2007 одновременно трансформируют плазмидами pCBHI-PhyAsp и pCBHI-XylE, совместно с плазмидой pSTA10 в соотношении 3:1 (мкг каждой ДНК) по стандартной методике [Sambrook, J., and Russell, D.W. (2001) Molecular cloning:a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; A.Y. Aleksenko, N.A. Makarova, I.V. Nikolaev, A.J. Clutterbuck, Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet. 28 (1995) 474-478]. В результате трансформации получают более 100 рекомбинантных штаммов (клонов) серии P.verruculosum PhyXyl, из которых в результате первичного скрининга при культивировании в качалочных колбах на стандартной питательной среде отобрано 10 клонов, обладающих высокой фитазной и ксиланазной активностями. Стандартная среда культивирования имела следующий состав (г/л): МКЦ- 40, пшеничные отруби-10, дрожжевой экстракт- 10, KH₂PO₄- 15, (NH₄)₂SO₄- 5, MgSO₄×7H₂O- 0,3, CaCl₂×2H₂O- 0,3.

Фитазная активность в КЖ отобранных при культивировании в качалочных колбах клонов серии PhyXyl варьирует от 100 до 400 ед/мл, а ксиланазная - от 30 до 450 ед/мл. Для дальнейших испытаний отобран клон PhyXyl-41, отличающийся наибольшими целевыми активностями по сравнению с исходным штаммом и другими рекомбинантными штаммами.

Пример 2. Культивирование штамма P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) в ферментёре, получение сухого ФП PhyXyl-41 и его in vitro кормовые испытания.

Культивирование штамма P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) проводят в ферментере объемом 3 л, оснащенном барботером для подачи воздуха в аппарат и турбинной мешалкой на среде 1 следующего состава:

Среда 1 (г/л):

Глюкоза - 40

МКЦ - 40

Кукурузный экстракт - 25

Пшеничные отруби - 10

KH₂PO₄ - 7

(NH₄)₂SO₄ - 5

CaCl₂ - 0,3

MgSO₄*7H₂O - 0,3

Культивирование проводят 144 ч, при рН 4,5-5,0 и 32°С. Образцы КЖ отбирают каждые сутки, начиная с 72 ч культивирования, центрифугируют и измеряют фитазную и ксиланазную активности. В конце ферментации в КЖ активность фитазы составляет 1900 ед/мл, ксиланазы - 900 ед/мл.

По окончании ферментации грибную биомассу удаляют путём центрифугирования (4000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге Avanti JXN-26, «Beckman coulter», США), свободную от клеток КЖ концентрируют с помощью ультрафильтрации (с пределом отсечения 10 кДа), ультраконцентрат сушат на распылительной сушилке (Buchi MiniSpray Dryer B-290, «BUCHI Labortechnik», Швейцария, Т_вх=135°С, Т_вых=55-65°С, степень аспирации=70%, скорость потока 0,5 л КЖ в час) с получением сухого ФП, который представляет собой светло-бежевый легко растворимый в водной среде порошок.

Таким образом, получают сухой ФП PhyXyl-41 c фитазной активностью 31200 ед/г и ксиланазной активностью 19000 ед/г.

Сухой ФП PhyXyl-41 разбавляют (стандартизуют) кукурузной мукой до 5000 ед/г по фитазной и до 3044 ед/г ксиланазной активности. Разбавленная форма сухого ФП PhyXyl-41 является его конечной формой, которую далее подвергают кормовым испытаниям in vitro. Фитазный ФП Natuphos E 10000, не имеющий никаких дополнительных, кроме фитазной, активностей, используют в роли внутреннего стандарта.

Данные результатов in vitro испытаний ФП PhyXyl-41 и Natuphos E 10000 приведены в таблице 1. Очевидно, что PhyXyl-41 превосходит ФП Natuphos E 10000 по способности гидролизовать фитин, входящий в состав соевой муки в широком диапазоне значений рН. Так, PhyXyl-41 при равной дозировке по фитазной активности при обработке соевой муки обеспечивает при рН 3 в 1,4-2 раза, при рН 5 - в 1,3 раза, при рН 7 - 1,2-2 раза более высокий выход Pi, чем ФП Natuphos E 10000. Таким образом, можно утверждать, что ФП PhyXyl-41 может быть использован в качестве эффективной кормовой добавки.

Таблица 1. Результаты in vitro кормовых испытаний ферментного препарата PhyXyl-41. Ферментный препарат Дозировка, ед. фитазной активности на 1 г соевой муки Выход фосфат-ионов (Pi), % pH 3 рН 5 рН 7 PhyXyl-41 75 32 40 12 100 40 46 14 150 58 65 18 Natuphos E 10000 75 23 31 6 100 27 35 8 150 29 49 15

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм Penicillium verruculosum PhyXyl-41, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F-4896D, предназначенный для продукции гетерологичных высокоактивной фитазы А Aspergillus niger и неингибируемой эндо-1,4-β-ксиланазы E Penicillium canescens. Также предложен способ получения ферментного препарата PhyXyl-41, полученного на основе рекомбинантного штамма Penicillium verruculosum PhyXyl-4. Изобретение обеспечивает улучшение усвояемости питательных веществ кормов, снижение вязкости кормов, содержащих некрахмальные полисахариды злаков, и повышение кормовой ценности рационов для моногастричных животных и птицы. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

1. Рекомбинантный штамм Penicillium verruculosum PhyXyl-41, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F-4896D, предназначенный для продукции гетерологичных высокоактивной фитазы А Aspergillus niger и неингибируемой эндо-1,4-β-ксиланазы E Penicillium canescens.

2. Способ получения ферментного препарата PhyXyl-41, полученного на основе рекомбинантного штамма Penicillium verruculosum PhyXyl-41 по п.1, при выращивании на ферментационной среде, обеспечивающий получение ферментного препарата комплексного действия, включающего гетерологичные высокоактивную фитазу А Aspergillus niger и неингибируемую эндо-1,4-β-ксиланазу E Penicillium canescens, а также комплекс сопутствующих карбогидраз Penicillium verruculosum, представленный целлобиогидролазой I, целлобиогидролазой II и β-глюкозидазой, и состоящий в культивировании рекомбинантного штамма по п.1, на ферментационной среде, состоящей из (г/л): глюкоза - 40, микрокристаллическая целлюлоза - 40, кукурузный экстракт - 25, пшеничные отруби - 10, дигидрофосфат калия - 7, сульфат аммония - 5, хлорид кальция - 0,3, семиводный сульфат магния - 0,3.