ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ФИТАЗЫ А И ЭНДО-1,4-β-ГЛЮКАНАЗЫ II И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ ДОБАВКИ В КОРМАХ Российский патент 2023 года по МПК C12N1/15 C12N9/16 C12N9/30 C12N15/80 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, а именно, к созданию и производству комплексных высокоэффективных ферментных препаратов (ФП), содержащих высокоактивные термостабильные ферменты. Изобретение может быть использовано в кормовой отрасли в качестве добавки к кормам сельскохозяйственных животных и птицы, например, поросят или кур-бройлеров, ведущей к уменьшению негативного воздействия некрахмальных полисахаридов (НПС) и фитатов кормов на основе зерновых и бобовых.

К НПС относится широкий круг веществ: пентозаны, пектиновые вещества, арабиноксиланы, β-глюканы, пектины, маннаны, галактоолигосахариды. Их соотношение и содержание различно в зависимости от вида корма. Арабиноксиланы в большом количестве находятся в пшенице, рапсе, ячмене, кукурузе (около 7%), β-глюканы - в ячмене и овсе (около 4%). Много пектинов содержится в подсолнечнике, рапсе, горохе и сое (около 6%), галактоолигосахаридов - в сое (4%), а также рапсе (3%). Большое количество НПС также содержит рожь. В отдельных растительных продуктах переработки (например, отрубях) содержание НПС может превышать 20%, а в злаковых их содержание колеблется от 5 до 13%.

Попадая в пищеварительный тракт моногастричных животных (поросят и птицы), НПС затрудняют переваривание и всасывание питательных веществ. В итоге образуется застой желеобразной кормовой массы, которая служит субстратом для развития условно-патогенной микрофлоры. НПС, в большом количестве присутствующие во многих кормах, травмируют слизистые кишечника, могут увеличивать вязкость кормовой массы в кишечнике, затрудняя тем самым процессы всасывания питательных веществ. Большое количество сырой клетчатки в корме сроки прохождения пищи в пищеварительном тракте, препятствуя ферментативным процессам, эвакуируя из кишечника полезную микрофлору.

Моногастричные животные, в силу особенностей пищеварения отличающиеся от жвачных, практически не могут разрушать межклеточные стенки зерновых компонентов содержащие в своем составе различные НПС, в связи с этим особую актуальность приобретают использование комплексных ферментных добавок в рационах этих видов животных.

Продукты расщепления НПС могут служить пребиотиком и стимулировать развитие и рост полезной микрофлоры. Применение ферментных препаратов снижает вязкость кормовых масс (химуса) в подвздошной кишке, что позволяет животным лучше переваривать жиры, аминокислоты и минеральные компоненты [Jacob J.P., Pescatore A.J. // Annals of Translational Medicine, 2014, Vol.2, No.2. doi: 10.3978/j.issn.2305-5839.2014.01.02.].

Одним из необходимых минеральных веществ для развития здорового организма является фосфор, составляющий основу костной ткани, нуклеиновых кислот, фосфолипидов, молекул-энергоносителей. В зерновых и бобовых растениях около 60-80% общего фосфора находится в форме фитатов - недоступной для питания высших эукариот формой фосфорорганических соединений. Поэтому фосфор является необходимым компонентом комбикормов. Для поддержания здоровья, продуктивности и нормального функционирования организма животных и птицы этот макроэлемент должен поступать с кормом в достаточных количествах. Особенно остро нуждается в фосфоре молодняк, в частности бройлеры. Селекция мясной птицы по скорости роста привела к тому, что развитие костяка отстает от формирования мышечной ткани. В связи с этим у цыплят часто отмечаются аномалии ног незаразной этиологии. Однако, фосфор, в виде фитиновой кислоты и ее солей - фитатов, усваивается взрослой птицей на 50, молодняком - на 30 процентов. Кроме того, фитаты связывают положительно заряженные ионы металлов, относящиеся к макро- и микроэлементам (ионы кальция, цинка, железа, марганца, магния), а также белки, аминокислоты и крахмал, снижая их биодоступность. Фитаза не вырабатывается животными организмами, а в растениях ее содержится мало, вследствие чего фосфор практически не доступен птице и другим животным [Каиров, В.Р. Пути повышения эффективности комбикормов для сельскохозяйственной птицы [Текст] / В.Р. Каиров, Н.Ш. Дзигоева // Известия Горского государственного аграрного университета. Т.49, ч.3, Владикавказ, 2012. - С. 119-121.].

Поэтому для удовлетворения потребностей в фосфоре в комбикорма приходится включать дорогостоящие препараты неорганического фосфора [Ленкова Т.Н., Егорова Т.А., Сысоева И.Г., Кривопишина Л.В. Отечественная фитаза // Птицеводство. 2015. №10. С.2-6]. [Синицын, А. Ферментные препараты на основе фитазы [Текст] / А. Синицын, О. Синицына // Птицеводство. - 2005. - №9. - С.35.].

Таким образом, основным способом уменьшения негативного влияния НПС и фитатов кормов является использование экзогенных ферментов, которые будучи включенными в состав корма дополняют ферментную систему птицы, обеспечивают переваривание и в результате способствуют улучшению использования питательных веществ рациона, а также улучшают здоровье сельскохозяйственных животных и птицы.

Целлюлазы и β-глюканазы «разрыхляют» клетчатку, расщепляют β-глюканы, способствуют сорбции ей токсинов и увеличивают переваримость целлюлозы, стимулируют рост собственной полезной микрофлоры в кишечнике.

Ксиланаза гидролизирует ксиланы и арабиноксиланы до моно-, ди- и трисахаридов, а также олигосахаридов с более высокой степенью полимеризации. В результате применения препаратов на основе ксиланазы повышается скорость прохождения пищи в кишечнике, снижается вязкость химуса.

Фитаза переводит связанный, неусвояемый фосфор зерна в доступную для усвоения форму, увеличивает доступность энергии, протеина, макро- и микроэлементов из зерновых, жмыхов и шротов.

В условиях рыночной экономики главной задачей сельскохозяйственных предприятий становиться увеличение экономической эффективности производства, повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы и снижение ее себестоимости. Успехи, достигнутые в области изучения роли микрофлоры кишечника в гидролизе сложных органических соединений кормов и всасывания их метаболитов через слизистую оболочку кишечника, в формировании и развитии ферментативного звена пищеварительной системы, явились предпосылкой разработки и использования кормовых ферментных препаратов. Поэтому проблема обеспечения промышленного птицеводства высококачественными ферментными препаратами, подходящими для различного состава рациона, является важной прикладной задачей.

Мицелиальный гриб Penicillium verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) обладает гидролитическим комплексом внеклеточных ферментов, способным к эффективной биоконверсии полисахаридов растительной биомассы, в том числе антипитательной составляющей кормов в виде НПС. В этот комплекс входят целлобиогидролазы, эндоглюканазы и β-глюкозидаза. На основе реципиентного штамма P.verruculosum 537 (∆niaD) создана экспрессионная система [Патент RU 2378372 С2, опубликовано 10.01.2010, Бюл. №1], что позволяет использовать данный гриб как основу для получения рекомбинантных штаммов - продуцентов ферментов для практического применения в различных областях промышленности и сельского хозяйства [Skomarovsky, A.A., Gusakov, A.V., Okunev, O.N., Solov’eva, I.V., Bubnova, T.V., Kondrat’eva, E.G., Synitsyn, A.P. // Applied Biochemistry and Microbiology. 2005. Vol. 41. P. 182-184; Martins, L.F., Kolling, D., Camassola, M., Dillon, A.J., Ramos, L.P. // Bioresource Technology. 2008. Vol. 99. P. 1417-1424; Gusakov A.V., Sinitsyn A.P. // Biofuels. 2012. Vol. 3(4). P.463-477.].

Для кормовой отрасли наиболее востребованы ферменты, действующие при низких значениях рН. К ним относятся фитазы, синтезируемые представителями рода Aspergillus, которые являются промышленными продуцентами многочисленного ряда пищевых микроингредиентов.

Фитаза А А.niger является высокоактивным ферментом, способным осуществлять деструкцию фитата до мио-инозит-2-монофосфата и устойчивым к протеолитической деградации пепсином [Golovan S., Wang G., Zhang J., Forsberg C.W. Characterization and overproduction of the Escherichia coli appA encoded bifunctional enzyme that exhibits both phytase and acid phosphatase activities // Can. J. Microbiol. 2000. V. 46. P. 59-71; Wyss, M., Brugger, R., Kroneneberger, A., Remy, R.,Fimbel, R., Oesterhelt, G., Lehmann, M., and van Loon, A.P.G.M. Biochemical Characterization of Fungal Phytases (myo-Inositol Hexakisphosphate Phosphohydrolases): Catalytic Properties // Appl. Environ. Microbiol. 1999. 65. Р. 367-373.].

Таким образом, наличие фитазы А в комплексе ферментов, секретируемых штаммом P.verruculosum, позволит значительно увеличить биодоступность фосфора и минеральных веществ кормов на основе зерновых культур.

Одними из ключевых ферментов, используемых в качестве кормовой добавки для расщепления НПС, являются β-глюканазы. В состав ферментного комплекса P.verruculosum входит высокоэффективная эндо-1,4-β-глюканаза II, относящаяся к 5-ой семье гликозид-гидролаз. Эндо-1,4-β-глюканаза II имеет высокую молекулярную активность по отношению к β-глюканазу и обладает устойчивостью к воздействию высоких температур. [Проскурина О.В. с соавт. // Катализ в промышленности. 2013. №5. С.65-73, Мерзлов Д.А. с соавт. // Свойства ферментных препаратов и гомогенных ферментов эндоглюканазы EG2 Penicillium verruculosum и эндоглюканазы LAM Myceliophtora thermophile. Биохимия, 2015, том 20, вып.4, С.556-567, Синицын А.П. с соавт //Оптимизация состава целлюлазного ферментного комплекса Penicillium verruculosum: увеличение гидролитической способности с помощью методов генетической инженерии. Кат в пром. 2015, Т. 15, №6, С.78-83].

Таким образом, наличие в составе ФП высокоактивной эндо-1,4-β-глюканазы II позволит значительно уменьшить степень полимеризации и вязкость НПС, что приведет к улучшению усвояемости животными питательных веществ кормов на основе ячменя, пшеницы и тритикале, а совместно с фитазой А А.niger позволит эффективно использовать в рационе животных соевые и подсолнечные шроты.

Известно, что эндо-β-1,4-ксиланазы, катализирующие неупорядоченный гидролиз ксилозидных связей между остатками D-ксилозы в основной цепи ксиланов, широко применяются в кормовой промышленности для разрушения НПС злаковых культур, используемых в кормлении моногастричных животных и птицы.

Стоит, однако, отметить, что применяемые на практике ФП ксиланаз не обладают необходимыми свойствами: достаточной термостабильностью, высокой удельной активностью, а также устойчивостью по отношению к белковым ингибиторам злаков (последние оказывают негативное действие на ксиланазы при гидролизе ксиланов, содержащихся в зерне злаков [Гусаков А.В. // Биохимия. 2010. Т. 75. № 10. С. 1331.]).

Обнаружено, что эндо-1,4-β-ксиланаза E P.canescens, принадлежащая 10-й семье гликозид-гидролаз, является весьма перспективным ферментом для использования в качестве добавки к комбикормам на основе злаков, поскольку она устойчива к действию белковых ингибиторов, присутствующих в злаках, таких как рожь, пшеница, ячмень, а также обеспечивает глубокую степень гидролиза арабиноксилана [Ю.А. Денисенко, Д.А. Мерзлов, А.В. Гусаков, А.В. Чекушина, А.П. Синицын. // Сравнительная характеристика ксиланаз XylA И XylE из гриба Penicillium canescens. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2015. Т. 56. № 6. С.348-353, Патент РФ №2653429 С1 от 08.05.2018, Бюл. №13].

В связи с этим, наличие в составе нового ФП термостабильной, неингибируемой ксиланазы, позволит значительно уменьшить вязкость НПС кормов за счет гидролиза высоковязких растворимых в водной среде ксиланов и уменьшения их степени полимеризации, что приведет к улучшению усвояемости животными питательных веществ кормов на основе пшеницы и ржи, а совместно с фитазой А А.niger позволит эффективно использовать в рационе животных соевые и подсолнечные шроты.

Таким образом, создание новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum с высоким уровнем экспрессии гетерологичной фитазы А А.niger, гомологичной эндо-β-1,4-глюканазы II и гетерологичной фитазы А А.niger, а также гетерологичных эндо-1,4-β-ксиланазы E P.canescens и фитазы А А.niger увеличит выход целевых ферментов, способных значительно снизить вязкость НПС и увеличить усвояемость питательных веществ корма, снизив тем самым стоимость конечного продукта.

Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, состоит в получении комплексных ФП на основе новых штаммов P.verruculosum серий PhyEG и PhyXyl, содержащих гетерологичные и гомологичные гены с увеличенной экспрессией в следующих вариантах:

Вариант 1. Штамм P.verruculosum PhyEG-76 - (ВКМ-4895D) - продуцент гомологичной эндо-β-1,4-глюканазы II, относящаяся к 5-ой семье гликозид-гидролаз (КФ 3.2.1.4, мол. масса 39 кДа) и гетерологичной фитазы А A.niger, относящейся к мио-инозит-гексакисфосфат-3(6)фосфогидролазам, (КФ 3.1.3.8, мол. масса 63 кДа) для применения в кормопроизводстве в качестве кормовой добавки для улучшения усвояемости питательных веществ кормов, содержащих зерновые и зернобобовые культуры, пшеничные отруби и шроты за счет разрыхления клетчатки, деструкции β-глюканов и разложения фитатов.

Вариант 2. Штамм P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) - продуцент гетерологичных фитазы А A.niger, относящейся к мио-инозит-гексакисфосфат-3(6)фосфогидролазам, (КФ 3.1.3.8, мол. масса 63 кДа) и эндо-1,4-β-ксиланазы Е P.canescens, относящаяся к 10-й семье гликозид-гидролаз (КФ 3.2.1.8, мол. масса 40 кДа) для применения в кормопроизводстве в качестве кормовой добавки для улучшения усвояемости питательных веществ кормов, содержащих зерновые и зернобобовые культуры, пшеничные отруби и шроты за счет снижения вязкости кормов за счет деструкции ксиланов и разложения фитатов.

Технический результат от предлагаемого изобретения состоит улучшении усвояемости питательных веществ кормов, снижении вязкости кормов, содержащих НПС злаков и повышении кормовой ценности рационов для сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы при обработке корма новыми комплексными ФП, содержащими такие сочетания высокоактивных ферментов как вариант вариант 1- фитазу А A.niger, эндо-β-1,4-глюканазы II P.verruculosum, и комплекс сопутствующих карбогидраз P.verruculosum; вариант 2 - фитазу А A.niger, эндо-1,4-β-ксиланазы Е P.canescens и комплекс сопутствующих карбогидраз P.verruculosum.

Методы определения активности ферментов. В предлагаемом изобретении метод определения фитазной активности основан на скорости образования свободного фосфата при гидролизе фитата Na (из риса). Для определения фитазной активности используют 1,4 мM раствор фитата Na в 0,1 M Na-ацетатном буфере, рН 5,0. Раствор субстрата (300 мкл) смешивают с 33 мкл раствора фермента и инкубируют 30 мин при 37⁰С. Реакцию останавливают добавлением 335 мкл 10%-ного раствора ТХУ (трихлоруксусной кислоты). Концентрацию свободного фосфата (Рi) определяют с помощью аммоний-молибденового реагента (13 мМ FeSO₄*7H₂O/ 8,1 мМ (NH₄)₆Mo₂O₂₄*4H₂O/0,533 М H₂SO₄). Реакционную смесь инкубируют с 665 мкл свежеприготовленного реагента в течение 30 мин при комнатной температуре. Светопоглощение измеряют при 750 нм. Концентрацию Рi определяют исходя из калибровочного графика, полученного с помощью KH₂PO₄ (0-0,2 г/л). За единицу активности принимают количество фермента, способного высвободить 1 мкмоль Рi в 1 мин [Engelen, A.J., van der Heeft, F., Randsdorp, P.H., and Smit, E.L. (1994) J. AOAC Int., 77, 760-764.].

Для определения β-глюканазной, эндоглюканазной (КМЦ-азной), целлобиогидролазной и ксиланазной активностей используют методы, основанные на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС) методом Шомоди-Нельсона при гидролизе полисахаридных субстратов - β-глюкана ячменя, Na-соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) и ксилана из древесины березы, соответственно. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС в минуту при рН 5,0 и 50ºC [Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.А. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. - М.: МГУ, 1995. - 144 с].

β-Глюкозидазную активность определяют по скорости образования п-нитрофенола при гидролизе п-НФ-α-D-глюкопиранозида, за единицу активности принимают количество фермента, необходимое для образования 1 мкмоль п-нитрофенола в течение 1 минуты при рН 5,0 и 40°C [Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. // Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. - М.: ВИНИТИ, 1993. Т. 25, С. 30-37].

Сущность изобретения заключается в получении новых штаммов-продуцентов P.verruculosum:

Вариант 1 заключается в получении нового штамма - продуцента P.verruculosum PhyEG-76 - (ВКМ-4895D), который обеспечивает получение ФП комплексного действия, включающего высокоактивную гетерологичную фитазу А A.niger, гомологичную эндо-1,4-β-глюканазу II и комплекс сопутствующих карбогидраз P.verruculosum. Активность фитазы в КЖ после окончании ферментации в лабораторных ферментерах составляет 2250 ед/мл по фитату натрия из риса (рН 5,0, 40°С) и 1300 ед/мл по КМЦ (рН 5,0, 50°С). Комплекс сопутствующих карбогидраз представлен эндо-1,4-β-глюканазу II, целлобиогидролазой I, целлобиогидролазой II и β-глюкозидазой.

Способ получения ФП предусматривает глубинное культивирование штамма - продуцента P.verruculosum PhyEG-76 - (ВКМ-4895D) на питательной среде, содержащей МКЦ, пшеничные отруби и кукурузный экстракт, глюкозу и соли с последующей распылительной сушкой КЖ с последующей распылительной сушкой КЖ и получении сухого ФП со стандартизованной до 5000 ед/г фитазной и до 2500 ед/г КМЦ-азной (эндоглюканазной) активностями. Изобретение позволяет получать ФП с высокой активностью гетерологичной фитазы А одновременно с повышением продукции собственной эндо-1,4-β-глюканазы II. Применение нового комплексного ФП позволит повысить кормовую ценность рационов на основе зерновых и зернобобовых культур.

Изобретение реализуется следующим образом.

Штамм P.verruculosum PhyEG-76 - (ВКМ-4895D) получают из исходного штамма P.verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) путем котрансформации плазмидами pCBHI-PhyAsp, pCBHI-EG2 и pSTA10 с последующей селекцией на агаризованной среде с 10 мМ NaNO₃. Получение плазмиды pCBHI-EG2 было описано в патенте RU2378372 ранее.

Штамм P.verruculosum PhyEG-76 - (ВКМ-4895D) характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками:

Растет на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар, сусло-агар) при 26-30°С в течение 7-10 суток, рН 4,5-5,0.

На среде Чапека с дрожжевым экстрактом при культивировании гриба при 25°С на 7 сутки колонии достигают 24-30 мм в диаметре, складчатые, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, имеет ширину 1,5-2,0 мм. Мицелий светло-желтоватый, шерстистый, центр колонии выпуклый, конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая, в центре колонии - палево-оранжевая. При температуре 37°С колонии диаметром 5 мм, мицелий светлый, конидиообразования нет. При температуре 5°С роста нет.

При росте на Мальц-агаре диаметр колонии 23-24 мм, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, шириной 1,5-2,0 мм. Мицелий белый, шерстистый, прижатый, конидиогенез очень слабый, практически отсутствует. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая.

При микроскопировании штамм имеет конидиеносцы двухярусные, терминальные, бивертициллятные, гладкие длиной около 150 мкм, шириной 2-3мкм. Метулы расходящиеся размером 10-13 х2,5-3,0 мкм, фиалиды ампуллиформные размером 7-8 х 2,8-3,0 мкм. Конидии округлые, шероховатые размером 3,0-3,5 мкм.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,35 ч^-1, в конце культивирования 0,1 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма:

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз.

Резистентность к нистатину хорошая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен быстро ассимилировать глюкозу, глицерин, галактозу, D-маннозу, D-маннит, трегалозу, сорбозу и сорбит, медленнее - D-ксилозу, L- и D-арабинозу, L-рамнозу и рибозу. Слабо ассимилирует: D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу и 5-тио-D-глюкозу.

Использует неорганический и органический азот, хорошо ассимилирует нитратную и аммонийную формы азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, β-глюкане.

Штамм P.verruculosum PhyEG-76 - (ВКМ-4895D) отличается от исходного повышенной продукцией фитазы А A.niger и повышенной продукцией собственной эндо-1,4-β-глюканазы II.

Новый комплексный ФП, полученный с помощью штамма P.verruculosum PhyEG-76 - (ВКМ-4895D) обладает улучшенными эксплуатационными характеристиками, что обусловлено наличием в его составе фитазы А A.niger и эндо-1,4-β-глюканазы II, что является отличием данного ФП в сравнении с имеющимися на рынке коммерческими аналогами.

Вариант 2 заключается в получении нового штамма-продуцента P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D), который обеспечивает получение ФП комплексного действия, включающего высокоактивную гетерологичную фитазу А A.niger и эндо-1,4-β-ксиланазу Е P.canescens и комплекс сопутствующих карбогидраз P.verruculosum. Активность фитазы в КЖ после окончания ферментации в лабораторных ферментерах составляет 1900 ед/мл по фитату натрия (рН 5,0, 40°С) и 900 ед/мл по ксилану (рН 5,0, 50°С). Комплекс сопутствующих карбогидраз представлен целлобиогидролазой I, целлобиогидролазой II и β-глюкозидазой.

Способ получения ФП предусматривает глубинное культивирование штамма - продуцента P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) на питательной среде, содержащей МКЦ, пшеничные отруби и кукурузный экстракт, глюкозу и соли с последующей распылительной сушкой КЖ и получении сухого ФП со стандартизованными до 5000 ед/г фитазной и до 3000 ед/г ксиланазной активностями. Применение нового комплексного ФП позволит повысить кормовую ценность рационов на основе зерновых и зернобобовых культур.

Изобретение реализуется следующим образом.

Штамм P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) получают из исходного штамма P.verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) путем котрансформации плазмидами pCBHI-PhyAsp, pCBHI-XylE и pSTA10 с последующей селекцией на агаризованной среде с 10 мМ NaNO₃. Получение плазмиды pCBHI-XylE описано в патенте RU 2653429.

Штамм P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) характеризуется теми же культурально-морфологическими признаками, что и описанные выше для штамма P.verruculosum PhyEG-76 - (ВКМ-4895D).

Штамм P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) отличается от исходного штамма повышенной продукцией фитазы А A.niger и неингибируемой белковыми ингибиторами злаков эндо-1,4-β-ксиланазы Е P.canescens

Новый комплексный ФП, полученный с помощью штамма P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) обладает улучшенными эксплуатационными характеристиками, что обусловлено наличием в его составе фитазы А A.niger, эндо-1,4-β-ксиланазы Е P.canescens и сопутствующих ферментов целлюлазного комплекса P.verruculosum, что является отличием данного ФП в сравнении с имеющимися на рынке коммерческими аналогами.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1 . Получение рекомбинантного штамма P.verruculosum PhyEG-76 - (ВКМ-4895D).

Реципиентный штамм P.verruculosum 537 PV2007 одновременно трансформируют плазмидами pCBHI-PhyAsp и pCBHI-EG2, совместно с плазмидой pSTA10 в соотношении 3:1 (мкг каждой ДНК) по стандартной методике [Sambrook, J., and Russell, D.W. (2001) Molecular cloning:a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; A.Y. Aleksenko, N.A. Makarova, I.V. Nikolaev, A.J. Clutterbuck, Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet. 28 (1995) 474-478]. В результате трансформации получают более 100 рекомбинантных штаммов (клонов) серии P.verruculosum PhyEG, из которых в результате первичного скрининга при культивировании в качалочных колбах на стандартной питательной среде отбирают 10 клонов, обладающих высокой фитазной и КМЦ-азной активностями. Стандартная среда культивирования имеет следующий состав (г/л):

МКЦ- 40,

пшеничные отруби- 10,

дрожжевой экстракт- 10,

KH₂PO₄- 15,

(NH₄)₂SO₄- 5,

MgSO₄×7H₂O- 0,3,

CaCl₂×2H₂O- 0,3.

Фитазная активность в КЖ отобранных при культивировании в колбах клонов серии PhyEG варьирует от 200 до 800 ед/мл, а КМЦ-азная от 70 до 210 ед/мл. Для дальнейших испытаний был отобран клон PhyEG-76, отличающийся наибольшими целевыми активностями по сравнению с исходным штаммом и другими рекомбинантными штаммами.

Пример 2. Культивирование штамма P.verruculosum PhyEG-76 - (ВКМ-4895D) в ферментере, получение сухого ФП PhyEG-76 и его in vitro кормовые испытания.

Культивирование штамма P.verruculosum PhyEG-76 проводят в ферментере объемом 3 л, оснащенном барботером для подачи воздуха в аппарат и турбинной мешалкой на среде 1 следующего состава:

Среда 1 (г/л):

Глюкоза- 40

МКЦ- 40

Кукурузный экстракт- 25

Пшеничные отруби- 10

KH₂PO₄- 7

(NH₄)₂SO₄- 5

CaCl₂- 0,3

MgSO₄*7H₂O- 0,3

Культивирование проводят в течение 144 ч, при рН 4,5-5,0 и 32^оС. Образцы КЖ отбирают каждые сутки, начиная с 72 ч культивирования, центрифугируют и измеряют фитазную и КМЦ-азную активности. В конце ферментации в КЖ активность фитазы составила 2250 ед/мл, КМЦазы - 1300 ед/мл.

По окончании ферментации грибную биомассу удаляют путем центрифугирования (4000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге Avanti JXN-26, «Beckman coulter», США), свободную от клеток КЖ концентрируют с помощью ультрафильтрации (с пределом отсечения 10 кДа), ультраконцентрат сушат на распылительной сушилке (Buchi MiniSpray Dryer B-290, «BUCHI Labortechnik», Швейцария, Т_вх=135^оС, Т_вых=55-65^оС, степень аспирации=70%, скорость потока 0,5 л КЖ в час) с получением сухого ФП, который представляет собой светло-бежевый легко растворимый в водной среде порошок.

Таким образом, получают сухой ФП PhyEG-76 c фитазной активностью 43100 ед/г и КМЦ-азной (эндоглюканазной) активностью 19500 ед/г.

Сухой ФП PhyEG-76 разбавляют (стандартизируют) кукурузной мукой до 5000 ед/г фитазной активности и до 2500 ед/г КМЦ-азной (эндоглюканзной) активности. Разбавленная форма сухого ФП PhyEG-76 является его конечной формой, которую далее подвергают кормовым испытаниям in vitro. Фитазный ФП Natuphos E 10000 не имеющий никаких дополнительных активностей кроме фитазной, используют в роли внутреннего стандарта.

Данные результатов in vitro испытаний ФП PhyEG-76 и Natuphos E 10000 приведены в таблице 2. Очевидно, что PhyEG-76 превосходит ФП Natuphos E 10000 по способности гидролизовать фитин, входящий в состав соевой муки в широком диапазоне значений рН. Так, PhyEG-76 при равной дозировке по фитазной активности при обработке соевой муки обеспечивает при рН 3 в 1,3-2 раза, при рН 5 - в 1,3-1,4 раза, при рН 7 - 1,2-2 раза более высокий выход Pi, чем ФП Natuphos E 10000. Таким образом, можно утверждать, что ФП PhyEG-76 может быть использован в качестве эффективной кормовой добавки.

Таблица 2. Результаты in vitro кормовых испытаний ферментного препарата PhyEG-76. Ферментный препарат Дозировка, ед. фитазной активности на 1 г соевой муки Выход фосфат-ионов (Pi), % pH 3 рН 5 рН 7 PhyEG-76 75 30 40 12 100 41 47 15 150 59 66 18 Natuphos E 10000 75 23 31 6 100 27 35 8 150 29 49 15

Пример 3 . Получение рекомбинантного штамма P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D).

Реципиентный штамм P.verruculosum 537 (ΔniaD) одновременно трансформируют плазмидами pCBHI-PhyAsp и pCBHI-XylE, совместно с плазмидой pSTA10 в соотношении 3:1 (мкг каждой ДНК) по стандартной методике [Sambrook, J., and Russell, D.W. (2001) Molecular cloning:a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; A.Y. Aleksenko, N.A. Makarova, I.V. Nikolaev, A.J. Clutterbuck, Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet. 28 (1995) 474-478]. В результате трансформации получают более 100 рекомбинантных штаммов (клонов) серии P.verruculosum PhyXyl, из которых в результате первичного скрининга при культивировании в качалочных колбах на стандартной питательной среде отобрано 10 клонов, обладающих высокой фитазной и ксиланазной активностями. Стандартная среда культивирования имела следующий состав (г/л): МКЦ- 40, пшеничные отруби-10, дрожжевой экстракт- 10, KH₂PO₄- 15, (NH₄)₂SO₄- 5, MgSO₄×7H₂O- 0,3, CaCl₂×2H₂O- 0,3.

Фитазная активность в КЖ отобранных при культивировании в качалочных колбах клонов серии PhyXyl варьирует от 100 до 400 ед/мл, а ксиланазная - от 30 до 450 ед/мл. Для дальнейших испытаний отобран клон PhyXyl-41, отличающийся наибольшими целевыми активностями по сравнению с исходным штаммом и другими рекомбинантными штаммами.

Пример 4. Культивирование штамма P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) в ферментере, получение сухого ФП PhyXyl-41 и его in vitro кормовые испытания.

Культивирование штамма P.verruculosum PhyXyl-41 - (ВКМ-4896D) проводят в ферментере объемом 3 л, оснащенном барботером для подачи воздуха в аппарат и турбинной мешалкой на среде 1 следующего состава:

Среда 1 (г/л):

Глюкоза- 40

МКЦ- 40

Кукурузный экстракт- 25

Пшеничные отруби- 10

KH₂PO₄- 7

(NH₄)₂SO₄- 5

CaCl₂- 0,3

MgSO₄*7H₂O- 0,3

Культивирование проводят 144 ч, при рН 4,5-5,0 и 32^оС. Образцы КЖ отбирают каждые сутки, начиная с 72 ч культивирования, центрифугируют и измеряют фитазную и ксиланазную активности. В конце ферментации в КЖ активность фитазы составляет 1900 ед/мл, ксиланазы - 900 ед/мл.

По окончании ферментации грибную биомассу удаляют путем центрифугирования (4000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге Avanti JXN-26, «Beckman coulter», США), свободную от клеток КЖ концентрируют с помощью ультрафильтрации (с пределом отсечения 10 кДа), ультраконцентрат сушат на распылительной сушилке (Buchi MiniSpray Dryer B-290, «BUCHI Labortechnik», Швейцария, Т_вх=135^оС, Т_вых=55-65^оС, степень аспирации=70%, скорость потока 0,5 л КЖ в час) с получением сухого ФП, который представляет собой светло-бежевый легко растворимый в водной среде порошок.

Таким образом, получают сухой ФП PhyXyl-41 c фитазной активностью 31200 ед/г и ксиланазной активностью 19000 ед/г.

Сухой ФП PhyXyl-41 разбавляют (стандартизуют) кукурузной мукой до 5000 ед/г по фитазной и до 3044 ед/г ксиланазной активности. Разбавленная форма сухого ФП PhyXyl-41 является его конечной формой, которую далее подвергают кормовым испытаниям in vitro. Фитазный ФП Natuphos E 10000 не имеющий никаких дополнительных кроме фитазной активностей, используют в роли внутреннего стандарта.

Данные результатов in vitro испытаний ФП PhyXyl-41 и Natuphos E 10000 приведены в таблице 3. Очевидно, что PhyXyl-41 превосходит ФП Natuphos E 10000 по способности гидролизовать фитин, входящий в состав соевой муки в широком диапазоне значений рН. Так, PhyXyl-41 при равной дозировке по фитазной активности при обработке соевой муки обеспечивает при рН 3 в 1,4-2 раза, при рН 5 - в 1,3 раза, при рН 7 - 1,2-2 раза более высокий выход Pi, чем ФП Natuphos E 10000. Таким образом, можно утверждать, что ФП PhyXyl-41 может быть использован в качестве эффективной кормовой добавки.

Таблица 3. Результаты in vitro кормовых испытаний ферментного препарата PhyXyl-41. Ферментный препарат Дозировка, ед. фитазной активности на 1 г соевой муки Выход фосфат-ионов (Pi), % pH 3 рН 5 рН 7 PhyXyl-41 75 32 40 12 100 40 46 14 150 58 65 18 Natuphos E 10000 75 23 31 6 100 27 35 8 150 29 49 15

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм Penicillium verruculosum PhyEG-76, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ-4895D и предназначенный для продукции гомологичной высокоактивной эндо-1,4-β-глюканазы II и гетерологичной высокоактивной фитазы А Aspergillus niger. Также предложен способ получения ферментного препарата PhyEG-76, полученного на основе рекомбинантного штамма Penicillium verruculosum PhyEG-76. Изобретение обеспечивает улучшение усвояемости питательных веществ кормов, снижение вязкости кормов, содержащих некрахмальные полисахариды злаков, и повышение кормовой ценности рационов для сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

1. Рекомбинантный штамм Penicillium verruculosum PhyEG-76, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ-4895D, предназначенный для продукции гомологичной высокоактивной эндо-1,4-β-глюканазы II и гетерологичной высокоактивной фитазы А Aspergillus niger.

2. Способ получения ферментного препарата PhyEG-76, полученного на основе рекомбинантного штамма Penicillium verruculosum PhyEG-76 по п. 1, при выращивании на ферментационной среде обеспечивающий получение ферментного препарата комплексного действия, включающего гомологичную высокоактивную эндо-1,4-β-глюканазу II и гетерологичную высокоактивную фитазу А Aspergillus niger, а также комплекс сопутствующих карбогидраз Penicillium verruculosum, представленный эндо-1,4-β-глюканазой II, целлобиогидролазой I, целлобиогидролазой II и β-глюкозидазой, и состоящий в культивировании рекомбинантного штамма по п. 1, на ферментационной среде, состоящей из (г/л): глюкоза - 40, микрокристаллическая целлюлоза - 40, кукурузный экстракт - 25, пшеничные отруби - 10, дигидрофосфат калия - 7, сульфат аммония - 5, хлорид кальция - 0,3, семиводный сульфат магния - 0,3.