СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННОЙ ФРАКЦИИ КОРТИЗОЛА В МОЧЕ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/536 

Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии, а именно к лабораторным способам определения кортикостероидов в моче.

Известен способ определения суммарных и конъюгированных фракций глюкокортикоидов в моче по модифицированному методу Сильбера-Портера.

(Silber R.H., Porter C.C. Determination of 17,21 -dihydroxy - 20- ketosteroids in urine and plasma. - J. Biol. Chem., 1954, 210, N 2, p. 923-932).

Метод основан на определении суммарных, т.е. конъюгированных с глюкуроновой кислотой, и свободных 17-оксикортикостероидов. Для определения суммарной фракции мочу перед экстракцией обрабатывают b-глюкуронидазой, расщепляющей глюкурониды, а определение свободных 17-ОКС производится из нативной мочи. 17-ОКС экстрагируют хлороформом и количественно определяют по цветной реакции с фенилгидразином.

Данный способ принят нами за прототип.

Однако он обладает рядом недостатков:
1. Чувствительность определения достаточно низка и составляет около 15 мкг в пробе, оптимальный диапазон колеблется от 1,5 до 30 мкг.

2. Определяемые данным методом хромогены Портера-Сильбера составляют только около 40% всех продуктов обмена гидрокортизона.

3. Присутствие в моче билирубина, аскорбиновой кислоты, некоторых лекарственных препаратов и красящих веществ, содержащихся в пищевых препаратах (свекла, апельсины, морковь и т.д.) искажает результаты анализов.

4. Определяемые данным методом неконъюгированные свободные 17-ОКС составляют 1-6% от суммарного количества.

5. Данный метод трудоемок, требует большого количества перегнанных в условиях лаборатории токсических органических растворителей, вредно влияющих на организм исследователя.

Целью изобретения является повышение специфичности и чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения конъюгированных фракций кортизола в моче с использованием β- глюкуронидазы, гидролизованную мочу смешивают с эфиром в соотношении 1:10 - 1:30, осуществляют экстракцию в течение 30-120 секунд. После удаления водной фракции высушивают эфирный остаток, который в последующем разбавляют фосфатным буфером pH 7,2-7,4 и полученную пробу инкубируют от 1 до 4 часов при комнатной температуре со специфическими антителами и раствором меченного 1 125 кортизола. Добавлением преципитирующего реагента, содержащего вторые антитела к кортизолу, и центрифугированием в течение 10-30 минут при ускорении 1,5-2 тыс. g при температуре 18-25^oC осуществляют разделение на свободный и связанный с антителами кортизол. По калибровочному графику определяют количество конъюгированной фракции кортизола. Расчет проводится с учетом разведения, времени и количества экскретируемой мочи и концентрации кортизола, определяемого из нативной мочи с помощью вышеназванной реакции антиген-антитело.

Для реализации предложенного способа нами были выбраны следующие оптимальные параметрические значения:
Из суточного количества мочи берется 0,5-1 мл и кипятится в течение 1 минуты для удаления ингибитора β- глюкуронидазы в пробе.

К моче добавляют равное количество раствора β- глюкуронидазы в ацетатном буфере pH 4,5 из расчета 500 ед. активности мл, тщательно перемешивают и ставят в термостат при 37^oC на 18-20 часов.

Пробы после гидролиза центрифугируют, из супернатанта отбирают 50 мкл гидролизата и осуществляют экстракцию эфиром в соотношении 1:10-1:30. При добавлении эфира в соотношении менее 1:10 нельзя быть уверенным в полной экстракции кортизола, а при добавлении эфира в соотношении более 1:30 неадекватно увеличивается объем реакционной смеси.

Экстракцию осуществляют в течение 30-120 секунд на вортекс-экстракторе. При экстрагировании менее 30 сек не достигается максимум экстракции кортизола, а при удлинении времени экстракции свыше 120 секунд невозможно избежать потерь некоторого количества эфира, что приводит к изменению объема реакционной смеси.

Для вымораживания водной фазы пробы помещают в жидкий азот (можно использовать любой способ, позволяющий быстро заморозить водную фазу). Эфирный экстракт переносят в чистые пробирки и выпаривают при температуре не выше 60^oC во избежание температурного разрушения кортизола.

К сухому остатку добавляют 50 мкл фосфатного буфера pH 7,2-7,4 (оптимальный pH для достижения равновесия в реакции антиген-антитело), тщательно перемешивают и прогревают пробы в водяной бане в течение 5 минут при температуре не выше 60^oC. В пробу добавляют раствор антигена - меченый 1 125 кортизол (удельная активность - 100 мккюри мг) в количестве 100 мкл.

Затем добавляют раствор специфических антител в количестве 100 мкл (процент связывания антител с антигеном не менее 80%, максимум 100%).

Пробы тщательно перемешивают и инкубируют при температуре 18-25^oC в течение 1-4 часов. При инкубировании менее 1 часа не достигается равновесие реакции антиген-антитело, а при увеличении более 4 часов необходимо подбирать более низкий температурный режим во избежание сдвига равновесия в реакции антиген-антитело. При проведении инкубации при температуре менее 18^oC нецелесообразно удлиняется время проведения реакции, а при температуре более 25^oC может нарушиться процесс установления равновесия антиген-антитело.

Для отделения свободного антигена от связанного с антителами кортизола добавляют 800 мкл преципитирующего реагента, содержащего вторые антитела и после быстрого и тщательного перемешивания центрифугируют в течение 10-30 минут при ускорении 1,5-2 тыс. g при комнатной температуре. При меньшем времени центрифугирования (менее 10 минут) можно получить недостаточное разделение свободной и связанной с антигеном фракций, а при более длительном центрифугировании (более 30 минут) может нарушиться связь между антигеном и меткой. Ускорение при центрифугировании менее 1,5 тыс g приведет к неполному разделению свободного антигена и связанного комплекса, а увеличение ускорения свыше 3 тыс g приведет к осаждению более мелких молекул, чем комплекс антиген-антитело.

В осадке измеряют уровень гамма-излучения. Параллельно проводят реакцию антиген-антитело со стандартными растворами кортизола, концентрации стандартов от 43 нмоль/л до 2760 нмоль/л.

В ходе разработки и налаживания метода определения свободной и конъюгированной фракций кортизола в моче с помощью 1 125 проводилась оценка воспроизводимости результатов определения фракций кортизола в контрольных образцах мочи при различных условиях проведения методики, но в пределах, указанных выше. Полученные результаты подтвердили правильность выбранных оптимальных параметрических значений.

Новым в предлагаемом способе является переход определения концентрации суммарных кортикостероидов с химического метода на высокоспецифичный радиоиммунологический метод определения кортизола в моче, что позволяет в конечном итоге оценить количественно экскрецию с мочой свободной и конъюгированной фракций кортизола. Высокая чувствительность предлагаемого способа позволяет установить более точные показатели экскреции с мочой кортизола по сравнению с классическим методом Сильбера-Портера.

Существо изобретения поясняется следующими примерами:
Пример 1. Больной К.В.А., 1953 г.р., история болезни N 2093, находится в отделении терапевтической эндокринологии с 11.02.1994 по 25.03.1994.

Диагноз: хроническая надпочечниковая недостаточность медикаментозно субкомпенсированная с периодическими надпочечниковыми кризами (двухсторонняя адреналэктомия в 1980 и 1982 годах, лучевая терапия на межуточно-гипофизарную область в 1976, 1977 и 1987 гг по поводу болезни Иценко-Кушинга).

19.01.94 б-ной обследовался в предкризовом состоянии амбулаторно. Суточная экскреция мочи составила 2 л, содержание суммарных 17-ОКС-6 (при норме 8 - 24) мкмоль/л сутки, кортизола крови - 198 (при норме 190-750) нмоль/л. 14.02.94 б-ной обследовался в период острой надпочечниковой недостаточности, но после назначения глюкокортикоидов. В этот период диурез составил 1,7 л мочи в сутки, экскреция 17-ОКС - 10 мкмоль/л сут, содержание кортизола крови - 52 нмоль/л, содержание АКТГ в плазме крови - 52,8 (при норме 2,2 - 13,2) пмоль/л, что подтверждает диагноз надпочечниковой недостаточности.

В эти же сроки проводилось определение содержания в моче свободной и конъюгированной фракции кортизола.

Для определения суммарной фракции кортизола из суточного количества мочи отобрали 500 мкл, пробирки с мочой поместили в кипящую водяную баню на 1 минуту, охладили, добавили 500 мкл раствора β- -глюкуронидазы в ацетатном буфере и ставили на гидролиз в термостат при 37^oC на 18 часов. Затем в стеклянные пробирки вносили 50 мкл мочи, к которым добавляли 500 мкл эфира и осуществляли экстракцию кортизола на вортекс-экстракторе (смешиватель вибрационный СВ-3, Россия) в течение 60 секунд. Затем пробы помещали в жидкий азот до замерзания водной фазы, эфирную фазу переносили в сухие стеклянные пробирки и выпаривали в защищенном от прямых солнечных лучей вытяжном шкафу досуха. Затем добавляли 50 мкл фосфатного буфера pH 7,4, тщательно перемешивали и прогревали на водной бане при температуре 60^oC. После охлаждения до комнатной температуры добавляли 100 мкл меченного I 125 кортизола и 100 мкл раствора антисыворотки (оба компонента берутся из тест-системы для определения кортизола в сыворотке крови человека СТЕРОН-К-I125-М Опытного производства ИБОХ АН Республики Белорусь, оба компонента разделяются фосфатным буфером в соотношении 1:2 по сравнению с исходным разведением в вышеназванной тест-системе). Пробы тщательно перемешивали на вортекс-миксере (фирма LKB, Швеция) и инкубировали в течение 2 часов при температуре 18 - 25^oC. После этого добавляли преципитирующий реагент в количестве 1 мл (преципитирующий реагент из тест-системы СТЕРОН-К-I125-М), тщательно перемешивали на миксере до получения однородной смеси и центрифугировали при 2.0 тыс. g в течение 15 минут при комнатной температуре. После центрифугирования удаляли надосадочную жидкость, а пробирки с осадком помещали в гамма-счетчик для подсчета радиоактивности в течение 1 минуты (гамма-800, ВНИИМП, производство Россия). Для количественной оценки содержания конъюгированных фракций кортизола в моче определяли тотальную активность 100 мкл меченного I 125 кортизола. Параллельно проводили построение калибровочного графика со стандартными спиртовыми растворами кортизола в концентрациях 0; 42,9; 85,8; 171,8; 343,8; 687,5; 1375; 2750 нмоль/л, (0; 15,6; 31,2; 62,5; 125; 250; 500; 1000 нг/мл). В пробирки со стандартами добавляли 100 мкл меченого кортизола, 100 мкл раствора антисыворотки и проводили остальные этапы аналогично вышеописанному определению содержания суммарного кортизола в моче. На основании показателей радиоактивности в стандартных пробах строили калибровочный график относительно концентрации нулевого стандарта (Bo). (см. рис. 1) На основании данного определения содержание суммарного кортизола в моче в пробе от 19.01.94 составило 11 нг/мл, от 14.02.94 - 23 нг/мл. Для определения конъюгированной фракции кортизола в моче параллельно определяли содержание свободной фракции кортизола в моче. Для этого из суточного количества мочи берется 50 мкл, экстрагируется эфиром, эфирная фракция помещается в сухую пробирку и дальнейшие этапы соответствуют вышеописанным. После подсчета радиоактивности по калибровочному графику определяли содержание свободного кортизола в данных пробах. В пробе от 19.01.94 содержание кортизола соответствовало 8 нг/мл, а в пробе от 14.02.94 - 12 нг/мл. С учетом разведения и суточного диуреза вычисляли суточную экскрецию суммарного и свободного кортизола нмол/л сутки:
суммарный кортизол - свободный кортизол
19.01.94
11(нг/мл)•2 (разведение) • 2(л, диурез)• 2.75 (пересчет в молярность)= 121 нмоль/л сут - 8(нг/мл)• 2 (л, диурез)•2.75 (пересчет в молярность)= 44 нмоль/л сут
14.02.94
23•2•1.7•2.75 = 215 нмоль/л сут - 12•1.7•2.75= 56 нмоль/л сут.

Далее из показателя суточной экскреции суммарного кортизола вычитали показатель суточной экскреции свободного кортизола и получили показатель содержания конъюгированной фракции кортизола в моче. От 19.01.94 он составил 121-44=77 нмоль/л сут, а от 14.02.94.215-56 159 нмоль/л сут.

Пример 2. Обследуемая Д.Ю.А., 1970 г.р., клинический диагноз: практически здорова. Определение суточной экскреции суммарной, свободной и конъюгированной фракций кортизола в моче проводилось по вышеописанной методике в аналогичных условиях.

Результаты определения, 4.10.93:
Диурез - Фракции кортизола, (нмоль/л сут)
1 л - суммарная 364 - свободная 157 - конъюгированная 207
Пример 3. Больная С.Н.В., 1956 г.р., история болезни N 11827, находилась в отделении хирургической эндокринологии с 7.09.93 по 19.10.93. В анамнезе перенесен гепатит.

Диагноз при поступлении: Болезнь Иценко-Кушинга, кортикостерома левого надпочечника.

7.10.93 левосторонняя адреналэктомия, удалена смешаноклеточная аденома коры надпочечника.

Определение суточной экскреции суммарной, свободной и конъюгированной фракций кортизола в моче проводилось по вышеописанной методике в аналогичных условиях.

Обследование до операции:13.09.93 17-ОКС - 25 мкмоль/л сут (норма от 8 до 24) 8.09.93 кортизол крови 1308 нмоль/л (норма от 190 до 750)
Фракции кортизола (нмоль/л сут):
13.09.93 свободная 265, конъюгированная 679, суммарная 944
Обследование после операции:
4.10.93. кортизол крови 897 нмоль/л
18.10.93 кортизол крови 591 нмоль/л
16.03.1994 обследована после операции, амбулаторно, подтвержден рецидив заболевания.

17-ОКС-22 мкмоль/л•сут, кортизол крови 315 нмоль/л,
Фракции кортизола (нмоль/л сут): свободная 348, конъюгированная 2020, суммарная 2368
Предложенный способ определения конъюгированной фракции кортизола в моче обладает рядом преимуществ по сравнению с химическим методом Сильбера-Портера, он позволяет:
1. повысить специфичность метода определения кортизола в моче;
2. повысить чувствительность указанного метода,
3. устранить дополнительные трудоемкие методы очистки и выделения кортикостероидов из мочи;
4. избежать использования в больших количествах высокотоксичных органических растворителей;
5. повысить не менее, чем в три раза производительность труда по сравнению с методом Сильбера-Портера.

В настоящее время происходит накопление клинического материала. С использованием разработанной методики проводится определение различных заболеваний надпочечников, находящихся в отделении хирургической эндокринологии, и соответствующих амбулаторных больных Проводится сравнительный анализ свободной и конъюгированной фракций кортизола в моче, полученных вышеописанным способом, с суммарными 17-оксикетостероидами и с кортизолом сыворотки, полученным радиоиммунным способом. Полученные данные приведены в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить свободную, связанную и суммарную экскрецию кортизола, и может быть использован для дифференциальной диагностики заболеваний надпочечников, а также при назначении глюкокортикоидов с лечебной целью.

Построение калиброванного графика дано на рис. 1.

Наименование проб СРМ B/B₀x100%
T Тотальная активность 16093
B₀ Стандарт 0 нг/мл 13936
B₁ Стандарт 15,6 нг/мл 9923 71%
B₂ 31,2 нг/мл 8483 61%
B₃ Стандарт 62,5 нг/мл 7302 52%
B₄ Стандарт 125 нг/мл 5574 40%
B₅ Стандарт 250 нг/мл 4000 29%
B₆ Стандарт 500 нг/мл 2838 20%
B₇ Стандарт 1000 нг/мл 1827 13%
Рассчитываем максимальную связывающую активность антител: B₀T • 100% = 13936/16093 • 100% = 86,6%.

Строим калибровочный график зависимости B/B₀•100% от концентрации стандартных растворов кортизола в этих пробах (нг/мл).

Из суточного количества нативной мочи отбирают 0,5-1 мл. Кипятят пробу в течение 1 мин. Охлаждают и добавляют к пробе равное количество раствора β-глюкуронидазы в ацетатном буфере с рН 4,5 из расчета 500 МЕ активности фермента на мл мочи. Проводят гидролиз полученной смеси при температуре 37^oC в течение 18-20 ч. Отливают супернатант гидролизата и смешивают его и параллельно пробы нативной мочи с эфиром в соотношении 1:10-1:30. Экстрагируют смесь в течение 30-120 с. Затем после удаления водной фракции и эфира сухой остаток разбавляют фосфатным буфером с рН 7,2-7,4 с доведением объема до первоначального. Нагревают в течение 5 мин при температуре не выше 60^oC. Охлаждают и добавляют раствор меченого I 125 кортизола и раствор специфических к кортизолу антител. После чего полученную пробу инкубируют при темперутаре 18-25^oC в течение 1-4 ч. Добавляют преципитирующий реагент, содержащий вторые антитела к кортизолу. Центрифугируют в течение 10-30 мин при ускорении 1500-2000 g и температуре 18-25^oC с последующим удалением супернатанта. В полученном осадке измеряют уровень γ-излучения. Подсчитывают радиоактивность по калибровочному графику. С учетом разведения и суточного диуреза в пробе гидролизованной мочи вычисляют показатель суточной экскреции суммарного кортизола. В пробе нативной мочи вычисляют показатель суточной экскреции свободного кортизола. Показатель содержания конъюгированной фракции кортизола получают вычитанием из показателя суточной экскреции суммарного кортизола показателя суточной экскреции свободного кортизола. Предлагаемый способ позволяет определить свободную, конъюгированную и суммарную экскрецию кортизола, может быть использован для дифференциальной диагностики заболеваний надпочечников, при назначении глюкокортикоидов с лечебной целью. Способ прост, специфичен. 1 ил., 1 табл.

Способ определения конъюгирования фракции кортизола в моче с использованием ферментативного гидролиза β - глюкуронидазой, отличающийся тем, что из суточного количества нативной мочи отбирают 0,5 - 1 мл, кипятят в течение 1 мин, охлаждают и добавляют к пробе равное количество раствора β -глюкуронидазы в ацетатном буфере с рН 4,5 из расчета 500 МЕ активности фермента на мл мочи, проводят гидролиз при температуре 37^oC в течение 18 - 20 часов, отливают супернатант гидролизата и смешивают его и параллельно пробы нативной мочи с эфиром в соотношении 1 : 10 - 1 : 30, экстрагируют смесь в течение 30 - 120 секунд, затем после удаления водной фракции и эфира сухой остаток разбавляют фосфатным буфером с рН 7,2 - 7,4 с доведением объема до первоначального, нагреват в течение 5 мин при температуре не выше 60^oC, охлаждают и добавляют раствор меченного 1 125 кортизола и раствор специфических к кортизолу антител, после чего полученную пробу инкубируют при температуре 18 - 25^oC в течение 1 - 4 часов, добавляют преципитирующий реагент, содержащий вторые антитела к кортизолу, и центрифугируют в течение 10 - 30 минут при ускорении 1500 - 2000 g и температуре 18 - 25^oC с последующим удалением супернатанта, и в полученном осадке измеряют уровень γ -излучения, после чего подсчитывают радиоактивность по калибровочному графику, с учетом разведения и суточного диуреза в пробе гидролизованной мочи вычисляют показатель суточной экскреции суммарного кортизола, в пробе нативной мочи - показатель суточной экскреции свободного кортизола, при этом показатель содержания конъюгированной фракции кортизола получают вычитанием из показателя суточной экскреции суммарного кортизола показателя суточной экскреции свободного котизола.