ШТАММ SERRATIA PROTEAMACULANS 94 - ПРОДУЦЕНТ КОЛЛАГЕНАЗЫ Российский патент 2001 года по МПК C12N9/48 C12N9/52 C12N1/20 C12N9/52 C12R1/425 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм Serratia proteamaculans 94, продуцирующий коллагеназу, которая может быть использована в мясной промышленности для гидролиза и модифицирования коллагенсодержащего сырья с целью улучшения качества мясопродуктов (их умягчения), расширения их ассортимента, а также в медицинской, пищевой и легкой промышленности.

Для улучшения качества низкосортных мясопродуктов с высоким содержанием соединительной ткани необходимы ферменты (коллагеназы), оптимум действия которых находится в пределах низких плюсовых температур, соответствующих условиям посола сырья, т.е. 2±2^oC.

Известные микроорганизмы, продуцирующие коллагеназы, являются мезофилами с оптимумом действия фермента в пределах 20-40^oC (Achromobacter iophagus [1] ). Кроме того, некоторые из них являются спорообразующими (Вас. subtilis [2, 3] ), либо патогенными (Clostridium perfringens, Entomophthora coronata [4, 5]).

Среди коллагеназ известен препарат, выделенный из гепатопанкреаса камчатского краба. Однако температурный оптимум действия его находится в пределах 60-65^oC [6, 7]. Таким образом, известные ферменты, обладающие коллагеназной активностью, имеют температурный оптимум действия в пределах 20-65^oC.

Целью изобретения является селекция штамма, способного продуцировать коллагеназу при низких плюсовых температурах (4- 6^oC).

Предлагаемый штамм Serratia proteamaculans 94 продуцирует коллагеназу при температуре 4^oC, т.е. фермент работает в условиях посола мясного сырья.

Штамм выделен и идентифицирован в лаборатории гигиены производства и микробиологии ВНИИМПа из соленой говядины, подвергнутой длительному хранению при низких положительных температурах.

Штамм хранится в коллекции культур микроорганизмов ВНИИМПа под N 94.

Штамм Serratia proteamaculans 94 имеет следующие морфологические и физиологические характеристики.

Морфологически штамм представлен грамотрицательными палочками размером 0,8-0,9 х 1,0-1,5 мкм. Спор не образует. Штамм является факультативным анаэробом с дыхательным и ферментативным типом метаболизма. Катаболизирует глюкозу с образованием кислоты и газа. Не нуждается в факторах роста. Не продуцирует флюоресцирующий пигмент. Оксидазный тест отрицательный. Реакция Фогес-Проскауэра положительная. Обладает нитратредуцирующей способностью. Не образует индол и сероводород. Не разрушает уреазу. Обладает ферментом желатиназой (гидролизует желатин). Аргининдегидролаза, триптофандеаминаза отсутствуют. Обладает лизин и орнитиндекарбоксилазой. Утилизирует цитрат. Образует кислоту из мелибиозы, рабинозы, сахарозы, мальтозы, ксилозы, маннита. Не образует кислоты из инозита, сорбита, рамнозы, амигдалина, целлобиозы, дульцита, лактозы.

При посеве на L-агаре образует росинчатые колонии диаметром 1 мм, прозрачно-белого цвета с ровными краями.

При росте в L-бульоне образует на поверхности пленку, рост по всему столбику бульона.

Оптимальная температура роста 4^oC, оптимальный pH 7,4.

Суспензия клеток и культуральная жидкость, введенная подопытным животным внутрибрюшинно, не вызывает токсических явлений.

Штамм хранят в виде лиофильно высушенной культуры или в агаризованной среде под вазелиновым маслом.

Штамм обладает способностью продуцировать коллагеназу в условиях психрофилии.

Коллагеназу в культуральной жидкости определяют нингидриновым методом. В качестве субстрата для определения коллагеназной активности используют нативный коллаген из ахиловых сухожилий (Sigma). pH оптимум действия коллагеназы 6,0, оптимальная температура 4^oC.

Пример 1. Для выращивания посевного материала и процесса ферментации штамма Serratia proteamaculans 94 используют среду на основе триптона следующего состава, г/л:
Триптон - 10
Дрожжевой экстракт - 5
NaCl - 5
Для получения посевного материала используют пробирки со скошенным L-агаром, засеянные культурой. Далее 1 петлю суточной агаровой культуры пересевают в пробирки с жидкой средой на основе триптона. Суточной культурой засевают колбы Эрленмейера со 100 мл среды того же состава. Емкость колб 250 мл. Выращивание проводят на качалке (180-200 об/мин) в течение 72 час при температуре 4^oC.

Через указанное время активность коллагеназы в культуральной жидкости составляет 0,2 мM/мг•ч.

Источники информации
1. Бонне М., Дж. Копп "Деградация коллагена мышечной ткани крупного рогатого скота коллагеназой, создаваемой микроорганизмом Achromobacter iophagus". Proceedings Evropean meeting of meat research workers. 1984. Bristol, Great Britain.

2. Слабоспицкая А.Т., Крымовская С.С., Резник С.Р. Коллагенолитическая активность бактерий рода Bacillus, выделенных из различных экологических источников. Микробиологический журнал. 1989. N 6. С. 54-56.

3. Кулаев И.С., Соловьева Н.И., Калебина Т.С., Нурминская М.В. Обнаружение и характеристика коллагенолитической активности сериновых протеиназ субтилизинового типа // ДАН. 1988. Т. 303. N 2. С. 499-502.

4. Hurion N. , Tromentin H., Keil S. Specificity of the collagenolytic enzyme from the fungus entomophtkora coronata: comparison with the bacterial collagenase from Achromobacter iophagus // Arch. Biochem. Biophys. 1979. V. 193. N 2. P. 438-445.

5. Matsushita O., Yoshihara К., Natayama S.J. et. al. Purification and characterization of a Clostridium histolyticum 120 Kilodalton collagenase and nucleotidesequence of the correspondinding gene // J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 149-156.

6. Сахаров И.Ю., Литвин Ф.Е., Артюков А.А. Кофанова Н.Н. Очистка и характеристика коллагенолитической протеазы из гепатопанкраеса Paralithodes camtschatica // Биохимия. 1988. Т. 53. Вып. 11. С. 1844-1850.

7. Федонин М.Ю. "Разработка технологии формованных продуктов из говядины с использованием ферментного препарата" Диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук. Москва. - 2000 г. С. 159.

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в мясной промышленности для гидролиза и модифицирования коллагенсодержащего сырья. Штамм Serratia proteamaculans 94 хранится в коллекции культур. Продуцирует коллагеназу при температуре 4°С, т.е. фермент работает в условиях посола мясного сырья. Штамм позволяет улучшить качество мясопродуктов, расширить их ассортимент.

Штамм Serratia proteamaculans 94 - продуцент коллагеназы.