ШТАММ CLOSTRIDIUM HISTOLYTICUM - ПРОДУЦЕНТ КОЛЛАГЕНАЗЫ Российский патент 2019 года по МПК C12N9/52 C12N1/20 C12R1/145 

Область техники.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к получению штамма Clostridium histolyticum SK В-8362, способного продуцировать коллагеназу, используемую для дальнейшего промышленного производства ферментных препаратов.

Уровень техники.

На протяжении многих лет протеолитический фермент коллагеназа привлекает внимание ученых всего мира своей способностью гидролизовать тройную спираль молекулы нерастворимого природного белка коллагена. Коллагеназа используется в косметологии и медицине для профилактики и лечения рубцовых образований, в том числе контрактуры Дюпюитрена (заболевание кисти, связанное с рубцовым перерождением и укорачиванием ладонных сухожилий), а также в диагностических и лабораторных целях, например, для дезинтеграции тканей in vitro.

Известен способ получения коллагеназы из морского животного сырья, а именно гепатопанкреаса промысловых видов крабов (патент RU 2280076 С1, 20.07.2006, Артюков А.А., Мензорова Н.И., Козловская Э.П., Кофанова Н.Н., Козловский А.С, Рассказов В.А. «Ферментный препарат из гепатопанкреаса промысловых видов крабов и способ его получения»). Недостатками такого способа получения коллагеназы является неспособность полученных ферментов расщеплять нативный коллаген, что сужает сферу их применения. Кроме того, использование такого сырья усложняет получение высокоочищенных коллагеназ.

Известно, что истинные коллагеназы, то есть ферменты, способные расщеплять нативный коллаген, синтезируют микроорганизмы (грибы, бактерии). От продуктивности штамма, затрат на его культивирование, скорости его роста и накопления целевого продукта, а также себестоимости питательных сред зависит эффективность промышленного производства любых продуктов микробного синтеза.

Известен лабораторный штамм Aeromonas salmonicida AS1, для которого была доказана достаточно высокая экспрессия гена, отвечающего за синтез коллагеназы (Махова А.А., Курбаков К.А., Минаев М.Ю. Изучение коллагенолитической активности перспективного штамма Aeromonas salmonieida методом измерения экспрессии генов для оценки возможности использования его в качестве продуцента коллагеназ // Все о мясе. - 2017. - Т. 5. - С. 42-47).

В патенте (ЕР 0468411 А2, 29.01.1992 «А mutant of bacterium Clostridium histolyticum, a process for the obtaining thereof, and its use in the production of clostripain-free collagenase») описан мутантный штамм Clostridium histolyticum K26 clo 88, полученный путем обработки исходного дикого штамма мутагенным агентом, и способный к синтезу коллагеназы на среде с протеозопептоном, соевым пептоном, неорганическими солями, витаминами. Недостатком использования мутантного штамма в производственном процессе является его нестабильность.

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является штамм Clostridium histolyticum 468, синтезирующий коллагеназу при культивировании на среде, содержащей гидролизат казеина и соевого шрота, неорганические соли, витамины (RU 2180002 С2, 27.02.2002 «Способ получения коллагеназы»). Данный штамм растет на сложной питательной среде, компоненты которой требуют предварительной подготовки, что является недостатком. Кроме того, время культивирования штамма достаточно продолжительное (72±1 ч). Штамм 468 при культивировании на бульоне Рамона с кровяным порошком синтезирует коллагеназу с не достаточно высокой активностью - 800-1000 КЕ/мл в реакции с окрашенным коллагеном.

Раскрытие сущности изобретения

Чтобы устранить указанные недостатки, мы предлагаем штамм Clostridium histolyticum SK, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека под номером В-8362 10 от 26 января 2018 года как продуцент коллагеназы. Справка о депонировании №10 от 26 января 2018 года.

Техническими результатами, достигаемыми при осуществлении изобретения, являются:

- в отличии от аналогов предлагаемый штамм Clostridium histolyticum SK В-8362 (синоним: Hathewaya histolytica SK (Lawson and Rainey 2016), в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека) синтезирует коллагеназу с более высокой активностью (1500-2000 КЕ/мл в реакции с окрашенным коллагеном),

- предлагаемый штамм достигает максимальных показателей синтеза и роста за более короткий промежуток времени (44 ч), является диким штаммом с неизменными свойствами и адаптирован под лабораторные и промышленные питательные среды.

Первичная идентификация культуры Clostridium histolyticum SK В-8362 была проведена по фенотипическим признакам на базе ФГУП «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России.

Вторичная идентификация была проведена по фенотипическим и генотипическим признакам на базе Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Изучение биохимических свойств проводили с использованием тест-системы АНАЭРОтест 23, исследование генетических - с помощью масс-спектрометра MALDI-Biotyper (Bruker, Германия), выделения ДНК, приготовления библиотеки фрагментированной ДНК, секвенирования на системе Illumina MiSeq, биоинформационного анализа (сборка de Novo с использованием программного обеспечения SPAdes и Newbler).

Морфологические признаки Clostridium histolyticum SK В-8362.

Культура представлена подвижными грамположительными палочками, расположенными изолированно, попарно или небольшими цепочками размером 0,5-0,7×3,0-5,0 мкм. Клетки подвижны, имеют перетрихиально расположенные жгутики. Образует овоидные центральные и субтермальные споры, в аэробных условиях спор не образует. По отношению к кислороду микроорганизм - аэротолерантный.

Культуральные особенности Clostridium histolyticum SK В-8362.

На твердой питательной среде кровяной агар с добавлением 5% стерильной дефибринированной крови барана образует округлые мелкие (0,5-1,0 мм) гладкие выпуклые полупрозрачные колонии серо-белого цвета с волнообразным краем. Гемолитическая активность слабовыраженная. При культивировании данного штамма на жидких питательных средах (полужидкая среда Рамона с мясным фаршем, бульон Рамона с кровяным порошком) культура растет в виде комочков ваты или образует ветвистые колонии, при этом наблюдается рыхлый осадок на дне или в толще питательной среды. Цвет среды - от желтого до темно-коричневого с помутнением.

Биохимические свойства Clostridium histolyticum SK В-8362.

Штамм оксидазо- и каталазоотрицательный, лецитиназная и липазная активность отрицательные, индол не образует, однако наблюдается образование газа, гидролизирует желатин.

Ферментативные свойства Clostridium histolyticum SK В-8362. Штамм синтезирует фермент коллагеназу.

Генетические характеристики Clostridium histolyticum SK В-8362. При исследовании культуры Clostridium histolyticum SK В-8362 с помощью масс-спектрометра MALDI-Biotyper (Bruker, Германия) исследуемая культура была идентифицирована как Clostridium histolyticum с высокой степенью достоверности. Так, согласно проведенным исследованиям, наиболее высокий показатель подобия (Score Value) - 2,422 был зарегистрирован между изучаемой культурой и культурой Clostridium histolyticum DSM 1126. Высокие показатели подобия были зарегистрированы также между изучаемой культурой и культурами Clostridium histolyticum DSM 2158Т и Clostridium histolyticum 1036_NCTC 503T.

Полногеномное секвенирование и биоинформационный анализ подтвердили, что гомология участка гена 16S рРНК штамма с геном 16S рРНК референсного штамма Clostridium histolyticum (Hathewaya histolytica) JCM 1403 (NR_113187.1) составляет 100%.

Картирование контигов исследуемого штамма Clostridium histolyticum на нуклеотидную последовательность кластера генов Clostridium histolyticum (Hathewaya histolytica) JCM 1403 (ABO 14075.1) подтвердило 99% гомологию, что позволило заключить, что у изучаемого микроорганизма присутствует ген коллагеназы Clostridium histolyticum.

Штамм Clostridium histolyticum SK В-8362 хранят в условиях криозаморозки при температуре - (80±3)°С в бульоне Рамона в смеси с 80% глицерином (соотношение 1:4); в лиофильно высушенном состоянии (высушивание в присутствии сахарозо-желатиновой защитной среды) при температуре (5±3)°С; при низкой температуре (5±3)°С в среде мясо-пептонный агар 0,7%. Срок хранения не зависимо от выбранных условий - 10 лет.

Осуществление изобретения.

Подробно этап культивирования штамма Clostridium histolyticum SK В-8362 с целью получения коллагеназы описан в примере 1.

Пример 1. Синтез коллагеназы штаммом Clostridium histolyticum SK В-8362 в жидкой питательной среде.

Посевной материал получали в пробирках на среде Рамона с фаршем (объем питательной среды по 20 мл, производитель ФГУП СПбНИИВС ФМБА России). Для пересева использовали восстановленную культуру Clostridium histolyticum SK В-8362.

Стерильной одноразовой серологической пипеткой отбирали по 10 мл культуры и асептически вносили в питательную среду в пробирках. Получили 8 засеянных пробирок. Пробирки отправили на инкубацию в термостат при температуре 37°С на 24 ч. После подтверждения отсутствия контаминации (окраска по Граму и микроскопия) готовили 16 л питательной среды, содержащей среду Рамона с кровяным порошком (производитель ФГУП СПбНИИВС ФМБА России), разливали по 4 л в 4 бутыли вместимостью 5 л. Затем стерильной одноразовой серологической пипеткой вносили по 80 мл 50% раствора глюкозы. Бутыли перемешивали вручную круговыми движениями. Затем проводили засев бутылей посевным материалом из пробирок объемом 20,0 мл, полученным на предыдущем этапе. Для этого стерильной одноразовой серологической пипеткой отбирали весь посевной материал из одной пробирки и вносили в одну бутыль с питательной средой. Аналогично проводили засев оставшихся бутылей. Бутыли поместили в термостат при температуре 37°С для культивирования на протяжении 44 ч.

Визуально оценивали рост культуры на 24 и 44 ч. Культура росла интенсивно, культуральные свойства характерны для Clostridium histolyticum SK В-8362.

По завершению процесса культивирования отбирали пробы для проведения окраски по Граму и микроскопии, а также определения коллагеназной активности.

Выявлены характерные по морфологии клетки Clostridium histolyticum SK В-8362, образующие споры.

Пример 2. Определение активности коллагеназы, синтезируемой штаммом Clostridium histolyticum SK В-8362.

Определение коллагеназной активности проводили в соответствии с ГФ XIII ОФС.1.2.4.0013.15 «Определение активности ферментных препаратов».

За единицу коллагеназной активности (ЕД) принимается количество (микро или нано) моль красителя, выделившегося в реакционную среду в результате ферментативного расщепления 1 мг коллагена, окрашенного красителем R016 (или ЖТ), при 37°С в течение 1 мин. Метод основан на способности коллагеназы лизировать окрашенный коллаген.

В полученных образцах по примеру 1 коллагеназная активность составила 1500-2000 КЕ/мл. У ближайшего аналога штамма Clostridium histolyticum 468 коллагеназная активность культуральной жидкости после выращивания продуцента на бульоне Рамона с кровяным порошком составила 800-1000 КЕ/мл.

Таким образом, полученный нами штамм Clostridium histolyticum SK В-8362 позволяет за сравнительно небольшой промежуток времени получить коллагеназу с высокой активностью, используя при этом стандартизированные промышленные и лабораторные питательные среды.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Штамм Clostridium histolyticum SK, обладающий способностью синтезировать коллагеназу, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека под регистрационным номером В-8362 и может быть использован в промышленном производстве ферментных препаратов. Изобретение позволяет повысить выход коллагеназы. 2 пр.

Штамм Clostridium histolyticum, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека под номером В-8362, - продуцент коллагеназы.