СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2001 года по МПК C12N15/24 C12N1/21 C07K14/54 C07K1/36 C12P21/02 C12N1/21 C12R1/19 

Настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантного интерлейкина-8 человека, полученного различными путями.

Способы очистки рекомбинантного интерлейкина-8 человека уже известны. Различные исследовательские группы разработали разные способы очистки. Очистка существенно различается по выбранным хроматографическим стадиям, были описаны следующие методы: Mono S с последующей HPLC (жидкостная хроматография высокого разрешения) с обращенной фазой (Lindley, I.; Aschauer, Н.; Seifert, J. -M.; Lam, С.; Brunowski, W.; Kownatzki, E.; Thelen, M.; Peveri, P. ; Dewald, B.; von Tscharner, V.; Waltz, A.; Baggiolini, M. (1988): Синтез и экспрессия в E. coli гена, кодирующего нейтрофил-активирующий фактор моноцитов: Биологическая равноценность природного и рекомбинантного нейтрофил-активирующего фактора. Proceedings of the National Academy of Science, USA, 85), хроматография на гепарин-Сефарозе незадерживаемой на DEAE Сефацеле фракции с последующей хроматографией на колонке Сефакрила S-200 и колонке CM-3SW (Matsushima, К.; Oppenheimer, J.J. (1988): Интерлейкин и MCAF: новые цитокины, связанные с воспалением, индуцируемые IL-1 и TNF. Цитокин 1), хроматография на СМ-Сефарозе CL-6B с последующей хроматографией на Тойоперле HW-55 (Furuta, R.; Yamagishi, J.; Kotani, H.; Sakamoto, F.; Fukui, Т.; Matsui, Y.; Sohmura, Y.; Yamada, M.; Yoshimura, T.; Larsen, C.G.; Oppenheim, J. J. ; Matsushima, К. (1989): Продукция и характеристика рекомбинантного человеческого фактора хемотаксиса нейтрофилов. Journal of Biochemistry, Vol. 106, N 3) и адсорбция с помощью бетч-процедуры (при встряхивании) с кремневой кислотой и последующей хроматографии на гепарин-Сефарозе CL-6B и Ультрогеле АсА 54 (Van Damme, J.; Van Beeumen, J.; Conings, R.; Decock, B.; Billau, A. (1989): Очистка пептида хемотаксиса гранулоцитов/интерлейкина-8 выявляет гетерогенность N-концевой последовательности, сходную с таковой β-тромбоглобулина, European Journal of Biochemistry 181). Последующая обработка для производства интерлейкина-8 в соответствии с условиями GMP в коммерческом масштабе неизвестна.

Недостатками известных способов являются низкий выход и недостаточная чистота интерлейкина-8 при сопутствующих высоких материальных затратах. Дополнительным недостатком известных способов является их применение только для исследовательских целей, то есть невозможность их трансформировать в производственные методы, удовлетворяющие требованиям GMP.

В настоящее время создан способ очистки рекомбинантного интерлейкина-8, в котором преодолены недостатки известных способов.

Способ очистки интерлейкина-8 настоящего изобретения отличается тем, что
а) сначала клетки лизируют в забуференном растворе и
b) полученный лизат обрабатывают посредством исключения компонентов с иной молекулярной массой с помощью повторяющейся ультрафильтрации с перекрестным током, таким образом, что
i) на первом этапе фильтрации интерлейкин-8 отделяют от более крупных сопутствующих компонентов и
ii) на втором этапе фильтрации его отделяют от более мелких компонентов,
с) забуференный фильтрат, полученный на стадии b) способа, подвергают высокоэффективной очистке с помощью катионообменной хроматографии, при которой поверхность молекулы интерлейкина-8 с высоким положительным зарядом используют в такой форме, что величину pH нанесения и элюции выбирают достаточно высокой, чтобы интерлейкин-8 оставался все еще связанным, и затем
d) забуференный раствор элюата интерлейкина-8 со стадии с) способа заменяют с помощью гель-фильтрации, диализа или ультрафильтрации и наконец
e) раствор интерлейкина-8, полученный на стадии d) способа, лиофилизируют.

Лизис клеток в соответствии со стадией а) способа необходим лишь в случае внутриклеточно образованных белков ферментативным (например, с помощью лизоцима), химическим (например, с помощью органических растворителей) и другими физическими методами лизиса клеток (например, с помощью обработки ультразвуком), которые также являются возможными. Для технического лизиса клеток обычно предпочтительны физические методы (Schwedes and Bunge, 1988 Mechanische Zellaufschlubverfahren, Jahrbuch der Biotechnologie, VCH Verlagsgesellschaft mhB, Weinheim, Germany). Из физических методов, не считая шаровой мельницы, особенно может быть отмечена гомогенизация при высоком давлении в качестве обоснованного и хорошо описанного метода лизиса клеток.

Различные методы лизиса клеток, упомянутые выше, могут быть применены в способе очистки изобретения.

Для стадии а) способа изобретения выбирают предпочтительно гомогенизацию при высоком давлении. Лизис клеток достигается при давлении от 2000 до 15000 psi (0.137-1.034 • 10⁸ н/м²), применяемого в течение от 1 до 6 циклов, предпочтительно при давлении от 5000 до 7000 psi (0.344-0.482 • 10⁸ н/м²), применяемом в течение от 3 до 5 циклов, наиболее предпочтительно при давлении 6000 psi (0.413 • 10⁸ н/м²), применяемом в течение 4 циклов. В случае этого метода лизируется более 95% клеток, таких, например, как клетки Е. coli.

Исключение компонентов с иной молекулярной массой с помощью повторяющейся ультрафильтрации с перекрестным током в соответствии со способом стадии b) в принципе может быть сведено к фильтрации с модулями фильтров 1 и 3 кДа NMWL (предел номинального молекулярного веса) (Cheryan, М. (1986): Руководство по ультрафильтрации, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, Pennsylvania, USA). Эта фильтрация представляет собой физический метод разделения (Vlauck, W. R.A.; Muller, Н.А. (1994): Grundoperationen chemischer Verfahrenstechnik, Deutscher Verlag fur Grundstoff-industrie, Leipzig, Federal Republic of Germany) и часто применяется при последующей обработке для отделения нерастворимой части. Соответственно, ультрафильтрация с перекрестным током часто применяется в последующей обработке при отделении целых клеток и разрушенных клеток, а также при отделении тел включения. Примеры отделения растворимых сопровождающих веществ, особенно сопровождающих белков, описаны для ультрафильтрации в лабораторном масштабе (Cheryan, М. (1986): Руководство по ультрафильтрации, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, Pennsylvania, USA). Промышленное применение ультрафильтрации с перекрестным током для отделения растворимых сопровождающих веществ неизвестно, однако и неочевидно.

На стадии b) способа для разделения по специфическому размеру молекул и/или специфической области молекулярного веса применяется последовательная организация двух этапов ультрафильтрации с перекрестным током, обладающих различными границами разделения. Эта организация выбрана таким образом, чтобы на первом этапе фильтрации интерлейкин-8 отделялся от более крупных сопутствующих компонентов, а на втором этапе фильтрации - концентрировался и отделялся от более мелких компонентов. Для достижения по возможности наиболее четкого разделения интерлейкина-8 и сопутствующих компонентов пригодны разные подходы. При первой ультрафильтрации с перекрестным током путем выбора подходящих рабочих параметров возможно получить интерлейкин-8 в фильтрате мембраны, имеющей номинально более низкую границу разделения, чем граница, соответствующая молекулярному весу интерлейкина-8. Из рабочих параметров решающее значение имеют тип мембраны и граница разделения, определяющие принципиальную возможность прохождения молекулы интерлейкина через мембрану. В способе настоящего изобретения граница разделения мембраны должна быть ниже молекулярного веса интерлейкина-8. Путем изменения рабочих параметров граница разделения повышается, и мембрана становится проницаемой для интерлейкина-8.

Предпочтительно, чтобы ультрафильтрация с перекрестным током на первом этапе фильтрации i) проводилась при границе разделения 3 кДа.

Изменение рабочих параметров может происходить в форме увеличения трансмембранного давления, например, путем повышения циркулирующего объема или снижения скорости фильтрации при добавлении добавок, таких как органические растворители, например, пропанол, бутанол и т.д., солей, таких как хлорид натрия, сульфат аммония и т.д., хаотропных агентов, таких как мочевина, соли гуанидина и т.д., поверхностно-активных веществ, таких как додецилсульфат натрия (SDS), Tритон®, Tвин® и т.д., или путем изменения величины pH. Достоинством процесса настоящего изобретения служит возможность контроля за переносом основной части заданных молекул через мембрану путем изменения рабочих параметров. Таким образом, перед повышением рабочих параметров фильтрат, полученный без заданной молекулы, может быть отброшен, так что в следующем процессе некоторые из сопутствующих компонентов окажутся уже заранее отделенными. В этом случае контролируемый перенос основной массы интерлейкина-8 через мембрану может быть достигнут путем увеличения циркулирующего объема.

При второй ультрафильтрации с перекрестным током граница разделения, более низкая, чем молекулярный вес интерлейкина-8, может быть получена путем выбора подходящих рабочих параметров. В целом здесь применяются те же возможности, что и уже упоминавшиеся выше в отношении первой ультрафильтрации с перекрестным током. В данном случае интерлейкин-8 мог бы быть отделен от меньших сопутствующих компонентов путем выбора мембраны, имеющей достаточно низкую границу разделения, то есть путем выбора подходящих рабочих параметров.

Ультрафильтрация с перекрестным током на втором этапе фильтрации ii) стадии b) способа проводится с границей раздела от 0.1 до 1.5 кДа, предпочтительно с границей раздела 1 кДа.

На стадии с) способа благодаря свойствам буфера, обеспечивающим высокий суммарный положительный заряд интерлейкина-8, стадия очистки с высоким разрешением с помощью катионообменной хроматографии проводится таким образом, что pH нанесения и элюции выбирается с тем, чтобы быть достаточно высоким для того, чтобы интерлейкин-8 оставался все еще связанным. Элюция достигается увеличением концентрации хлорида натрия в области pH от 8 до 10, предпочтительно при pH 9.5. Достоинствами этих условий хроматографии служит высокая емкость хроматографического материала, поскольку лишь очень немногие загрязняющие соединения (сопутствующие белки и эндотоксины) все еще сохраняют способность связываться, высокая чистота элюата и высокий выход.

В применяемых условиях на стадии d) способа замена буферного раствора элюата интерлейкина-8 достигается предпочтительно с помощью диализа.

Используя способ изобретения, возможно очищать интерлейкин-8 или рекомбинантный интерлейкин-8, полученный, например, с помощью прокариотных систем экспрессии, таких как клетки Е. coli, эукариотных систем экспрессии, таких как дрожжевые клетки, особенно Pichia pastoris, систем клеток насекомых, особенно Baculovirus-инфицированных и Baculovirus-трансфицированных клеток насекомых или перманентных систем клеток насекомых, с помощью клеток млекопитающих, а также трансформированных клеток млекопитающих, таких как CHO и BHK, а также вместо клеток может быть применено молоко трансгенных животных, таких как коровы и козы.

Методы клонирования и экспрессии генов в различных системах экспрессии известны специалистам в данной области науки и могут быть почерпнуты из соответствующей литературы.

Ультрафильтрация с перекрестным током на первом этапе i) фильтрации стадии b) способа может проводиться в два приема.

В зависимости от конструкции системы ультрафильтрации с перекрестным током, особенно от площади поверхности фильтра и типа мембраны площадь поверхности фильтра может составлять от 500 до 10000 см² для производственного масштаба. Результирующее трансмембранное давление
P_{транс мемб ранн ое} = (P_внутр - P_наружн)/2 - P_{фильтрата}
может соответственно лежать в диапазоне от 1 до 150 psi (от 0.0689 до 10.34•10⁵ н/м²). Рабочие параметры циркулирующего объема и скорости фильтрации таким образом варьируют в диапазонах от 1 до 10 л/мин и от 10 до 20 мл/мин. Это применяется как для первой, так и для второй фаз первого этапа фильтрации.

Предпочтительно, чтобы при ультрафильтрации с перекрестным током циркулирующий объем составлял от 1 до 4 л/мин, скорость фильтрации от 5 до 8 мл/мин и трансмембранное давление от 1 до 20 psi (от 0.0689 до 1.378 • 10⁵ н/м²) в первой фазе и циркулирующий объем от 3 до 6 л/мин, скорость фильтрации от 10 до 15 мл/мин и трансмембранное давление от 20 до 50 psi (от 1.378 до 3.44 • 10⁵ н/м²) во второй фазе.

Особенно предпочтительно, чтобы при ультрафильтрации циркулирующий объем составлял от 2 до 3 л/мин, скорость фильтрации 6.3 мл/мин и трансмембранное давление 10 psi (0.689 • 10⁵ н/м²) в первой фазе, и циркулирующий объем от 4 до 5 л/мин, скорость фильтрации от 12.7 мл/мин и трансмембранное давление 35 psi (2.4 • 10 н/м²) во второй фазе.

Также особенно предпочтительно, чтобы при ультрафильтрации циркулирующий объем составлял от 2 до 3 л/мин, скорость фильтрации 6.3 мл/мин и трансмембранное давление 10 psi (0.689 • 10⁵ н/м²) в первой фазе, и циркулирующий объем от 4 до 5 л/мин, скорость фильтрации от 18.7 мл/мин и трансмембранное давление 35 psi (2.4 • 10⁵ н/м²) во второй фазе.

Площадь поверхности фильтра в этом случае предпочтительно составляет 2100 см² с границей разделения 3 кДа.

При ультрафильтрации с перекрестным током на втором этапе ii) фильтрации стадии b) способа в зависимости от типа фильтра площадь поверхности фильтра может составлять от 500 до 10000 см². Результирующее трансмембранное давление
P_{транс мембра нное} = (P_внутр - P_наружн)/2 - P_{фильтрата}
может соответственно лежать в диапазоне от 5 до 150 psi (от 0.344 до 10.34 • 10⁵ н/м²). Рабочие параметры циркулирующего объема и скорости фильтрации таким образом будут варьировать в диапазонах от 0.5 до 10 л/мин и от 1 до 20 мл/мин.

Предпочтительно, чтобы при ультрафильтрации с перекрестным током в соответствии со вторым этапом ii) фильтрации стадии b) способа циркулирующий объем составлял от 0.5 до 3 л/мин, скорость фильтрации от 4 до 6 мл/мин и трансмембранное давление от 8 до 12 psi (от 0.552 до 0.827 • 10⁵ н/м²).

Особенно предпочтительно, чтобы при ультрафильтрации с перекрестным током в соответствии с этапом ii) фильтрации стадии b) способа циркулирующий объем составлял от 1 до 2 л/мин, скорость фильтрации 5 мл/мин и трансмембранное давление 10 psi (0.689 • 10⁵ н/м²). Поверхность фильтра в этом случае составляет предпочтительно 700 см² с границей разделения 1 кДа.

Для увеличения выхода интерлейкина-8 дополнительно клеточный дебрис, полученный на первом этапе i) фильтрации стадии b) способа
а) может сначала обрабатываться мочевиной до достижения 8 М раствора последней, затем
b) раствор в мочевине может быть подвергнут двукратной гомогенизации при высоком давлении для солюбилизации нерастворившегося интерлейкина-8 и, наконец,
с) полученный таким образом продукт может быть далее очищен в соответствии со стадиями с), d) и e) процесса.

pH 8М раствора мочевины, указанного в a) и b), предпочтительно доводится до оптимальной величины 9.5.

Гомогенизация при высоком давлении, выполняемая в b), проводится при давлении от 2000 до 10000 psi (0.138-0.690 • 10⁸ н/м²), применяемом в течение от 1 до 6 циклов, предпочтительно при давлении от 4000 до 8000 psi (0.276-0.551 • 10⁸ н/м²), применяемом в течение от 1 до 3 циклов, и особенно предпочтительно при давлении 6000 psi (0.414 • 10⁸ н/м²), применяемом в течение 2 циклов.

Интерлейкин-8, очищенный с помощью способа настоящего изобретения, может быть использован для исследовательских, лечебных и диагностических целей.

В частности, процесс изобретения для очистки интерлейкина-8 является очень экономичным процессом, применение которого соответствует условиям GMP, то есть производство интерлейкина-8 удовлетворяет требованиям GMP.

Выход, рассчитанный на основании растворимой части, составляет приблизительно 50%. Это очень высокий выход по сравнению с другими промышленными методами очистки для получения экспрессируемых в бактериях рекомбинантных белков в соответствии с GMP и более чем удовлетворительно с точки зрения экономичности. Соответственно, наблюдается четко выраженное преимущество по сравнению с обычными процессами, при которых для достижения того же результата требуется несколько хроматографических стадий с использованием литрового масштаба. Теоретически, при условиях традиционных процессов, использующих по меньшей мере 4 хроматографические стадии с DMF материалами и средним выходом на стадии 80%, можно установить, что выход будет составлять 0.8⁴ = 0.41 или 41%. При этом не принимались в расчет стартовые потери, связанные с удалением клеточных обломков и ДНК, и потери из-за смены буфера. Для хорошей промышленной разработки, удовлетворяющей условиям GMP, приемлемым считается выход белка, экспрессируемого в бактериях, составляющий от 10 до 20%.

Что касается материальных затрат, включаемых в производство, прежде всего можно сделать несколько общих оценок, в соответствии с которыми получение бактериального рекомбинантного белка может составлять от 50 до 70% всех производственных затрат. Основная часть производственных затрат возникает из-за дорогостоящего хроматографического материала. При классических методах такого типа применяется несколько хроматографических колонок литрового размера для достижения того же выхода высокоочищенного белка, как и в случае настоящего процесса. Одним из главных достижений разработанного процесса является то, что для выделения высокоочищенного белка требуется всего лишь одна хроматографическая стадия, которая в отличие от классических литровых размеров характеризуется миллилитрами. Таким образом, по сравнению с классическими процессами очистки имеется значительное снижение затрат.

На фиг. 1 показана зависимость общей концентрации белка от количества циклов. Все математические модели отражены в виде соответствующей формулы и параметров.

На фиг. 2 показано общее количество интерлейкина-8 в фильтрате III в зависимости от времени.

Следующие примеры иллюстрируют процесс очистки изобретения, которое не ограничивается представленными рабочими примерами.

Рабочие примеры
1. Клонирование и ферментация интерлейкина-8
Часть гена интерлейкина-8 человека, кодирующая форму белка из 72 аминокислот, была вставлена в плазмиду pMS119EH(L). Штамм Е. coli TG1 трансформировали полученным вектором экспрессии pIL8/tac. Полученный таким образом клон Е. coli TG1 (pIL8/tac) экспрессировал интерлейкин-8. Условия ферментации были следующими:
из проточной культуры Е. coli TG1 (pIL8/tac), хранившейся при -70^oC в глицерине, отбирали 20 мкл и инкубировали в течение 48 ч при 37^oC в культуре на агаре в L среде (10 г/л триптофана (Difco), 5 г/л дрожжевого экстракта (Difco), 10 г/л NaCl) и 200 мг/л ампициллина. Колонии затем вымывали 5 мл L среды. 100 мкл этой культуры использовали для инокуляции 500 мл флакона для встряхивания, содержащего 100 мл L среды. Эту первую предварительную культуру инкубировали в течение 16 ч при 37^oC при частоте встряхивания 180 об/мин. 10 мл этой предварительной культуры использовали для инокуляции второй предварительной культуры в 2-литровом флаконе для встряхивания, содержащем 1000 мл L среды. Инкубацию проводили в течение 48 ч при условиях, упомянутых выше. 1000 мл этой второй предварительной культуры использовали для инокуляции 300-литрового ферментера, содержащего 200 л L среды. Ферментер перемешивали при 150 об/мин при 28^oC и аэрировали при 5 м³/ч. После 4 ч ферментации индуцировали экспрессию интерлейкина-8 добавлением 0.25 ммоль/л IPTG и ферментацию продолжали в течение последующих 8 ч. Бактериальные клетки затем убивали добавлением октанола до концентрации 0.1%. После добавления октанола партию перемешивали в течение 2 мин при 45 об/мин и инкубировали дополнительно в течение еще 5 мин без перемешивания. Клетки собирали с помощью сепаратора при 6600 х g и 200 л/ч и концентрировали из 200 л до 7 л. Осадок бактериальных клеток получали из этих 7 л с помощью центрифугирования.

2. Очистка интерлейкина-8
2.1. Лизис клеток гомогенизацией при высоком давлении (стадия а) способа)
423.35 г клеточной массы (влажный вес) ресуспендировали в 50 мМ NaCl, 20 мМ ТРИС, pH 8.0 для получения конечного объема 1730 мл и лизировали с помощью гомогенизации при высоком давлении, причем лизис ресуспендированной клеточной массы проводили в течение 4 циклов при давлении 6 000 psi (0.414 • 10⁸ н/м²). Наличие лизиса клеток анализировали с помощью определения суммарного белка, SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, ПААГ с ДСН) и иммуноферментного анализа. Зависимость концентрации суммарного белка от количества циклов гомогенизации при высоком давлении показана на фиг. 1. Глядя на концентрацию суммарного растворимого белка, можно видеть, что лизис клеток является реакцией первого порядка. Кривая концентрации суммарного белка демонстрирует заметное снижение крутизны с ростом числа циклов. Это указывает на адекватный лизис клеток в предпочтительно 4-х выбранных циклах. Более того, можно найти эмпирическую поправку для описания лизиса клеток. Концентрация интерлейкина-8, обнаруживаемая в индивидуальных циклах, лишь слабо меняется от 0.15 мг/мл после первого цикла до 0.17 мг/мл после 4-го цикла. При ПААГ с ДСН лучший эффект разделения индивидуальных полос наблюдался при увеличении количества циклов, что вероятно может быть отнесено за счет фрагментации ДНК. Общее количество растворимого белка, определенное методом ВСА (методом окраски Кумасси), равно 6643.2 мг. На долю интерлейкина-8 из этого количества приходится при осторожной оценке до 4.4%.

2.2. Исключение по молекулярному весу с помощью повторяющейся ультрафильтрации с перекрестным током (стадия b) способа)
Полный гомогенат клеточного лизата из стадии а) способа подвергали ультрафильтрации с перекрестным током с использованием мембраны, имеющей границу разделения 3 кДа. Полученный фильтрат затем обрабатывали с помощью той же техники с границей разделения 1 кДа. Ультрафильтрацию с границей разделения 3 кДа проводили в два этапа, проводя фильтрацию с помощью 3 кДа NMWL (предел номинального молекулярного веса) модифицированной PES мембраны с площадью поверхности фильтра 2100 см². Выбранные применяемые условия были следующими:
буфер для фильтрации: 5 мМ EDTA, 50 мМ NaCl, 20 мМ ТРИС, pH 9.5,
первая фаза: циркулирующий объем: 2-3 л/мин,
скорость фильтрации 6.3 мл/мин,
трансмембранное давление 10 psi (0.689•10⁵ н/м²).

После смены двух объемов параметры фильтрации увеличивали.

вторая фаза: циркулирующий объем: 4-5 л/мин,
скорость фильтрации 12.7 мл/мин,
трансмембранное давление 35 psi (2.4•10⁵ н/м²).

Было получено 8620 мл фильтрата I и 1110 мл удерживаемого материала I. Определение содержания суммарного белка с помощью ВСА показало, что из первоначальных 6643.2 мг суммарного растворимого белка клеточного лизата, 2508.6 мг все еще могли быть обнаружены в удерживаемом материале I и 2293.3 мг в фильтрате I. Анализ растворимого интерлейкина-8 после аналитической HPLC с использованием колонки C4 с обращенной фазой показал, что его концентрация в удерживаемом материале I и в фильтрате I находится ниже нижней границы определения, составляющей менее 0.005 мг/мл. Дальнейший анализ с помощью иммуноферментного метода выявил интерлейкин-8 в удерживаемом материале 1 в концентрации 0.002 мг/мл (2.2 мг интерлейкина-8).

Фильтрат I далее обрабатывали, проводя фильтрацию при границе разделения 1 кДа. 1 кДа ультрафильтрацию с перекрестным током проводили с использованием 1 кДа NMWL (предел номинального молекулярного веса) модифицированной PES мембраны с площадью поверхности фильтра 700 см². Выбранные применяемые условия были следующими:
циркулирующий объем: 1-2 л/мин,
скорость фильтрации 5.0 мл/мин,
трансмембранное давление 10 psi (0.689•10⁵ н/м²).

8620 мл фильтрата I концентрировали до 600 мл удерживаемого материала II с образованием 8020 мл фильтрата II. Анализ удерживаемого материала II с помощью ПААГ с ДСН обнаружил интенсивную полосу в области, соответствующей молекулярному весу интерлейкина-8. В области с молекулярным весом, более низким, чем у интерлейкина-8, можно было обнаружить две существенно более слабые полосы. Приблизительная оценка чистоты интерлейкина-8, определенная на основании суммарного белка по данным профиля элюции с HPLC с обращенной фазой составила величину 25%. Секвенирование по Edman N-конца интерлейкина-8 в удерживаемом материале II подтвердило сходную чистоту. Дальнейший анализ, проведенный для определения концентрации с помощью ELISA, выявил концентрацию интерлейкина-8 в удерживаемом материале II, равную 0.31 мг/мл (186 мг интерлейкина-8), причем в фильтрате II концентрация интерлейкина-8 была ниже 0.0001 мг/мл (< 0.8 мг интерлейкина-8). После одной предварительной обработки степень обнаружения составила 63.2% и чистота > 25%.

2.3. Очистка с высоким разрешением с помощью катионообменной хроматографии (стадия с) способа)
На 45-мл колонку CM Сефарозы (ХК26 колонка с FPLC системой) наносили 600 мл удерживаемого материала II, что составляло 90% ее емкости. Последовательность этапов хроматографии 45-мл колонки СМ Сефарозы представлена в таблице 1.

Путем анализа, проведенного с помощью C4-HPLC с обращенной фазой, обнаружен выход более 90%; сопутствующие белки при этом более не выявлялись. Что касается элюата интерлейкина-8, получаемого при ступенчатой элюции, то было получено 173.4 мг интерлейкина-8 по результатам аналитической C4-HPLC с обращенной фазой. Концентрация элюата составляла 2.1 мг/мл, что является относительно высокой величиной, и сопутствующие белки более не могли быть обнаружены. Поскольку эндотоксины и ДНК обычно также отделяются в процессе хроматографии на слабом катионообменнике, элюат интерлейкина-8 исследовали на чистоту (с помощью ПААГ с ДСН с перегрузкой геля) и на содержание эндотоксинов (LAL тест). Сопутствующие белки также не обнаруживались после перегрузки ПААГ с ДСН при окраске белка Кумасси. Удаление эндотоксина, как оказалось, было очень эффективным. Концентрация эндотоксина составляла менее 1.5 пг/мкг интерлейкина-8, что было ниже предела определения. Элюат был кондиционирован и подвергнут контролю как конечный продукт.

2.4. Диализ (стадия d) способа)
Элюат интерлейкина-8 диализовали против PBS и доводили до концентрации 1.00 мг/мл. Диализ проводили с мембраной, имеющей границу разделения 3.5 кДа. Элюат интерлейкина-8 диализовали в течение 1, 2.5 и 20 ч, каждый раз против 5 л свободного от пирогена PBS буфера. После диализа можно было вновь обнаружить 141.7 мг интерлейкина-8, что соответствует выходу в 82%. После диализа концентрацию доводили до 1.00 мг/мл интерлейкина-8 с помощью свободного от пирогена PBS буфера и проверяли с помощью анализа белка Pierce BCA, используя в качестве белка сравнения BSA (бычий сывороточный альбумин).

2.5. Лиофилизация (стадия e) способа)
После создания концентрации 1.00 мг/мл раствора интерлейкина-8 в PBS проводили лиофилизацию. Для этой цели раствор разносили в подходящие маленькие емкости в виде аликвот по 1.00 мл (1.00 мг интерлейкина-8 на емкость) и подвергали глубокому замораживанию при -70^oC. После 12 ч при -70^oC проводили лиофилизацию в течение 36 ч. Сосуды с образцами запаивали и хранили при -70^oC. Случайно выбранный образец подвергали контролю в качестве конечного продукта.

3. Выход способа очистки
Выход способа очистки изобретения составляет приблизительно 50%. Это неожиданно высокая величина для бактериально экспрессируемого белка. Таблица 2 суммирует результаты анализа способа очистки:
Оптимизация экспериментов с двойной ультрафильтрацией с перекрестным током показала, что выход 63.2% может быть увеличен до более чем 80%. Соответственно, оптимизированный процесс очистки может давать выходы до 65%
4. Производственные свойства способа
Для контроля продукта проводили тесты на чистом конечном продукте в отношении идентификации, концентрации, чистоты, содержания эндотоксина и биологической активности, все эти показатели соответствовали спецификациям FDA для GMP производства для применения на людях и были следующими:
4.1. Идентификация
Секвенирование по Edman (1950) N-конца.

Требуемая последовательность интерлейкина-8 может быть однозначно подтверждена.

Иммуноблоттинг с поли- и моноклональными антителами против интерлейкина-8.

Иммуноблоттинг выявил прямую линейную зависимость между интенсивностью сигнала и концентрацией очищенного наносимого препарата.

4.2. Концентрация
Анализ белка Pierce BCA
Определение концентрации суммарного белка с помощью анализа белка Pierce BCA с использованием в качестве белка сравнения BSA дает 1.00 мг/мл.

4.3. Чистота
HPLC с обращенной фазой
В тесте с HPLC с обращенной фазой для чужеродного белка с помощью колонки C4 сопутствующий белок не мог быть обнаружен при 214 нм.

ПААГ с ДСН с окраской серебром
ПААГ с ДСН с окраской серебром также обнаружил лишь одну полосу интерлейкина-8. Другие полосы не могли быть обнаружены.

ПААГ с ДСН с окраской Кумасси и измерением интенсивности полосы
Анализ ПААГ с ДСН с окраской Кумасси и последующим измерением интенсивности полосы дал чистоту более 99% для очищенного продукта.

4.4. Эндотоксины
LAL тест
LAL тест показал содержание эндотоксина менее 1.5 пг/мкг интерлейкина-8 при концентрации последнего 1.00 мг/мл.

4.5. Биологическая активность
Реакция хемотаксиса нейтрофилов
Величина ED₅₀, измеренная с помощью реакции хемотаксиса нейтрофилов, составляла 0.84 ммоль/л.

5. Солюбилизация интерлейкина-8, остающегося в клеточном дебрисе
Обломки клеток, которые хранили при -70^oC, лизировали с помощью гомогенизации при высоком давлении и обрабатывали с помощью фильтрации с границей разделения 3 кДа (смотри вторую стадию очистки интерлейкина-8), "оттаивали" на льду, нагревали до комнатной температуры и растворяли с помощью перемешивания с кристаллической мочевиной до получения конечной концентрации последней 8 М. Величина pH составляла 9.5. Затем проводили двукратную гомогенизацию при высоком давлении с помощью гомогенизатора, и суспензию в 8 М мочевине подвергали двум циклам при давлении 6000 psi (0.414 • 10⁸ н/м²). Отдельные стадии анализировали с помощью иммуноферментного теста на интерлейкин-8. Таблица 3 схематически показывает отдельные этапы солюбилизации интерлейкина-8 в промышленном масштабе и их результаты.

После последней стадии процесса промышленной солюбилизации было получено 228.0 мг интерлейкина-8. Было обнаружено, что в процессе производственной реакции добавление мочевины и 12-часовая обработка мочевиной оказывает наибольшее влияние на солюбилизацию. Двукратная гомогенизация, с другой стороны, дала лишь слабое увеличение концентрации интерлейкина-8.

Последующие тесты показали, что более высокие величины выхода получаются при более длительной инкубации раствора 8 М мочевины при pH 9.5. В лабораторном масштабе обработка мочевиной в течение 24, 36 и 48 ч при тех же условиях могла давать двух-трехкратный выход.

После такой обработки раствор 8 М мочевины доводили деионизированной H₂O до 4 М последней (система миллипор Q) (разведение 1:1) и вновь подвергали фильтрации с границей разделения 3 кДа, а полученный фильтрат III был далее подвергнут фильтрации с границей разделения 1 кДа в соответствии с процедурой, описанной выше. Фильтрацию удерживаемого материала I проводили в две стадии. На первой стадии раствор 4 М мочевины концентрировали и на второй стадии фильтровали с 5 мМ EDTA, 50 мМ NaCl, 20 мМ ТРИС, pH 9.5.

Буфер для фильтрации: 5 мМ EDTA, 50 мМ NaCl, 20 мМ ТРИС, pH 9.5,
первая фаза: циркулирующий объем: 2-3 л/мин,
скорость фильтрации 6.3 мл/мин,
трансмембранное давление 10 psi (0.689 • 10⁵ н/м²).

После двух смен объема параметры фильтрации увеличивали.

вторая фаза: циркулирующий объем: 4-5 л/мин,
скорость фильтрации 18.7 мл/мин,
трансмембранное давление 35 psi (2.4 • 10⁵ н/м²).

Количество интерлейкина-8 в фильтрате III анализировали с помощью иммуноферментного метода. Результаты показаны на фиг. 2. Процесс фильтрации описывается сигмоидной кривой, причем область перегиба определяется прежде всего увеличением рабочих параметров на стадии фильтрации. Таким образом, формируется картина процесса фильтрации, характерная для реакции первого порядка.

Общее количество солюбилизированного интерлейкина-8 в фильтрате III, которое могло быть отделено от удерживаемого материала I за 18 ч с помощью фильтрации с границей разделения 3 кДа, составило 232.0 мг с концентрацией 0.015 мг/мл. Фильтрат III был далее подвергнут фильтрации с границей разделения 1 кДа. После концентрирования 7815 мл фильтрата III до 1250 мл удерживаемого материала IV, путем анализа с помощью C4-HPLC с обращенной фазой обнаружена концентрация интерлейкина-8 0.087 мг/мл (109.0 мг интерлейкина-8). Это соответствует выходу более 90%. Концентрация интерлейкина-8 в фильтрате IV составляла менее 0.005 мг/мл и была ниже предела определения. Можно увидеть, что суммарный выход интерлейкина-8 может быть почти удвоен с помощью этого этапа солюбилизации.

Способ очистки рекомбинантного интерлейкина-8 человека, полученного различными способами, включает лизис исходных клеток, ультрафильтрацию и комбинированную хроматографию с последующим диализом или ультрафильтрацией. Исходные клетки могут представлять собой клетки эукариатных систем экспрессии или трансформированные клетки млекопитающих. Для каждой стадии очистки подобраны специальные условия ее проведения. В результате осуществления способа получают интерлейкин-8 с высоким выходом и высокой чистотой. 32 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.

1. Способ очистки интерлейкина-8, отличающийся тем, что а) клетки лизируют в буферном растворе, b) полученный лизат для исключения по молекулярному весу подвергают повторяющейся ультрафильтрации с перекрестным током таким образом, что i) на первом этапе фильтрации отделяют интерлейкин-8 от сопровождающих компонентов с молекулярным весом большим, чем у интерлейкина-8, ii) на втором этапе фильтрации отделяют от компонентов с молекулярным весом меньшим, чем у интерлейкина-8, с) забуференный фильтрат, полученный на стадии b), подвергают высокоэффективной очистке с помощью катионообменной хроматографии, при которой положительно заряженная поверхность молекулы интерлейкина-8 используется в форме, позволяющей выбирать величины рН нанесения и элюции, достаточные для того, чтобы интерлейкин-8 оставался прочно связанным, после чего d) забуференный раствор элюата интерлейкина-8 со стадии с) подвергают гель-фильтрации, диализу или ультрафильтрации и затем е) раствор интерлейкина-8, полученный на стадии d) лиофилизируют. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при ультрафильтрации с перекрестным током на первом этапе i) фильтрации стадии b) способа граница разделения мембраны является более низкой, чем молекулярный вес интерлейкина-8. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что ультрафильтрацию с перекрестным током на первом этапе i) фильтрации проводят при границе разделения 3 кДа. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при ультрафильтрации с перекрестным током на втором этапе ii) фильтрации стадии b) способа граница разделения мембраны является более низкой, чем молекулярный вес интерлейкина-8. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что ультрафильтрацию с перекрестным током на втором этапе ii) фильтрации стадии b) способа проводят при границе разделения 0,1 - 1,5 кДа. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что ультрафильтрацию с перекрестным током на втором этапе ii) фильтрации стадии b) способа проводят при границе разделения 1 кДа. 7. Способ по любому из пп.1 - 6, отличающийся тем, что на стадии а) способа лизис клеток достигается гомогенизацией при высоком давлении. 8. Способ по любому из пп.1 - 6, отличающийся тем, что на стадии а) способа лизис клеток достигается ферментативно или химически. 9. Способ по любому из пп.1 - 7, отличающийся тем, что лизис клеток на стадии а) способа достигается при давлении от 2000 до 15,000 psi (от 0,137 до 1,034•10⁸ н/м²), применяемом в течение 1 - 6 циклов. 10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что лизис клеток на стадии а) способа достигается при давлении 5000 - 7000 psi (от 0,344 до 0,482•10⁸ н/м²), применяемом в течение 3 - 5 циклов. 11. Способ по п.9 или 10, отличающийся тем, что лизис клеток достигается при давлении 6000 psi (от 0,413•10⁸ н/м²), применяемом в течение 4 циклов. 12. Способ по любому из пп.1 - 11, отличающийся тем, что клетки, подвергаемые лизису, представляют собой клетки прокариотных систем экспрессии. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что клетки, подвергаемые лизису, представляют собой клетки E.coli. 14. Способ по любому из пп.1 - 11, отличающийся тем, что клетки, подвергаемые лизису, представляют собой клетки эукариотных систем экспрессии. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что клетки, подвергаемые лизису, представляют собой дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки млекопитающих. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что дрожжевые клетки происходят из Pichia pastoris и клетки насекомых происходят от Baculovirus-трансфицированных клеток насекомых. 17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что трансформированные клетки млекопитающих представляют собой СНО и ВНК. 18. Способ по п.14, отличающийся тем, что вместо клеток может быть также применимо молоко трансгенных животных, таких, как коровы и козы. 19. Способ по любому из пп.1 - 18, отличающийся тем, что на стадии а) способа величина рН раствора для нанесения и элюции составляет 8 - 10. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что величины рН раствора для нанесения и элюции составляют 9,5. 21. Способ по любому из пп.1 - 20, отличающийся тем, что ультрафильтрация с перекрестным током на первом этапе i) фильтрации стадии b) способа проводится в две фазы. 22. Способ по п.21, отличающийся тем, что при ультрафильтрации с перекрестным током применяют циркулирующий объем 1 - 10 л/мин, скорость фильтрации 1 - 20 мл/мин и трансмембранное давление 1 - 150 psi (от 0,0689 до 10,34•10⁵ н/м²) как на первой фазе, так и на второй фазе. 23. Способ по пп.21 или 22, отличающийся тем, что при ультрафильтрации с перекрестным током на первой фазе применяют циркулирующий объем 1 - 4 л/мин, скорость фильтрации 5 - 8 мл/мин и трансмембранное давление 1 - 20 psi (от 0,0689 до 1,378•10⁵ н/м²), а на второй фазе применяют циркулирующий объем 3 - 6 л/мин, скорость фильтрации 10 - 15 мл/мин и трансмембранное давление 20 - 50 psi (от 1,378 до 3,44•10⁵ н/м²). 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что при ультрафильтрации на первой фазе применяют циркулирующий объем 2 - 3 л/мин, скорость фильтрации от 6,3 мл/мин и трансмембранное давление 10 psi (от 0,689•10⁵ н/м²), а на второй фазе применяют циркулирующий объем 4 - 5 л/мин, скорость фильтрации 12,7 мл/мин и трансмембранное давление 35 psi (2,4•10⁵ н/м²). 25. Способ по п.22, отличающийся тем, что при ультрафильтрации на первой фазе применяют циркулирующий объем 2 - 3 л/мин, скорость фильтрации от 6,3 мл/мин и трансмембранное давление 10 psi (от 0,689•10⁵ н/м²), а на второй фазе применяют циркулирующий объем 4 - 5 л/мин, скорость фильтрации 18,7 мл/мин и трансмембранное давление 35 psi (2,4•10⁵ н/м²). 26. Способ по любому из пп.1 - 25, отличающийся тем, что при ультрафильтрации с перекрестным током на втором этапе ii) фильтрации стадии b) способа применяют циркулирующий объем 0,5 - 10 л/мин, скорость фильтрации 1 - 20 мл/мин и трансмембранное давление 5 - 150 psi (от 0,345 до 10,34•10⁵ н/м²). 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что при ультрафильтрации с перекрестным током на втором этапе ii) фильтрации стадии b) способа применяют циркулирующий объем 0,5 - 3 л/мин, скорость фильтрации 4 - 6 мл/мин и трансмембранное давление 8 - 12 psi (от 0,552 до 0,827•10⁵ н/м²). 28. Способ по п.26 или 27, отличающийся тем, что при ультрафильтрации с перекрестным током применяют циркулирующий объем 1 - 2 л/мин, скорость фильтрации 5 мл/мин и трансмембранное давление 10 psi (от 0,689•10⁵ н/м²). 29. Способ по любому из пп. 1 - 28, отличающийся тем, что клеточный дебрис, полученный на первом этапе i) фильтрации стадии b) способа а) сначала обрабатывают мочевиной до концентрации раствора мочевины 8 М, затем b) раствор мочевины подвергают двукратной гомогенизации при высоком давлении для солюбилизации нерастворившегося интерлейкина-8, и наконец с) полученный таким образом продукт подвергают последующей очистке в соответствии со стадиями с), d) и е) способа. 30. Способ по п.29, отличающийся тем, что раствор мочевины, упомянутый в пунктах а) и b), обладает оптимумом рН 9,5. 31. Способ по п.29 или 30, отличающийся тем, что гомогенизацию при высоком давлении, выполняемую в подпункте b), проводят при давлении 2000 - 10000 psi (0,138-0,690•10⁸ н/м²), применяемом в течение 1 - 6 циклов. 32. Способ по п.31, отличающийся тем, что гомогенизацию при высоком давлении, выполняемую в подпункте b), проводят при давлении 4000 - 8000 psi (0,276-0,551•10⁸ н/м²), применяемом в течение 1 - 3 циклов. 33. Способ по п.31 или 32, отличающийся тем, что гомогенизацию при высоком давлении, выполняемую в подпункте b), проводят при давлении 6000 psi (0,414•10⁸ н/м²), применяемом в течение 2 циклов.