ПРОЦЕСС И АППАРАТ ДЛЯ ОТДЕЛЕНИЯ БЕЛКА, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕГО ИНТЕРЕС, ОТ ГЕТЕРОГЕННОЙ ТКАНЕВОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОЙ СМЕСИ И ЕГО ОЧИСТКИ Российский патент 2010 года по МПК C07K14/47 C07K14/435 C12P21/06 B01D61/14 

Описание патента на изобретение RU2390526C2

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу и системе очистки молекулы, представляющей интерес, от гетерогенной смеси молекул. Конкретнее, настоящее изобретение направлено на способы очистки белка, представляющего интерес, в потоке тканевой культуральной жидкости, получаемой в ходе непрерывного процесса перфузионной ферментации.

Предпосылка создания изобретения

Специалистам в данной области техники хорошо известно, что в течение последних лет с большим коммерческим успехом было разработано несколько непрерывных процессов культивирования клеток, которые называют также непрерывными процессами перфузии. Однако процесс выделения, осуществляемый непосредственно после непрерывного процесса перфузионной ферментации, является, как правило, периодическим процессом, отделенным в физическом и материально-техническом отношении от предшествующих стадий непрерывного технологического процесса. Основная цель стадии выделения в ходе осуществления этих процессов заключается в сборе продукта из больших объемов относительно разбавленного культурального супернатанта. Следует обратить особое внимание на концентрацию продукта с точки зрения материально-технических и пространственных требований, предъявляемых к указанному процессу, поскольку одновременное удаление загрязняющих примесей (очистка) играет весьма существенную роль в отношении сведения до минимального уровня требуемого количества дополнительных последующих стадий очистки.

На Фиг.1 схематически представлен типичный современный процесс выделения продукта, получаемого в ходе непрерывной перфузионной ферментации, хорошо известный специалистам в данной области техники. Система непрерывной перфузионной ферментации включает устройство (1) для удержания клеток, которое задерживает большую часть клеток, продуцирующих продукт в системе ферментации. Непрерывный поток клеток, выросших в культуре, из системы непрерывной перфузионной ферментации, все еще содержащий некоторое количество клеток, дебрис и другие частицы, перекачивается с помощью насоса (2) для перекачивания клеток, выросших в культуре, в сборные резервуары (3) большого объема, например баки из нержавеющей стали. Эти резервуары для хранения собранных клеток, выросших в культуре, должны, как правило, охлаждаться для удержания потерь продукта, вызванных разложением, в приемлемых пределах.

После завершения сбора определенного объема, для чего, как правило, требуется от 1 дня до 4 дней или более, сборные резервуары клеток, выросших в культуре, отсоединяются от стерильного ферментационного чана, и собранный материал помечается как одна партия клеток, выросших в культуре. Следующей стадией является удаление клеток, дебриса и частиц (стадия 2). В промышленном масштабе это, как правило, осуществляется посредством центрифугирования (4) с последующей ультрафильтрацией (5) через полупроницаемую мембрану с глухим концом либо объемной фильтрацией (6) с глухим концом с последующей ультрафильтрацией (7) через полупроницаемую мембрану с глухим концом. Другим иногда применяемым способом является микрофильтрация с тангенциальным (либо "перекрестным") потоком. В любом случае, продуктом процесса удаления частиц является партия осветленной тканевой культуральной жидкости или cTCF (8). Подробнее вопрос отделения частиц от биотехнологических продуктов рассматривается в стандартных учебниках, смотри, например, Biotechnology, том 3, Bioprocessing, Wiley-VCH, 2 издание (1996), ISBN:3527283137.

На следующей стадии (стадия 3) партия осветленной тканевой культуральной жидкости подвергается дополнительной обработке с целью концентрации и, по возможности, очистки продукта. Это, как правило, осуществляется посредством ультрафильтрации с перекрестным потоком либо хроматографии в уплотненном слое.

В случае ультрафильтрации с перекрестным потоком cTCF закачивают в рециркуляционный бак (9) системы. Насос (10) применяют для проталкивания материала через ультрафильтр с перекрестным потоком. Продукт задерживается мембраной и рециркулируется в виде осадка в рециркуляционный бак, в то время как вода и загрязняющие примеси меньшего размера проталкиваются через мембрану в растворенное вещество (11) вследствие трансмембранного давления, образующегося в результате перепада давления на ультрафильтрационном модуле. Таким образом, при каждом прохождении через фильтр cTCF становится все более концентрированной, а общий объем cTCF уменьшается до достижения необходимого коэффициента концентрации. После достижения необходимого коэффициента концентрации процесс останавливают и оставшийся объем концентрата (изолята) сливают из системы и собирают. Подробнее процесс ультрафильтрации с перекрестным потоком для концентрации биотехнологических продуктов рассматривается в стандартных учебниках, смотри, например, Biotechnology, том 3, Bioprocessing, Wiley-VCH, 2 издание (1996), ISBN:3527283137.

В случае хроматографии в уплотненном слое cTCF прокачивают через хроматографическую колонку (12), содержащую уплотненный слой смолы. Продукт связывается со смолой с последующим элюированием, как правило, в концентрированной и очищенной форме (изолят, 13) с помощью соответствующего буфера (14) для элюирования, после чего осуществляют очистку и регенерацию колонки с помощью соответствующих буферов и растворов (14) для очистки.

Другими вариантами хроматографии, предложенными для концентрации/очистки cTCF, являются хроматография в расширяющемся слое и мембранная хроматография. Посредством хроматографии в расширяющемся слое можно обрабатывать растворы, содержащие частицы. По-прежнему, однако, сохраняется необходимость фильтрации изолята после хроматографии, хотя площади фильтрования сокращаются. В мембранной хроматографии вместо уплотненных слоев смолы применяют пакеты модифицированных микрофильтрационных мембран. Преимущество заключается в том, что массоперенос становится в большей мере конвективным, нежели диффузионным, что обеспечивает ускоренное разделение. В прочих отношениях упомянутый процесс, как правило, эквивалентен стандартному процессу хроматографии в уплотненном слое. Подробнее процесс хроматографии для концентрации и очистки биотехнологических продуктов рассматривается в стандартных учебниках, смотри, например, Protein Purification, Principles, High-Resolution Methods, и Applications, Wiley-VCH, 2 издание (1998), ISBN:0-471-18626-0.

Основную массу изолята в последующем часто замораживают и хранят для более позднего использования на дополнительных последующих стадиях очистки.

Таким образом, как описано выше, процесс выделения, как правило, является периодическим процессом, отделенным в физическом и материально-техническом отношении от предшествующего непрерывного процесса. Кроме того, в то время как ферментация должна осуществляться в стерильных условиях, выделение (то есть удаление частиц и концентрация/очистка) осуществляется по сути с соблюдением чистоты, но не в стерильных условиях.

Процессы известного уровня техники, описанные выше, имеют ряд проблем:

P1. Потери выхода и потенциальное снижение качества вследствие длительного времени пребывания материала в установке. Клетки, выросшие в культуре в ходе непрерывного процесса перфузионной ферментации, должны собираться и храниться в течение значительных периодов времени, как указывалось выше, перед обработкой выделенной партии. Собранные клетки, выросшие в культуре, хотя и охлажденные, все еще представляют собой вредную среду для сложных и, по своему существу, нестабильных белковых продуктов. Вследствие этого происходит существенная потеря продукта, что снижает производительность установки и повышает стоимость продукта. В дополнение к этому, может оказываться отрицательное воздействие на качество продукта.

Р2. Для промежуточного хранения больших объемов клеток, выросших в культуре, необходимы холодильные емкости или охлаждаемые резервуары значительных размеров, следствием чего являются высокие капитальные затраты и сведение на нет преимуществ перфузионных ферментеров, заключающихся в компактности и мобильности.

Р3. Традиционные способы концентрации/очистки (например, ультрафильтрация, хроматография в уплотненном слое) имеют относительно низкую объемную производительность, значительное общее время производственного цикла и относительно трудоемки. Как следствие, в течение дня осуществляется, как правило, не более 1 периодического процесса.

Р4. В дополнение к этому, современные процессы и способы выделения сталкиваются с материально-техническими трудностями, поскольку процессу обработки на ферментационных установках подвергаются изменяющиеся объемы материала, что подразумевает использование более чем одного ферментера. В составе промышленных установок непрерывной перфузионной ферментации работает различное количество ферментеров.

Р5. Кроме того, современные процессы выделения осуществляются с соблюдением чистоты, однако они не могут осуществляться с соблюдением стерильности. Следствием этого часто является значительное количество отбракованных партий вследствие проблем с микробным загрязнением.

Р6. Утилизация предметов одноразового использования, например одноразовых фильтров, комплектов (узлов), мягких резервуаров и т.п., хотя и очень желательная при производстве парентеральных препаратов для людей (например, для избежания очистки, оценки степени очистки и прочих проблем), является очень дорогостоящей и фактически часто невыгодной с экономической точки зрения.

Соответственно, целью настоящего изобретения является предложение интегрированного процесса непрерывного отделения белка, способного работать в течение длительных промежутков времени в стерильных условиях.

Суть изобретения

Настоящее изобретение направлено на новый аппарат и процесс очистки молекул от гетерогенной жидкой смеси. Конкретнее, настоящее изобретение направлено на процесс очистки молекулы, представляющей интерес, от гетерогенной осветленной жидкой смеси, из которой были удалены крупнодисперсные загрязняющие примеси. Упомянутый процесс включает стадию фильтрации гетерогенной осветленной жидкой смеси посредством непрерывной ультрафильтрации с удельной скоростью потока ниже точки фазового перехода молекулы, представляющей интерес, на зависящем от давления на участке кривой поток-ТМР (трансмембранное давление), где удельная скорость потока поддерживается по сути на постоянном уровне в течение всего непрерывного процесса ультрафильтрации.

Согласно конкретным вариантам осуществления процесс, предложенный настоящим изобретением, включает фильтрацию осветленной жидкой смеси через ультрафильтрационную мембрану, имеющую площадь в квадратных метрах, равную приблизительно 0,1-2 объемным расходам осветленной жидкой смеси в литрах в час. Согласно другому варианту осуществления процесс, предложенный настоящим изобретением, включает фильтрацию осветленной жидкой смеси через ультрафильтрационную мембрану, имеющую площадь в квадратных метрах, равную приблизительно 0,3-1 объемному расходу осветленной жидкой смеси в литрах в час.

Преимущество процесса, предлагаемого настоящим изобретением, заключается в том, что он позволяет осуществлять фильтрацию осветленной смеси с удельной скоростью потока, обеспечивающей пристеночную концентрацию менее чем на приблизительно 20%, менее чем на 15% или менее чем на 10% превосходящую концентрацию осадка на мембране, без существенной концентрационной поляризации.

Согласно более конкретному варианту осуществления настоящее изобретение направлено на интегрированный, непрерывный и стерильный процесс перфузионной ферментации, удаления макрочастиц и очистки/концентрации. Согласно одному из аспектов настоящего изобретения упомянутый процесс включает фильтрацию тканевой культуральной смеси посредством процесса отделения, с помощью которого осуществляется селективное отделение белка, представляющего интерес, от смеси в заданной рабочей точке ниже точки фазового перехода белка на зависящем от давления участке кривой поток-ТМР (трансмембранное давление), с получением стерильного, лишенного частиц, концентрированного и частично очищенного выделенного продукта, где удельная скорость потока в течение процесса выделения поддерживается по сути постоянной на уровне ниже точки фазового перехода упомянутого белка.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения упомянутый процесс представляет собой непрерывный процесс очистки белка, представляющего интерес, от гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси, включающий:

(a) получение посредством непрерывного процесса перфузионной ферментации гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси, содержащей белок, представляющий интерес;

(b) использование упомянутой тканевой культуральной жидкой смеси в непрерывном процессе удаления частиц, интегрированном с непрерывным процессом перфузионной ферментации;

(c) удаление крупнодисперсных загрязняющих примесей из тканевой культуральной жидкости в ходе непрерывного процесса удаления частиц с получением осветленной тканевой культуральной жидкости, содержащей белок, представляющий интерес;

(d) использование упомянутой осветленной тканевой культуральной жидкости в непрерывном процессе очистки, интегрированном с непрерывным процессом удаления частиц; и

(e) очистку белка, представляющего интерес, от осветленной тканевой культуральной жидкости в ходе непрерывного процесса очистки;

где удельная скорость потока упомянутой смеси в ходе непрерывного процесса перфузионной ферментации, непрерывного процесса удаления частиц и непрерывного процесса очистки поддерживается по сути на постоянном уровне.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения упомянутый процесс представляет собой полунепрерывный процесс очистки белка, представляющего интерес, от гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси, включающий:

(а) получение посредством непрерывного процесса перфузионной ферментации гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси, содержащей белок, представляющий интерес;

(b) использование упомянутой тканевой культуральной жидкой смеси в непрерывном процессе удаления частиц, интегрированном с системой непрерывной перфузионной ферментации;

(c) удаление крупнодисперсных загрязняющих примесей из тканевой культуральной жидкости в ходе непрерывного процесса удаления частиц с получением осветленной тканевой культуральной жидкости, содержащей белок, представляющий интерес;

(d) перемещение упомянутой осветленной тканевой культуральной жидкости в уравнительный резервуар, интегрированный в непрерывный процесс удаления частиц;

(e) периодическое использование осветленной тканевой культуральной жидкости в процессе очистки, интегрированном с уравнительным резервуаром; и

(f) очистку белка, представляющего интерес, от осветленной тканевой культуральной жидкости в системе очистки с получением стерильного, лишенного частиц, концентрированного и частично очищенного выделенного продукта, содержащего белок, представляющий интерес;

где удельная скорость потока упомянутой смеси в ходе непрерывного процесса перфузионной ферментации и непрерывного процесса удаления частиц поддерживается по сути на постоянном уровне.

Настоящее изобретение направлено также на аппарат для отделения белка, представляющего интерес, от гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси. Согласно одному из аспектов настоящего изобретения упомянутый аппарат включает в себя: (а) систему непрерывной перфузионной ферментации; (b) систему непрерывного удаления частиц, интегрированную с системой перфузионной ферментации; и (с) систему непрерывной очистки, интегрированную с системой удаления частиц, где упомянутый аппарат приспособлен для поддержания стерильных условий.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения упомянутый аппарат включает в себя: (а) систему непрерывной перфузионной ферментации; (b) систему непрерывного удаления частиц, интегрированную с системой перфузионной ферментации; и (с) систему периодической очистки, интегрированную с системой удаления частиц, где упомянутый аппарат приспособлен для поддержания стерильных условий.

Упомянутой системой очистки может быть, например, система ультрафильтрации или система конвективной адсорбции/десорбции либо любая другая система, способная обеспечить очистку или частичную очистку белка, представляющего интерес, от гетерогенной смеси в интегрированной, непрерывной или полунепрерывной стерильной системе, как описано в настоящем описании.

Процесс и аппарат, предлагаемые настоящим изобретением, приспособлены для обеспечения непрерывной обработки гетерогенной жидкой смеси, например клеточной культуральной жидкости, с по сути постоянной скоростью потока. Согласно конкретному аспекту настоящего изобретения процесс и аппарат, предлагаемые настоящим изобретением, приспособлены для обеспечения непрерывной обработки гетерогенной клеточной или тканевой культуральной жидкой смеси с по сути постоянной скоростью потока ниже точки фазового перехода на зависящем от давления участке кривой поток-ТМР (трансмембранное давление) в течение непрерывного периода времени и в ходе процесса очистки.

Эти и другие аспекты изобретения подробно описываются далее в приведенном ниже подробном описании изобретения.

Краткое описание фигур

Прилагаемые чертежи, которые включены в описание и составляют его часть, иллюстрируют варианты осуществления изобретения и, вместе с подробным описанием варианта изобретения, служат для объяснения принципов настоящего изобретения и его преимуществ.

Фиг.1: Схематическое изображение традиционного непрерывного процесса перфузии с последующими 3 отделенными в физическом и материально-техническом смысле стадиями процесса выделения (периодический сбор клеток, выросших в культуре, периодическое удаление частиц и периодическая концентрация/очистка).

Фиг.2: Схематическое изображение 2 вариантов осуществления предлагаемого настоящим изобретением устройства А для непрерывного, интегрированного и стерильного производства. Схематическое изображение варианта осуществления А1 представлено на левой стороне, а схематическое изображение варианта осуществления А2 представлено на правой стороне.

Фиг.3: Схематическое изображение 2 вариантов осуществления предлагаемого настоящим изобретением устройства В для непрерывного, интегрированного и стерильного производства. Схематическое изображение варианта осуществления В1 представлено на левой стороне, а схематическое изображение варианта осуществления В2 представлено на правой стороне.

Фиг.4: Схематическое изображение варианта осуществления предлагаемой настоящим изобретением интегрированной системы (100) непрерывного удаления частиц, являющейся элементом как предлагаемого настоящим изобретением устройства А, так и предлагаемого настоящим изобретением устройства В.

Фиг.5: Схематическое изображение дополнительных вариантов осуществления предлагаемого настоящим изобретением устройства А, которое объединяет многочисленные элементы для повышения либо общей производительности установки (A3), либо эффективности концентрации и отделения (А4).

Фиг.6: Схематическое изображение дополнительных вариантов осуществления предлагаемого настоящим изобретением устройства В.

Фиг.7: Дополнительный вариант осуществления соответствующих настоящему изобретению устройств, сочетающих последовательно расположенные элементы устройства А и устройства В для повышения общей эффективности концентрации и отделения.

Фиг.8: Сравнение примеров полных допустимых нагрузок в литрах на 10" (254,00 мм) фильтровальной капсулы для традиционного периодического процесса и варианта осуществления предлагаемого настоящим изобретением устройства и способа для непрерывного удаления частиц (интегрированный непрерывный процесс фильтрации), в которых применяются идентичные коммерческие фильтровальные капсулы. В качестве примера показан способ производства рекомбинантного фактора VIII системы свертывания крови.

Фиг.9: Пример кривой давление-поток (удельный поток растворенного вещества в LMH=литры/час/м2 в зависимости от трансмембранного давления) и определение рабочей точки. Окружность показывает типичную рабочую точку, которая будет регулироваться посредством трансмембранного давления для традиционных периодических процессов. Прямоугольник показывает предпочтительный рабочий участок, который будет регулироваться посредством насоса для перекачивания растворенного вещества, например, в способе применения предлагаемого настоящим изобретением устройства А.

Фиг.10: Пример распределения времени пребывания материала в установке и среднего времени пребывания материала в установке интегрированной системы (300) непрерывной ультрафильтрации, например, для способа применения предлагаемого настоящим изобретением устройства А. Определялись для одноразовой непрерывной системы с модулем 290 см2 (длиной 62,5 см), перекрестным потоком 120 LMH, потоком осадка 0,2 LMH, потоком растворенного вещества 2 LMH.

Фиг.11: Пример выделения rFVIII (рекомбинантный фактор VIII системы свертывания крови) из полученного в результате непрерывного процесса перфузионной ферментации продукта, не содержащего плазменного белка, с помощью варианта осуществления предлагаемого настоящим изобретением устройства А. Сравнение среднего выхода выделения предлагаемого настоящим изобретением непрерывного способа со средним выходом периодического выделения, включающее один стандартный разброс среднего квадратического отклонения. Для определения периодического выхода использовали 3 последовательных периодических процесса, в то время как для непрерывного процесса использовали 3 последовательные точки (дни).

Фиг.12: Примеры рабочих характеристик предлагаемого настоящим изобретением устройства А. Показаны трансмембранное давление и удельный поток интегрированной системы (300) непрерывной ультрафильтрации как функция продолжительности непрерывного процесса для 3 разных примеров. Треугольники =100 кДа мембрана, рекомбинантный фактор VIII системы свертывания крови (rFVIII); Квадраты = 10 кДа мембрана, рекомбинантный интерлейкин-2; Окружности =50 кДа мембрана, генно-инженерный гликопротеин (Mr>100 кДа). Все приведенные примеры относятся к полученному в результате непрерывного процесса перфузионной ферментации продукту, не содержащему плазменного белка.

Фиг.13: Пример долгосрочных рабочих характеристик предлагаемого настоящим изобретением устройства А, непосредственно применяемого в непрерывном процессе перфузионной ферментации линии клеток, коэкспрессирующей 2 белковых продукта (зеленый флуоресцентный белок GFP и IL-2SA (интерлейкин 2SA)). Показано трансмембранное давление и удельный поток предлагаемой настоящим изобретением системы (300) непрерывной ультрафильтрации как функция продолжительности непрерывного процесса. Применялась 10 кДа мембрана.

Фиг.14: Пример долгосрочных рабочих характеристик предлагаемого настоящим изобретением устройства А, непосредственно применяемого в непрерывном процессе перфузионной ферментации линии клеток, коэкспрессирующей 2 белковых продукта (зеленый флуоресцентный белок GFP и IL-2SA). Применялась 10 кДа мембрана. Коэффициент концентрации обоих белковых продуктов, определенный соответствующими анализами, и коэффициент объемной концентрации представлены в виде функции продолжительности непрерывного процесса.

Фиг.15: Пример рабочих характеристик предлагаемого настоящим изобретением устройства В. Выход продукта и перепад давления в течение около 100 последовательных циклов адсорбции/десорбции с конвективным адсорбером (целевой белок: генно-инженерный вариант фактора FVIII системы свертывания крови; конвективный адсорбер: коммерческий адсорбер, Mustang Q, фирма Pall Corporation).

Фиг.16: Пример рабочих характеристик предлагаемого настоящим изобретением устройства В. УФ-профиль и профиль электропроводности во время типичного цикла адсорбции/десорбции с конвективным адсорбером (целевой белок: генно-инженерный вариант фактора FVIII системы свертывания крови; конвективный адсорбер: коммерческий адсорбер, Mustang Q, фирма Pall Corporation).

Фиг.17: Пример рабочих характеристик предлагаемого настоящим изобретением устройства В. Показаны данные, относящиеся к SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) (окрашивание серебром) нагрузки = светленный раствор клеток, выросших в культуре, непрерывно выходящий из системы (100) удаления частиц и полунепрерывно вводимый в систему (400) конвективного адсорбера, и типичному элюату, получаемому в результате адсорбции/десорбции. (Целевой белок: генно-инженерный вариант фактора FVIII системы свертывания крови; конвективный адсорбер: коммерческий адсорбер, Mustang Q, фирма Pall Corporation). Элюат разбавляли до концентрации нагрузки перед проведением серии экспериментов на полиакриламидном геле.

Подробное описание изобретения

Определения

Терминология, использованная в этой заявке, за исключением четко оговоренных случаев, является стандартной для данной области техники. Приведенные ниже определения некоторых терминов представлены в настоящем описании для обеспечения ясности и определенности понимания значения формулы изобретения.

Единицы, приставки и условные обозначения могут быть выражены в форме, принятой для них в системе СИ. Числовые диапазоны, на которые ссылаются в данном описании, включают числа, определяющие диапазон, а также включают и поддерживают каждое целое число в пределах определенного диапазона. При отсутствии иных указаний, единственное число должно рассматриваться как обозначающее "по крайней мере один из". Названия разделов, использованные в данном описании, имеют исключительно организационное предназначение и не должны рассматриваться как ограничивающие описанный предмет изобретения. Все документы либо части документов, упомянутые в этой заявке, включая (но без ограничения) патенты, заявки на патент, статьи, книги и научные труды (монографии), включены сюда в полном объеме исключительно в качестве ссылки с любой целью.

Термин "осветление" и "осветленный" означает удаление макрочастиц из раствора, благодаря чему оставшийся раствор проходит через 0,2 мкм мембрану.

Термин "непрерывная перфузионная ферментация" относится к стационарной системе либо процессу ферментации, которая (который) функционирует без перерывов и в которой (котором) клетки либо микроорганизмы поддерживаются в культуре в экспоненциальной фазе роста посредством непрерывного добавления свежей питательной среды, которое уравновешивается удалением суспензии клеток из биореактора.

Термины "культивирование", "выращивание", "поддержание" и "размножение" являются синонимичными в том смысле, что клетки остаются жизнеспособными и способными к продуцированию потомства.

Термин "концентрация" в глагольной форме означает удаление воды из раствора, благодаря чему количество молекул, представляющих интерес, на единицу объема оставшегося раствора возрастает.

Термин "концентрационная поляризация" означает накопление задержанных молекул (слой геля) на поверхности мембраны, обусловленное сочетанием факторов: трансмембранное давление, скорость перекрестного потока, вязкость образца и концентрация растворенного вещества.

Термин "непрерывный" означает не прерываемый во времени, последовательности и/или функционировании в течение продолжительных периодов времени. В случае применения в отношении процессов ферментации, осветления и фильтрации в настоящем изобретении термин "непрерывный" означает, что процессы в физическом и материально-техническом отношении интегрированы, что обеспечивает возможность непрерывной работы в течение продолжительного периода времени, достаточного для получения стерильного, лишенного частиц, концентрированного и частично очищенного выделенного продукта, содержащего белок, представляющий интерес. Термин "непрерывный", в случае применения его в отношении процессов, соответствующих настоящему изобретению, следует также понимать как обозначающий то, что процесс не осуществляется периодическим способом либо непрерывным способом в буквальном смысле слова. Процессы, предлагаемые настоящим изобретением, могут осуществляться непрерывно, например в течение продолжительных периодов времени в пределах от 1 дня до нескольких месяцев без прерывания осуществления либо последовательности процессов. Согласно настоящему изобретению процессы осуществляются в течение непрерывного периода времени, длительность которого превышает 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней либо 7 дней, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель или 8 недель или же 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев либо более.

Термины "полунепрерывный" и "периодический" означают, что один или несколько процессов или элементов интегрированной системы осуществляются прерывистым или периодическим способом, в то время как другие процессы либо элементы интегрированной системы осуществляются непрерывным способом. Например, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения процесс очистки представляет собой процесс конвективной адсорбции/десорбции, который, как правило, требует адсорбции гетерогенной смеси адсорбирующим субстратом, следствием чего, в конечном счете, является насыщение субстрата, и который требует завершения процесса адсорбции и десорбции или выделения связанной фракции. Такой процесс по своему существу является периодическим, хотя и пригодным к интегрированию с последующими, являющимися непрерывными, процессами.

Термин "конвективная адсорбция/десорбция" означает хроматографический процесс, в ходе которого массоперенос осуществляется главным образом путем конвекции. Конвективная адсорбция/десорбция представляет собой процесс, в ходе которого часть смеси, содержащая молекулу, представляющую интерес, отделяется от другой части смеси посредством адсорбции одной части субстратом, с последующей десорбцией этой части из субстрата.

Термин "перекрестный поток" или "перекрестный поток жидкости" означает поток жидкости, проходящий по верхней части поверхности мембраны.

Термин "интегрированный", применяемый по отношению к многоэлементным системам и/или процессам, означает, что упомянутые системы и/или процессы интегрированы в физическом и материально-техническом отношении таким образом, что образуют единую систему, способную работать непрерывно. В контексте системы, предлагаемой настоящим изобретением, которая направлена на интегрированную непрерывную или полунепрерывную систему для производства лишенного частиц, концентрированного и частично очищенного белка, представляющего интерес, интегрированная система будет непосредственно объединять различные составные элементы способом, достаточным для поддержания стерильных условий между различными составными элементами системы.

Термины "питательные среды" (множественное число) и "питательная среда" (единственное число) являются синонимами и применяются в данном описании взаимозаменяемо, причем применение упомянутого термина в одной форме не подразумевает исключения другой формы.

Термин "смесь" означает гетерогенную комбинацию молекул и соединений, содержащих молекулу, представляющую интерес, например белок, и различные загрязняющие примеси. Предпочтительной смесью, предлагаемой настоящим изобретением, является тканевая культуральная жидкость, представляющая собой гетерогенную смесь белков, в том числе экзогенный белок, представляющий интерес, которую первоначально получают в результате непрерывного процесса перфузионной ферментации.

Термин "слой геля" означает микроскопически тонкий слой молекул, который может образовываться на верхней части мембраны. Он может оказывать негативное влияние на удерживание молекул вследствие закупорки поверхности мембраны и, тем самым, снижения потока фильтрата или же, в режиме работы с постоянным потоком, повышения трансмембранного давления.

Термин "молекула, представляющая интерес" означает частицы или молекулы других видов, которые должны отделяться от раствора или суспензии в текучую среду (например, в жидкость). Частицы либо молекулы, представляющие интерес, отделяются от текучей среды и, в большинстве случаев, от других частиц либо молекул в упомянутой текучей среде. Размером подлежащей отделению молекулы, представляющей интерес, будет определяться размер пор применяемой мембраны. Предпочтительно молекулы, представляющие интерес, имеют биологическое или биохимическое происхождение или же их получают посредством трансгенных или in vitro процессов и включают белки, пептиды, полипептиды, антитела либо фрагменты антител. Примерами происхождения потоков питательных веществ, которым отдают предпочтение, являются культура клеток млекопитающих и культура клеток микроорганизмов, например бактерий, грибов и дрожжей. Следует также обратить внимание на то, что видами, подлежащими удалению посредством фильтрации, являются нежелательные полипептиды, белки, компоненты клеток, ДНК, коллоиды, микоплазмы, эндотоксины, вирусы, углеводы и другие молекулы, представляющие биологический интерес, независимо от того, гликозилированы они или нет.

Термин "растворенное вещество" применяется как синоним термина "фильтрат".

Термин "выделенный продукт" означает лишенный частиц, концентрированный и частично очищенный продукт, содержащий белок, представляющий интерес. Выделенный продукт является продуктом, достигшим степени очистки и концентрации, сопоставимой со степенью, достигнутой посредством процесса ультрафильтрации или конвективной адсорбции/десорбции. Выделенный продукт не обязательно является гомогенным, однако он будет по сути очищенным по сравнению с исходной основной массой продукта, полученной посредством процесса ферментации.

Термин "удельная скорость потока" применяется взаимозаменяемо с термином "поток фильтрата", поскольку он относится к фильтрату. Удельная скорость потока осадка означает скорость потока осадка, нормализованную к применяемой площади мембраны.

Термин "по сути постоянный", применяемый в отношении потока, означает, что поток поддерживается в целом на постоянном уровне в течение значительного периода времени в ходе фильтрации.

Термин "тканевая культуральная жидкость" означает гетерогенную смесь компонентов, полученную из тканевой культуральной среды. Согласно предпочтительным аспектам настоящего изобретения тканевую культуральную жидкость получают посредством непрерывного процесса перфузионной ферментации. "Осветленная" тканевая культуральная жидкость представляет собой тканевую культуральную жидкость, которая была подвергнута предварительной фильтрации для удаления дебриса клеток и других крупных макромолекул.

Термин "трансмембранное давление" и его акроним "ТМР" означает среднее давление, прикладываемое к мембране со стороны подачи на сторону фильтрата. ТМР вычисляют по формуле TMP[бар]=[(PF+PR)/2]-Pf, где PF - давление подачи, PR - давление осадка, Pf - давление фильтрата.

Термин "выделение" означает количество молекул, представляющих интерес, которое может быть собрано и обработано. Выражается, как правило, в виде процента от исходного материала либо выхода.

Термин "осадок" означает часть образца, которая не прошла через мембрану, известную также как концентрат.

Термин "ультрафильтрация" означает форму фильтрации, при которой применяют микропористые либо полупроницаемые мембраны для предпочтительного отделения жидкостей либо ионов на основе различного размера либо молекулярной массы. Ультрафильтрацию, как правило, применяют для отделения посредством фильтрации молекул, молекулярная масса которых превышает приблизительно 10000 дальтон.

Настоящее изобретение направлено на интегрированный, непрерывный и стерильный процесс, включающий непрерывную перфузионную ферментацию, удаление частиц и очистку/концентрацию. Согласно одному из аспектов настоящего изобретения упомянутый процесс включает фильтрацию тканевой культуральной смеси посредством процесса отделения, с помощью которого осуществляется селективное отделение белка, представляющего интерес, от смеси в заданной рабочей точке ниже точки фазового перехода белка на зависящем от давления участке кривой поток-ТМР (трансмембранное давление), с получением стерильного, лишенного частиц, концентрированного и частично очищенного выделенного продукта, где удельная скорость потока в течение процесса выделения поддерживается по сути постоянной на уровне ниже точки фазового перехода упомянутого белка.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения упомянутый процесс представляет собой непрерывный процесс, включающий: (а) непрерывное получение посредством непрерывной перфузионной ферментации гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси, содержащей белок, представляющий интерес; (b) непрерывное использование упомянутой тканевой культуральной жидкой смеси в процессе удаления частиц, интегрированном с системой непрерывной перфузионной ферментации; (с) непрерывное удаление крупнодисперсных загрязняющих примесей из тканевой культуральной жидкости в ходе процесса удаления частиц с непрерывным получением осветленной тканевой культуральной жидкости, содержащей белок, представляющий интерес; (d) непрерывное использование упомянутой осветленной тканевой культуральной жидкости в процессе очистки, интегрированном с системой удаления частиц; и (е) постоянное отделение белка, представляющего интерес, из осветленной тканевой культуральной жидкости в системе очистки для постоянного получения стерильного, лишенного частиц, концентрированного и частично очищенного выделенного продукта, содержащего белок, представляющий интерес.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения упомянутый процесс представляет собой полунепрерывный процесс, включающий: (а) непрерывное получение посредством непрерывной перфузионной ферментации гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси, содержащей белок, представляющий интерес; (b) непрерывное использование упомянутой тканевой культуральной жидкой смеси в процессе удаления частиц, интегрированном с системой непрерывной перфузионной ферментации; (с) непрерывное удаление крупнодисперсных загрязняющих примесей из тканевой культуральной жидкости в ходе процесса удаления частиц с непрерывным получением осветленной тканевой культуральной жидкости, содержащей белок, представляющий интерес; (d) непрерывное перемещение упомянутой осветленной тканевой культуральной жидкости в уравнительный резервуар, интегрированный в процесс удаления частиц; (е) периодическое использование осветленной тканевой культуральной жидкости в процессе очистки, интегрированном с уравнительным резервуаром; и (f) отделение белка, представляющего интерес, из осветленной тканевой культуральной жидкости в системе очистки с получением стерильного, лишенного частиц, концентрированного и частично очищенного выделенного продукта, содержащего белок, представляющий интерес, где удельная скорость потока упомянутой смеси в ходе непрерывного процесса перфузионной ферментации и непрерывного процесса удаления частиц поддерживается по сути на постоянном уровне и в среднем равняется усредненной по времени пропускной способности интегрированного полунепрерывного процесса очистки.

Устройства для практического осуществления способов, соответствующих настоящему изобретению

Настоящее изобретение направлено также на аппарат для отделения белка, представляющего интерес, от гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси. В целом, аппарат включает в себя: (а) систему непрерывной перфузионной ферментации; (b) систему непрерывного удаления частиц, интегрированную с системой перфузионной ферментации; и (с) систему непрерывной очистки, интегрированную с системой удаления частиц, где упомянутый аппарат приспособлен для поддержания стерильных условий. Согласно другому аспекту настоящего изобретения аппарат включает в себя: (а) систему непрерывной перфузионной ферментации; (b) систему непрерывного удаления частиц, интегрированную с системой перфузионной ферментации; и (с) систему периодической очистки, интегрированную с системой удаления частиц, где упомянутый аппарат приспособлен для поддержания стерильных условий. Упомянутой системой очистки может быть, например, система ультрафильтрации либо система конвективной адсорбции/десорбции или любая другая система, способная очищать или частично очищать белок, представляющий интерес, от гетерогенной смеси в интегрированной непрерывной или полунепрерывной стерильной системе, описание которой представлено.

Процесс и аппарат, предлагаемые настоящим изобретением, приспособлены для обеспечения непрерывной обработки гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси с по сути постоянной скоростью потока. Согласно конкретному аспекту настоящего изобретения процесс и аппарат, предлагаемые настоящим изобретением, приспособлены для обеспечения непрерывной обработки гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси с по сути постоянной скоростью потока ниже точки фазового перехода белка на зависящем от давления участке кривой поток-ТМР (трансмембранное давление) в течение непрерывного периода времени и в ходе всего процесса очистки.

Согласно конкретным примерам осуществления настоящее изобретение предлагает два новых устройства (А, В), каждое из которых состоит из 3 разных, однако полностью интегрированных элементов, все из которых играют существенную роль и вместе образуют отличающуюся особой эффективностью рабочую площадку по непрерывному выделению белка, которая решает проблемы известного уровня техники, описанные выше.

Тремя различными элементами каждого устройства являются, во-первых, интегрированная система (100) непрерывного удаления частиц, во-вторых, стерильный уравнительный резервуар (200) и, в-третьих, интегрированная система концентрации/очистки (300, 400, соответственно). Все три элемента, таким образом, представляют собой новые разработанные устройства, и способы применения этих устройств подробно описаны ниже.

Для обеспечения интегрированной непрерывной или полунепрерывной концентрации/очистки белкового продукта предложенное настоящим изобретением устройство А (два варианта осуществления которого показаны на Фиг.2) включает в себя интегрированную систему (300) непрерывной стерильной ультрафильтрации, в то время как предложенное настоящим изобретением устройство В (2 варианта осуществления которого показаны на Фиг.3) включает интегрированную систему (400) полунепрерывной конвективной адсорбции/десорбции.

Устройства, предлагаемые настоящим изобретением, непосредственно интегрированы с одним или несколькими перфузионными ферментерами непрерывного действия и, таким образом, образуют новую интегрированную рабочую площадку непрерывного действия.

Устройство А

Интегрированная система (100) непрерывного удаления частиц

На Фиг.2 показаны 2 варианта осуществления устройства А, предлагаемого настоящим изобретением. Интегрированная система (100) непрерывного удаления частиц непосредственно подсоединена к стороне отбора выросших в культуре клеток системы (1) непрерывной перфузионной ферментации.

На Фиг.4 представлено более подробное схематическое изображение варианта осуществления предлагаемой настоящим изобретением интегрированной системы (100) непрерывного удаления частиц, в состав которой входит насос (101), манометр или датчик (107), соответственно, соединительная магистраль (102) и узел (103), включающий несколько агрегатов из последовательно расположенных фильтров. Все составные части соединены шлангами и/или трубами.

Насосом (101) является обычный перистальтический насос, обеспечивающий аккуратное перекачивание клеток, выросших в культуре, без каких-либо вращающихся частей или сальников, контактирующих со стерильным продуктом. Величина параметров насоса и трубопроводов подбирается таким образом, чтобы обеспечивалась необходимая скорость потока клеток, выросших в культуре, полученных из системы ферментации культуры клеток, что составляет до 15 объемов биореактора в день, например до 9,4 л/ч в случае ферментера емкостью 15 л и до 125 л/ч в случае ферментера емкостью 200 л.

Конструкцией манометра или датчика давления (107) предусматривается возможность их стерилизации посредством автоклавирования или облучения. В современных конструкциях применяются либо пьезорезистивный датчик многократного использования в корпусе из нержавеющей стали или манометр многократного использования из нержавеющей стали. Дополнительные усовершенствования, однако, могут включать применение одноразовых датчиков, которые могут легко стерилизоваться посредством облучения.

Согласно представленному варианту осуществления соединительная магистраль (102) выполнена из шлангов, где трубные зажимы (или клапаны) и соответствующие стерильные соединители обеспечивают возможность присоединения дополнительных узлов, включающих несколько агрегатов из последовательно расположенных фильтров, без нарушения стерильности системы. Предпочтительно диаметр трубопроводов подобран таким образом, чтобы обеспечивать линейные скорости жидкости в пределах приблизительно 2 м/с или менее при требуемом расходе, что позволяет избежать высокого противодавления и сдвигающих усилий. В другом представленном варианте осуществления вместо стерильных соединителей применяются специальные гибкие отрезки труб, которые могут свариваться с помощью промышленных трубных сварочных машин без нарушения стерильности. Такие отрезки труб изготовляются из полихлорвинила или других подходящих полимеров.

В состав узла (103), включающего несколько агрегатов из последовательно расположенных фильтров, входит как минимум два, предпочтительно большее количество идентичных агрегатов из последовательно расположенных фильтров (как показано на схематическом изображении), причем в любое данное время открытым является лишь один из агрегатов из последовательно расположенных фильтров, как показано в виде примера на Фиг.4 (105).

В состав каждого агрегата из последовательно расположенных фильтров входит как минимум один фильтр, предпочтительно последовательно соединенные один фильтр для предварительной очистки и один фильтр тонкой очистки (как показано на Фиг.4). В случае необходимости повышения пропускной способности для конкретного варианта осуществления каждый агрегат из последовательно расположенных фильтров (105, 106 и т.д.) сам по себе может также включать большое число параллельно соединенных фильтров или агрегатов из последовательно расположенных фильтров (не показано).

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, показанному на Фиг.4, второй агрегат из последовательно расположенных фильтров узла (106) перекрывается чувствительным к давлению разрывным диском или разрывным штифтом (104), соответственно. В процессе работы функция разрывного диска или разрывного штифта заключается в автоматическом открытии прохода на второй агрегат (107) из последовательно расположенных фильтров в случае, если давление на первом агрегате (105) из последовательно расположенных фильтров достигнет определенного предела, благодаря чему обеспечивается непрерывное продолжение процесса фильтрации. В системе, предлагаемой настоящим изобретением, применяются коммерчески доступные разрывные диски или разрывные штифты, которые, в противном случае, применяются для обеспечения безопасного сброса давления. В представленном варианте осуществления применяются оказавшиеся весьма полезными разрывные диски или разрывные штифты с предельным заданным давлением разрыва не более 16 фунт/дюйм2 (1,125 кг/см2). Возможен, однако, диапазон предельного заданного давления.

Каждый дополнительный агрегат из последовательно расположенных фильтров узла, включающего несколько агрегатов из последовательно расположенных фильтров, отделяется также ручным или автоматическим клапаном и другим разрывным диском или разрывным штифтом. После вступления в работу второго агрегата (106) из последовательно расположенных фильтров открывается клапан на следующий разрывной диск или разрывной штифт, соответственно, благодаря чему следующий агрегат из последовательно расположенных фильтров может выполнять роль резервного и т.д.

В альтернативном варианте осуществления применяются исключительно автоматические клапаны, и в процессе работы система управления приводит в действие клапаны под воздействием входного сигнала пьезорезистивного датчика (107) давления, который также может стерилизоваться посредством автоклавирования. Заявители установили, однако, что представленная конструкция, включающая разрывной диск или разрывной штифт, соответственно, обеспечивает возможность весьма устойчивой долгосрочной эксплуатации.

Номинальный допустимый предел фильтра тонкой очистки составляет как минимум 3 мкм или меньше, предпочтительно 0,45 мкм и более предпочтительно 0,2 мкм. Таким образом, агрегат (6) из последовательно расположенных фильтров, находящийся в работе, задерживает все остальные клетки, а также соответствующий дебрис клеток и другие частицы, следствием чего является получение свободного от частиц выходного потока (9) осветленной тканевой культуральной жидкости (cTCF).

Могут применяться различные коммерчески доступные фильтровальные материалы. В фильтрах современной конструкции применяются одноразовые фильтровальные капсулы, например капсулы для предварительной очистки Sartopure или Sartoclear (фирма Sartorius, Goettingen) и капсулы тонкой очистки Sartobran (фирма Sartorius, Goettingen), которые могут стерилизоваться посредством автоклавирования или облучения.

Как пример предложенного варианта осуществления устройства, предлагаемого настоящим изобретением, разработанного для расхода 1 л/мин, каждый агрегат (105, 106 и т.д.) из последовательно расположенных фильтров узла (103) включает 3 30" (761,99 мм) капсулы для предварительной очистки (Kleenpak Ultipleat, Pall Corp., номинальный допустимый предел 4,5 мкм, каждая площадью 0,75 м2), за которыми следует 3 20" (507,99 мм) капсулы тонкой очистки (Sartobran P, Sartorius, номинальный допустимый предел 0,45 мкм/0,2 мкм, каждая площадью 1,3 м2). Было установлено, что данный конкретный вариант осуществления является особо полезным для производственного получения рекомбинантного фактора VIII системы свертывания крови, а также генно-инженерного варианта FVIII, в том числе FVIII с делецией В-домена.

Заявители, однако, установили также, что в случае применения устройства и способа, соответствующих настоящему изобретению, эффективность удаления частиц с помощью разнообразных доступных фильтровальных материалов и конфигураций от различных производителей (фирмы Pall, Sartorius, Cuno) последовательно и значительно улучшается по сравнению с соответствующими традиционными периодическими процессами.

Таким образом, новые устройство и процесс, предлагаемые настоящим изобретением, будут также выгодными в случае применения с фильтрами новых типов и конфигураций, например с фильтрами таких типов, которые увеличивают доступную площадь фильтрования/мембрану, а также с фильтрами таких типов, которые обеспечивают образование перекрестных потоков либо иные возможности сведения образования отфильтрованного осадка до минимального уровня, например, посредством вибрации или вращения элементов фильтра.

В другом варианте осуществления процесса, предлагаемого настоящим изобретением, в состав узла (103), включающего несколько агрегатов из последовательно расположенных фильтров, входит всего один стерильный резервный агрегат из последовательно расположенных фильтров, замкнутый разрывным диском или разрывным штифтом, соответственно, но для работы в нем предусмотрено большое количество агрегатов из последовательно расположенных фильтров. Первый агрегат из последовательно расположенных фильтров упомянутого узла работает до завершения обработки определенного заранее установленного объема загрузки, после чего процесс переключается (вручную или автоматически) на следующий агрегат из последовательно расположенных фильтров упомянутого узла. Определенный объем загрузки устанавливается таким образом, что при нормальных рабочих условиях предел давления разрывного диска или разрывного штифта не превышается. Если же, однако, в процессе фильтрации давление возрастает больше обычного, например, вследствие необычно низкой фильтруемости клеток, выросших в культуре, резервный агрегат из последовательно расположенных фильтров вновь обеспечивает непрерывную постоянную фильтрацию, открываясь сразу же после превышения установленного давления. После открытия резервного агрегата из последовательно расположенных фильтров фильтрация переключается на другой агрегат из последовательно расположенных фильтров упомянутого узла, и другой резервный агрегат из последовательно расположенных фильтров с разрывным диском или разрывным штифтом устанавливается без нарушения стерильности системы.

Специалистам в данной области техники хорошо известно, что для поддержания как затрат на фильтрацию, так и времени обработки в случае периодических процессов удаления частиц на минимальном уровне величина параметров периодически действующих агрегатов из последовательно расположенных фильтров должна подбираться таким образом, чтобы площадь фильтрования, необходимая для обеспечения требуемой абсолютной скорости потока (в л/ч) и максимального давления, была, по возможности, максимально низкой. Требуемая абсолютная скорость потока, в свою очередь, должна быть достаточно высокой для обеспечения приемлемого времени обработки партии необходимого объема. Это, по своей сути, обусловливает необходимость высокой удельной скорости потока (в л/ч/м2 площади фильтрования).

В противоположность сопоставимой оптимизированной системе периодического фильтрования устройство, предложенное настоящим изобретением, в конструктивном отношении предназначено для в несколько раз более низкой удельной скорости потока, которая удерживается на постоянном уровне (в л/ч/м2 установленной площади фильтрования), благодаря чему абсолютная скорость потока равна скорости потока выросших в культуре клеток, полученных посредством процесса непрерывной ферментации.

Заявители неожиданно установили, что объем, который может пропускаться через фильтр при таких низких удельных скоростях потока, оказывается непропорционально более высоким, нежели при скоростях потока, установленных в периодических процессах.

Важно отметить, что в традиционных периодических процессах выделения такие низкие удельные скорости потока недостижимы вследствие либо предельных площадей фильтрования (и, следовательно, затрат), либо слишком низкой абсолютной скорости потока. Подобное обусловлено главным образом тем, что оборудование для периодического удаления частиц большую часть времени бездействует, в то время как осуществляется сбор выросших в культуре клеток для следующей партии. Более того, поразительно непропорциональное увеличение достижимой пропускной способности фильтра в способе, предложенном настоящим изобретением, обеспечивает возможность значительного снижения степени износа фильтра и, тем самым, издержек производства.

Уравнительный резервуар (200)

Выходное отверстие интегрированной системы непрерывного удаления частиц непосредственно и постоянно подсоединено к уравнительному резервуару (201), как показано на Фиг.2. Этот уравнительный резервуар является стерильным резервуаром, например одноразовым мягким резервуаром или резервуаром из нержавеющей стали с как минимум одним входным отверстием и одним выходным отверстием, причем последнее предпочтительно расположено в донной части резервуара. Могут применяться резервуары самых разных размеров и конструкций. Однако величина параметров уравнительного резервуара предпочтительно подбирается таким образом, чтобы он был небольшим по сравнению с объемной пропускной способностью системы для поддержания времени пребывания продукта в резервуаре на минимальном уровне, т.е. в течение менее 24 ч, предпочтительно в течение менее 8 ч и еще более предпочтительно в течение менее 4 ч.

Заявители обнаружили, что такое короткое время пребывания продукта в системе, возможное исключительно благодаря устройствам, предложенным настоящим изобретением, обеспечивает значительное увеличение выхода нестойких по своему существу белковых продуктов, что решает одну из проблем известного уровня техники.

В некоторых вариантах осуществления устройств, соответствующих настоящему изобретению, уравнительный резервуар размещается на измерительной месдозе или динамометрическом элементе (202), как показано в случае устройства В1 и В2 на Фиг.3. Эта измерительная месдоза или динамометрический элемент обеспечивает подачу весового сигнала на компьютеризованную систему управления (не показана).

В дополнение к этому, в варианте осуществления устройств (В2), соответствующих настоящему изобретению, буферный резервуар (204) подключается к уравнительному резервуару через перистальтический насос (203). В рабочих условиях подобное устройство применяют для регулирования свойств лишенного частиц потока клеток, выросших в культуре, например электропроводности (ионной силы) или рН, посредством добавления соответствующего буфера или разбавителя. В подобном случае применяют факультативную систему (205) смешивания и датчики для контролирования необходимого условия (206), например, рН или электропроводности. В предлагаемом конструктивном решении применяется магнитная мешалка; применяться, однако, могут также другие системы смешивания, например вибраторы или пульсирующие устройства.

Интегрированная система (300) непрерывной концентрации/очистки

В состав устройства А, 2 варианта осуществления которого представлены на Фиг.2, входит интегрированная система (300) непрерывной стерильной ультрафильтрации. В состав вариантов осуществления системы непрерывной стерильной ультрафильтрации входят рециркуляционный насос (301) и рециркуляционный обводной трубопровод (306), один или несколько стерильных ультрафильтрационных модулей (303) с перекрестным потоком, насос (305) для перекачивания растворенного вещества, стерильный приемный сосуд (307) растворенного вещества на измерительной месдозе или динамометрическом элементе (309) и насос (311) для перекачивания осадка. В дополнение к этому, в ее состав входят контрольно-измерительные приборы в виде входного манометра или датчика (302), манометра растворенного вещества или датчика (304), выходного манометра или датчика (308), а также рециркуляционный расходомер (310). В процессе работы выходное отверстие (312) системы выдает непрерывный поток концентрированного и частично очищенного белкового продукта, который можно непрерывно собирать, замораживать или подвергать дополнительной обработке.

В состав варианта осуществления А2, предлагаемого настоящим изобретением, дополнительно входит резервуар (314) для буфера или разбавителя, перистальтический насос (313) для дополнительной подачи буфера/разбавителя, а также проточные датчики для контролирования состояния концентрата в рециркуляционном обводном трубопроводе, например датчики (315, 316) рН и электропроводности. В процессе работы подобное устройство применяется для регулирования свойств лишенного частиц потока клеток, выросших в культуре, например электропроводности (ионной силы) или рН, посредством добавления соответствующего буфера или разбавителя. Это устройство может применяться также для добавления стабилизаторов белка. Несмотря на то что в варианте осуществления А2, предложенном настоящим изобретением, сам рециркуляционный обводной трубопровод выполняет роль смесительной камеры, дополнительное модифицирование может также осуществляться с помощью уравнительного резервуара, который показан для устройства В (вариант осуществления В2), в состав которого входят элементы (203, 204, 205, 206), что будет обсуждаться ниже в этом описании (смотри описание устройства В).

В состав вариантов осуществления устройства, предлагаемого настоящим изобретением, также входит программируемая система управления и регистрации данных, которая регистрирует входящие сигналы данных от контрольно-измерительных приборов (например, однако, без ограничения, давление, скорость потока, массу резервуара, рН, электропроводность) и регулирует частоту вращения насосов согласно заранее разработанному алгоритму управления.

Все насосы (301, 305, 311, 313) являются перистальтическими насосами, что обеспечивает возможность перекачивания потоков соответствующих жидкостей без каких-либо вращающихся частей или сальников, контактирующих с потоком стерильного продукта. Заявители установили, что подобный вариант является предпочтительным для обеспечения надежной длительной работы в стерильных условиях. В принципе, однако, могут использоваться стерильные насосы других конструкций. Величина параметров рециркуляционного насоса (301) и соответствующих трубопроводов подбирается таким образом, чтобы обеспечивалось надежное регулирование необходимой скорости перекрестных потоков в пределах 80-800 л/ч на м2 площади установленной мембраны, в зависимости от характеристик массопереноса применяемого ультрафильтрационного модуля. Величина параметров насоса для перекачивания растворенного вещества задается таким образом, чтобы обеспечивалась надежная и точная регулировка удельного потока растворенного вещества в пределах 90-99% от скорости потока выросших в культуре клеток, получаемых в результате непрерывной перфузионной ферментации. Величина параметров насоса для перекачивания осадка задается таким образом, чтобы обеспечивалась надежная и точная регулировка потока осадка вещества в пределах 1-10% от скорости потока выросших в культуре клеток, получаемых в результате непрерывной перфузионной ферментации.

Герметизированные ультрафильтрационные модули (303) применяются для обеспечения надежной стерильной работы и стерилизуются посредством автоклавирования или облучения. Оптимальную полосу пропускания номинальной молекулярной массы выбирают исходя из молекулярной массы белкового продукта, представляющего интерес, и она должна быть подтверждена стандартными экспериментами, известными специалистам в данной области техники. Разнообразные мембранные материалы, например полиэфирсульфон, гидрофилизированный полиэфирсульфон или регенерированная целлюлоза, могут применяться до тех пор, пока мембранный модуль в целом может стерилизоваться посредством облучения и/или автоклавирования без повреждения мембраны. Ожидается, что гидрофильные материалы могут повысить эффективность благодаря присущей им меньшей склонности к загрязнению.

Заявители обнаружили, что устройство А исключительно эффективно в том случае, если суммарная площадь установленной ультрафильтрационной мембраны в квадратных метрах находится в пределах 0,1-2 объемных скоростей потока выросших в культуре клеток, получаемых в результате непрерывной перфузионной ферментации, в л/ч. Например, в случае скорости потока выросших в культуре клеток, получаемых в результате непрерывной перфузионной ферментации, составляющей 1 л/ч, суммарная площадь установленной мембраны должна составлять 0,1-2 м2. Заявители установили, что устройство А действует еще эффективнее, если площадь установленной ультрафильтрационной мембраны в квадратных метрах находится в пределах 0,3-1 объемной скорости потока выросших в культуре клеток, получаемых в результате непрерывной перфузионной ферментации, в л/ч.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения применяются коммерчески доступные "одноразовые" половолоконные мембранные модули (фирма GE Healthcare, бывшая Amersham Biosciences). Могут, однако, применяться герметизированные мембраны и модули различных конструкций, например спиральные модули, герметизированные кассеты или капсулы с повышенным массопереносом вследствие возникновения побочного течения (например, вихревого потока), вращающиеся элементы (например, ротационные фильтры дискового типа) или вибрационные фильтры. Ожидается, что особо выгодным в устройствах, соответствующих настоящему изобретению, будет применение герметизированных ультрафильтрационных кассет, поскольку они обеспечивают высокие коэффициенты массопереноса при относительно низкой требуемой скорости перекрестного потока, что ведет к снижению производительности насоса с одновременным снижением сложности системы и затрат на капитальные вложения.

Устройство, предложенное настоящим изобретением, обеспечивает не только непрерывную, но и стерильную в истинном смысле этого слова работу, в противоположность работе лишь в асептических условиях. Заявителям удалось добиться этого посредством конструирования всех элементов системы, контактирующих с продуктом, таким образом, чтобы они выдерживали не только очистку, но также и стерилизацию посредством автоклавирования, обработки острым паром in situ либо гамма-облучения. В представленных вариантах осуществления одноразовые герметизированные модули применяются для непрерывного удаления (100) частиц, а также для непрерывной ультрафильтрации (300). Перистальтические насосы применяются во избежание любого контактирования продукта с вращающимися элементами и механическими сальниками. Более того, в представленных вариантах осуществления вместо твердых труб применяются одноразовые узлы, в состав которых входят гибкие трубопроводы и мягкие резервуары. Одноразовые элементы, контактирующие с продуктом (например, шланги, мягкие резервуары, модули), или группы элементов предварительно собираются и стерилизуются как единое целое, упрощая тем самым запуск и эксплуатацию. Системы сконструированы таким образом (например, вытяжной шкаф с ламинарным потоком), чтобы степень любого потенциального контакта стерильной системы с окружающей средой, например для отбора проб, замены мягких резервуаров либо контрольно-измерительных приборов, сводилась до минимального уровня. В представленных вариантах осуществления настоящего устройства распределительные магистрали сконструированы с резервированием для обеспечения переключения с одного стерильного элемента (например, мягкого резервуара для приема продукта) на следующий без вскрытия. Дополнительная замена шлангов, модулей или мягких резервуаров предпочтительно осуществляется с помощью стерильных трубных сварочных машин, а не стерильных соединителей.

Другие дополнительные варианты осуществления устройств, соответствующих настоящему изобретению, могут также включать такие элементы, как резервуары из нержавеющей стали, корпуса фильтров либо шланги, которые могут стерилизоваться на месте, самостоятельно либо в сочетании с одноразовыми элементами до тех пор, пока обеспечивается надежность и стерильность долговременной эксплуатации.

Дополнительные варианты осуществления устройства А, предлагаемого настоящим изобретением, предназначены для обработки материала, поступающего из многочисленных ферментеров, на более крупных производственных установках (A3). Пример в схематическом изображении представлен на Фиг.5. Дополнительные варианты осуществления предназначены для повышения суммарного коэффициента концентрации и эффективности отделения посредством последовательного объединения 2 ступеней системы (300) непрерывной ультрафильтрации (А4, схематически представлен на Фиг.5).

Описание способа применения устройства А

Непрерывный процесс перфузионной ферментации осуществляют в течение продолжительного периода времени (одна кампания), продолжительность которого, как правило, составляет от 2 недель до 6 месяцев или более. Тканевую культуральную жидкость (TCF), содержащую продукт, клетки и дебрис клеток, непрерывно обрабатывают с помощью устройства А. Получают поток стерильного, лишенного частиц, концентрированного и частично очищенного продукта ("выделенный продукт"), который непрерывно выходит из упомянутого устройства через его выходное отверстие (312). С помощью насоса (101) системы (100) непрерывного стерильного удаления частиц, клетки, выросшие в культуре, непрерывно прокачиваются через фильтровальный узел (103) с необходимой скоростью Qh потока выросших в культуре клеток, получаемых в результате непрерывной перфузионной ферментации.

Выходной поток системы непрерывной фильтрации, т.е. осветленная тканевая культуральная жидкость (cTCF), непрерывно поступает в уравнительный резервуар (201). cTCF из уравнительного резервуара подвергается непрерывной обработке системой (300) непрерывной стерильной ультрафильтрации при скорости потока, равной скорости потока, выходящего из системы непрерывной перфузионной ферментации. Вследствие небольшого размера уравнительного резервуара по сравнению с установленными скоростями потока среднее время пребывания продукта в резервуаре удерживается на минимальном уровне, т.е. менее 12 ч, предпочтительно менее 4 ч и еще более предпочтительно менее 2 ч.

Соответствующий перекрестный поток и, тем самым, массоперенос регулируются в ультрафильтрационном модуле с помощью рециркуляционного насоса (301). Скорость потока осадка регулируется и контролируется с помощью насоса (311) для перекачивания осадка, благодаря чему обеспечивается постоянная и непрерывная скорость Qi потока концентрированного выделенного продукта, выходящего из устройства А через его выходное отверстие (312). Насос (305) для перекачивания растворенного вещества применяется для регулирования и контролирования скорости Qp потока растворенного вещества, которое непрерывно отбирается на стороне выхода растворенного вещества ультрафильтрационного модуля(-ей) и которое состоит из воды и компонентов раствора, которые достаточно малы для прохождения через ультрафильтрационную мембрану (например, соли, небольшие белки).

Скорость потока растворенного вещества (Qp) и осадка/выделенного продукта (Qi) тщательно регулируется и контролируется для того, чтобы она соответствовала скорости Qh потока выросших в культуре клеток, получаемых в результате непрерывной перфузионной ферментации, таким образом, чтобы:

Qp+Qi=Qh.

Одновременно с этим, скорость потоков регулируется и контролируется таким образом, чтобы достигался необходимый коэффициент концентрации cf посредством удовлетворения условия:

Qi=1/cf·Qh.

Например, для получения необходимого коэффициента (10 в выделенном продукте) концентрации продукта по сравнению с начальной концентрацией клеток, выросших в культуре, Qi выдерживают на уровне Qi=1/10·Qh с помощью насоса (311) для перекачивания осадка/выделенного продукта, в то время как Qp выдерживают на уровне Qp=0,9·Qh с помощью насоса (305) для перекачивания растворенного вещества.

Поскольку скорость выходного потока контролируется с помощью насосов (305) и (311), система ультрафильтрации автоматически отбирает поток Qp+Qi из небольшого уравнительного резервуара (201).

В случае применения варианта осуществления А2 (смотри правую часть Фиг.2) стерильный поток буфера или воды для инъекций из резервуара 314 непрерывно добавляют в систему непрерывной ультрафильтрации с постоянной скоростью Qb потока с помощью насоса (313) для дополнительной подачи буфера. Таким образом, состояние выделенного продукта может свободно и непрерывно регулироваться, например, с точки зрения ионной силы, рН, добавления стабилизаторов и т.п. Скорость потоков, таким образом, контролируется на уровне

Qp+Qi=Qh+Qb.

В дополнение к этому, соотношения скоростей потоков могут подбираться таким образом, чтобы был получен необходимый коэффициент концентрации cf посредством удовлетворения условия Qi=1/cf·(Qh+Qb). Согласно альтернативному варианту этот процесс может применяться лишь для изменения условий (например, рН, электропроводности) посредством установления Qi=Qh+Qb.

Новый способ применения устройства А отличается также от периодических процессов ультрафильтрации (известный уровень техники) в отношении заданной рабочей точки самой ультрафильтрации. Традиционные периодические процессы ультрафильтрации рассчитаны на определенную пропускную способность через небольшую площадь мембраны в течение короткого периода времени. Периодический процесс ультрафильтрации, таким образом, осуществляется, как правило, в точке фазового перехода зависящего от давления участка в участок регулирования массопереноса (смотри Фиг.9). Следствием этого является получение желаемо высокого начального удельного потока, который, однако, значительно и быстро (в течение периода времени продолжительностью от секунд до минут) снижается, поскольку концентрационная поляризация приводит к быстрому возникновению осмотического противодавления и образованию ограничивающего слоя геля (вторичная мембрана). Следствием такой высокой пристеночной концентрации макромолекул также является повышенная адсорбция соединений к внутренней и наружной поверхности мембраны, т.е. загрязнение мембраны. Это загрязнение со временем дополнительно снижает поток растворенного вещества.

Заявители неожиданно обнаружили, что в случае устройства А во много раз более высокая суммарная допустимая нагрузка на площадь установленной ультрафильтрационной мембраны достигается при работе на нижнем конце кривой зависимости потока от давления (смотри Фиг.9).

Нормализованная пристеночная концентрация cwall полностью задержанного компонента может описываться следующим образом:

где J - удельный поток растворенного вещества в л/ч/м2;

kd - коэффициент массопереноса в л/ч/м2;

Cbulk - концентрация компонента в основной массе раствора.

Подобно периодической ультрафильтрации непрерывная ультрафильтрация осуществляется при оптимизированном коэффициенте массопереноса для сведения концентрационной поляризации до минимального уровня. Однако, в противоположность периодической ультрафильтрации, заявители устанавливают поток J растворенного вещества на низком конце кривой зависимости потока от давления (смотри Фиг.9). Вследствие экспоненциальной зависимости пристеночная концентрация cwall на поверхности мембраны, таким образом, оказывается значительно ниже, чем она была бы в случае периодической ультрафильтрации. Например, представленный вариант осуществления способа, предлагаемого настоящим изобретением, устанавливает целевой удельный поток растворенного вещества на уровне приблизительно 1/10 достижимого коэффициента массопереноса, устанавливая тем самым пристеночную концентрацию, лишь на 10% превышающую установленную концентрацию основного объема (или осадка).

В приведенной ниже Таблице 1 показан пример способа применения устройства А (вариант осуществления А1) для непрерывного выделения белкового продукта из ферментера, находящегося в процессе разработки:

Таблица 1
Пример способа применения представленного варианта осуществления устройства А для непрерывного выделения белкового продукта при непрерывной перфузионной ферментации
Рабочий параметр Цель Скорость Qh потока выросших в культуре клеток, получаемых в результате непрерывной перфузионной ферментации (контролируется насосом 101) 5 л/ч (120 л/день) Скорость Qp потока растворенного вещества (контролируется насосом 305) 4,75 л/ч Скорость Qi потока осадка (выделенного продукта) (контролируется насосом 311) 0,25 л/ч Удельный поток J растворенного вещества 2 л/ч/м2 Коэффициент концентрации cf Двадцатикратный

Для каждой отдельной молекулы продукта критерии долговечности могут определяться для установки стерильной непрерывной ультрафильтрации, например, на основе трансмембранного давления. После превышения предела трансмембранного давления установка непрерывной стерильной ультрафильтрации заменяется другой идентичной установкой без нарушения целостности и стерильности системы. Это может осуществляться по аналогии с установкой непрерывной стерильной ультрафильтрации посредством применения либо распределительных магистралей и стерильных соединителей, либо посредством применения одноразовых шлангов и стерильных трубных сварочных машин.

Устройство В

Интегрированная система (100) непрерывного удаления частиц

На Фиг.3 показаны 2 варианта осуществления устройства В, предлагаемого настоящим изобретением. Интегрированная система (100) непрерывного удаления частиц непосредственно подсоединена к стороне отбора выросших в культуре клеток системы (1) непрерывной перфузионной ферментации. Эта часть устройства В идентична устройству А (смотри приведенное выше подробное описание устройства А и Фиг.4).

Уравнительный резервуар (200)

Выходное отверстие интегрированной системы непрерывного удаления частиц непосредственно и постоянно подсоединено к уравнительному резервуару (201), как показано на Фиг.3. Этот уравнительный резервуар является стерильным резервуаром, например одноразовым мягким резервуаром или резервуаром из нержавеющей стали с как минимум одним входным отверстием и одним выходным отверстием, причем последнее предпочтительно расположено в донной части резервуара. Могут применяться резервуары самых разных размеров и конструкций. Однако величина параметров уравнительного резервуара предпочтительно подбирается таким образом, чтобы он был небольшим по сравнению с объемной пропускной способностью системы для поддержания времени пребывания продукта в резервуаре на минимальном уровне, т.е. в течение менее 26 ч, предпочтительно в течение менее 12 ч и еще более предпочтительно в течение менее 4 ч.

В устройстве В уравнительный резервуар размещается на измерительной месдозе или динамометрическом элементе (202), как показано для вариантов осуществления В1 и В2 на Фиг.3. Эта измерительная месдоза или динамометрический элемент обеспечивает подачу весового сигнала на компьютеризованную систему управления (не показана).

В дополнение к этому, в варианте осуществления устройства (В2), предлагаемого настоящим изобретением, буферный резервуар (204) подключается к уравнительному резервуару через перистальтический насос (203). В рабочих условиях подобное устройство применяют для регулирования свойств лишенного частиц потока клеток, выросших в культуре, например электропроводности (ионной силы) или рН, посредством добавления компонентов для модифицирования свойств осветленной тканевой культуральной жидкости, полученной из системы удаления частиц, например соответствующего буфера или разбавителя либо соответствующего стабилизатора белка. В подобном случае, в состав представленного варианта осуществления также входит система (205) смешивания и датчики для контролирования необходимого условия (206), например рН или электропроводности. В предлагаемом варианте осуществления применяется магнитная мешалка; однако применяться могут также другие системы смешивания, например вибраторы или пульсирующие устройства.

В другом варианте осуществления устройства, предлагаемого настоящим изобретением, применяются 2 уравнительных резервуара. В любой данный момент один уравнительный резервуар непосредственно подсоединен к системе (100) непрерывного удаления частиц, принимая, тем самым, осветленную жидкость, в то время как другой уравнительный резервуар подсоединен к системе (400) полунепрерывной концентрации/очистки, поставляя, вследствие этого, поток на цикл конвективной адсорбции/десорбции. Переключение между уравнительными резервуарами осуществляется посредством системы управления, используя массу принимающего резервуара для включения переключателя после достижения упомянутым резервуаром максимального объема заполнения.

Интегрированная система (400) полунепрерывной концентрации/очистки

В состав устройства В, 2 варианта осуществления которого представлены на Фиг.3, входит интегрированная система (400) полунепрерывной конвективной адсорбции/десорбции.

Интегрированная система полунепрерывной конвективной адсорбции/десорбции конструируется и величина ее параметров задается таким образом, чтобы скорость потока нагружения (Qload) этой системы была значительно выше скорости потока выросших в культуре клеток, получаемых в результате процесса непрерывной перфузионной ферментации, и процесса непрерывной фильтрации (Qh), т.е. Qload>>Qh.

В состав вариантов осуществления системы (400) полунепрерывной концентрации/очистки входит загрузочный насос (401), многопутевой клапанный блок (402) и несколько буферных резервуаров (404), трехходовой клапан (403), соединенный со стерильным резервуаром (413) для приема отходов и одним или несколькими конвективными адсорберными модулями (406), входной и выходной манометры или датчики (405, 408), дополнительные контрольно-измерительные приборы, например УФ-датчик (409), датчики (409, 410) рН и электропроводности, расходомер (412), а также еще один трехходовой клапан (407), также соединенный с резервуаром (413) для приема отходов и выходным отверстием (414) элюата продукта.

В состав вариантов осуществления устройства, предлагаемого настоящим изобретением, также входит программируемая система управления и регистрации данных (не показана), которая регистрирует входящие сигналы данных от контрольно-измерительных приборов (например, однако, без ограничения, давление, УФ излучение, рН, электропроводность, скорость потока, массу уравнительного резервуара) и управляет автоматизированными клапанами и насосом в соответствии с запрограммированными методиками.

Загрузочный насос (401) предпочтительно является перистальтическим насосом для избежания непосредственного контактирования продукта или стерильных буферов с какими-либо уплотнителями либо механическими частями. Заявители установили, что подобный вариант является предпочтительным для обеспечения надежной длительной работы в стерильных условиях. В принципе, однако, могут использоваться стерильные насосы других конструкций. Величина параметров загрузочного насоса подбирается в зависимости от объема установленной матрицы конвективного адсорбера (406) для обеспечения надежного регулирования в пределах как минимум 12 объемов матрицы/мин. Например, в одном из представленных вариантов осуществления применяются мембранные адсорберные капсулы Mustang (фирма Pall Corp.), объем матрицы которых составляет приблизительно 0,3 л. Следовательно, величина параметров загрузочного насоса задается таким образом, чтобы обеспечить скорость потока нагружения до 3,6 л/мин.

Функция многопутевого клапанного блока (402) заключается в обеспечении переключения между нагрузкой, содержащей продукт, получаемой из уравнительного резервуара (201), и каждым из стерильных буферов и осветляющих растворов из резервуаров (404), содержащих стерильный буфер. В представленных вариантах осуществления устройства В применяется ряд автоматических пружинных клапанов, которые пережимают снаружи шланг, подсоединенный к каждому резервуару с буфером для перекрытия и открытия каждой линии. Заявители открыли, что эти пружинные клапаны обеспечивают особо выгодное решение для устройства В, поскольку они позволяют избежать какого бы то ни было контакта с продуктом и, вследствие этого, не нуждаются в очистке или стерилизации. Могут, однако, применяться разнообразные коммерчески доступные клапаны, пригодные для стерильной обработки и известные специалистам в данной области техники, например мембранные клапаны.

В представленном варианте осуществления трехходовые клапаны (403, 407) представляют собой пригодные для автоклавирования мембранные клапаны. В принципе, однако, могут использоваться разнообразные коммерчески доступные клапаны, пригодные для стерильной обработки, в том числе, например, пружинные клапаны.

Конвективный адсорберный модуль (406) содержит хроматографическую матрицу с преимущественно конвективным массопереносом продукта на адсорбционную поверхность и, в противоположность традиционной хроматографии, стерилизуется перед работой посредством автоклавирования, обработки острым паром или облучением. Преимущественно конвективный массоперенос позволяет, в противоположность традиционной хроматографии в уплотненном слое, работать с очень короткими циклами адсорбции/элюирования/регенерации, что и используется заявителями в устройстве, предложенном настоящим изобретением, для осуществления полунепрерывной работы.

Согласно представленному варианту осуществления устройства, предлагаемого настоящим изобретением, в состав конвективного адсорбера (406) входит одна или несколько коммерчески доступных мембранных адсорбционных капсул с ионообменной химией (Mustang, Pall Corporation или Sartobind, Sartorius). В упомянутом устройстве, однако, может применяться другой мембранный адсорбционный материал и другие конфигурации, а также новые конвективные матрицы, например монолитные матрицы, поскольку, в противоположность традиционной хроматографии, исключена набивка смолой и матрицы, как правило, могут герметизироваться в виде готовых к применению модулей.

Более того, химические взаимодействия других видов, включая конвективные аффинные матрицы, в состав которых входят специфические связывающие продукт лиганды, также обеспечивают уникально высокую эффективность устройства, предлагаемого настоящим изобретением.

Согласно одному из вариантов осуществления устройства, предлагаемого настоящим изобретением, многочисленные конвективные адсорбционные модули применяются в устройстве в виде узла, включающего несколько параллельно соединенных агрегатов из последовательно расположенных конвективных адсорберов, подобно системе (100) непрерывного удаления частиц. Весь узел со всеми входящими в его состав агрегатами из последовательно расположенных конвективных адсорберов стерилизуется как единое целое, благодаря чему в процессе работы обеспечивается возможность переключения с одного агрегата из последовательно расположенных адсорберов на другой в случае, если у первого закончился период нормальной эксплуатации, что определяется, например, заранее установленными критериями, например противодавлением при загружении или максимальным количеством выполненных рабочих циклов. В состав каждого агрегата из последовательно расположенных адсорберов входит один либо несколько параллельно и/или последовательно соединенных конвективных адсорбционных модулей для увеличения вяжущей способности и/или повышения пропускной способности.

Важно подчеркнуть, что устройство, предложенное настоящим изобретением, обеспечивает не только непрерывную, но и стерильную, в истинном смысле этого слова, работу, в противоположность работе лишь в асептических условиях. Заявителям удалось добиться этого посредством конструирования всех элементов системы, контактирующих с продуктом, таким образом, чтобы они выдерживали не только очистку, но также и стерилизацию посредством автоклавирования, обработки острым паром in situ либо гамма-облучения. В представленных вариантах осуществления одноразовые герметизированные модули применяются для непрерывного удаления частиц (100), а также для полунепрерывной стерильной конвективной адсорбции/десорбции (400). Перистальтические насосы применяются во избежание любого контактирования продукта с вращающимися элементами и механическими сальниками. Более того, в представленных вариантах осуществления вместо твердых труб применяются одноразовые узлы, в состав которых входят гибкие трубопроводы и мягкие резервуары. Одноразовые элементы, контактирующие с продуктом (например, шланги, мягкие резервуары, модули), или группы элементов предварительно собираются и стерилизуются как единое целое, упрощая, тем самым, запуск и эксплуатацию. Системы сконструированы таким образом (например, вытяжной шкаф с ламинарным потоком), чтобы степень любого потенциального контакта стерильной системы с окружающей средой, например, для отбора проб, замены мягких резервуаров либо контрольно-измерительных приборов, сводилась до минимального уровня. В представленных вариантах осуществления настоящего устройства распределительные магистрали сконструированы с резервированием для обеспечения переключения с одного стерильного элемента (например, мягкого резервуара для приема продукта) на следующий без вскрытия. Дополнительная замена шлангов, модулей или мягких резервуаров предпочтительно осуществляется с помощью стерильных трубных сварочных машин, а не стерильных соединителей.

Другие дополнительные варианты осуществления устройств, соответствующих настоящему изобретению, могут также включают такие элементы, как резервуары из нержавеющей стали, корпуса фильтров либо шланги, которые могут стерилизоваться на месте, самостоятельно либо в сочетании с одноразовыми элементами до тех пор, пока обеспечивается надежность и стерильность долговременной эксплуатации.

Дополнительные варианты осуществления устройства В, предлагаемого настоящим изобретением, предназначены для обработки материала, поступающего из многочисленных ферментеров, на более крупных производственных установках (В3). Пример в схематическом изображении представлен на Фиг.6. Дополнительные варианты осуществления устройства В, предлагаемого настоящим изобретением, предназначены для повышения суммарного коэффициента концентрации и эффективности отделения посредством последовательного соединения многочисленных систем (400) конвективной адсорбции/десорбции с находящимися между ними соответствующими стерильными уравнительными резервуарами (200) (см. Фиг.6, В4).

Разрабатываются другие дополнительные варианты осуществления устройств, соответствующих настоящему изобретению, для повышения суммарного коэффициента концентрации и эффективности отделения посредством последовательного соединения системы (300) непрерывной ультрафильтрации с системой (400) полунепрерывной конвективной адсорбции/десорбции через дополнительный уравнительный резервуар. Схематическое изображение примера варианта осуществления представлено на Фиг.7.

Описание способа применения устройства В

Непрерывный процесс перфузионной ферментации осуществляют в течение продолжительного периода времени (одна кампания), продолжительность которого, как правило, составляет от 2 недель до 6 месяцев или более. Тканевую культуральную жидкость (TCF), содержащую продукт, клетки и дебрис клеток, непрерывно обрабатывают с помощью устройства В. Получают поток стерильного, лишенного частиц, концентрированного и частично очищенного продукта ("выделенный продукт"), который непрерывно выходит из упомянутого устройства через его выходное отверстие (414). С помощью насоса (101) системы (100) непрерывного стерильного удаления частиц клетки, выросшие в культуре, непрерывно прокачиваются через фильтровальный узел (103) с необходимой скоростью Qh потока выросших в культуре клеток, получаемых в результате непрерывной перфузионной ферментации.

Выходной поток системы непрерывной фильтрации, т.е. осветленная тканевая культуральная жидкость (cTCF), непрерывно поступает в уравнительный резервуар (201).

Как только уравнительный резервуар оказывается наполненным до заранее определенного уровня, сигнал массы или уровня автоматически запускает цикл адсорбции/десорбции интегрированной системы стерильной полунепрерывной концентрации/очистки. Материал, собранный в уравнительном резервуаре, быстро загружается в адсорбционную установку, т.е. в течение 4 ч, предпочтительно в течение 2 ч и еще более предпочтительно в течение 1 ч или менее, с опорожнением, тем самым, уравнительного резервуара.

В представленных вариантах осуществления, приведенных на Фиг.3, сбор лишенной частиц осветленной тканевой культуральной жидкости (cTCF) продолжается все время, в один и тот же самый уравнительный резервуар небольшого размера. Объем в уравнительном резервуаре небольшого размера, таким образом, колеблется между минимальной и максимальной величиной. В другом варианте осуществления, описание которого было приведено выше, сбор поочередно переключается между 2 идентичными уравнительными резервуарами.

В то время как cTCF продолжает собираться в уравнительном резервуаре, на загруженном адсорбере осуществляется ряд стадий заранее определенной методики хроматографии, предназначенных для десорбирования целевого продукта в концентрированной, очищенной форме и подготовки адсорбера к следующему циклу нагружения. Полный цикл, таким образом, включает нагружение, промывку, элюирование, регенерацию и повторное уравновешивание, причем каждая из упомянутых операций осуществляется с одним или несколькими соответствующими буферами.

Поскольку скорость потока в процессе осуществления упомянутых стадий может быть высокой вследствие природы конвективных адсорберов, общая продолжительность цикла удерживается на низком уровне, т.е. составляет менее 6 ч, предпочтительно менее 3 ч и еще более предпочтительно менее 1,5 ч. Таким образом, интегрированная система сконструирована таким образом, что адсорберная установка готова к следующему циклу нагружения до того, как уравнительный резервуар вновь оказывается наполненным, что обеспечивает возможность полунепрерывной работы.

В приведенной ниже Таблице 2 показан пример способа применения представленного варианта осуществления устройства В, предлагаемого настоящим изобретением, для выделения рекомбинантного человеческого фактора VIII системы свертывания крови (представлены данные крупномасштабного производства). Упомянутый способ оказался исключительно выгодным. Выход и производительность каждого цикла адсорбции/десорбции были подобны соответствующим показателям периодического процесса, причем суммарный выход продукта возрос более чем на 10% вследствие непродолжительного времени пребывания продукта в установке и, тем самым, сведения до минимума его распада. Тот же самый способ оказался весьма полезным для выделения генно-инженерных вариантов FVIII, в том числе FVIII с делецией В-домена, который существенно отличается от непроцессированного FVIII по размеру и другим характеристикам. Надеются, что этот способ окажется также пригодным для получения других белков и биомолекул.

Сама по себе методика хроматографии (химия и последовательность применения буферов, объемы нагружения и скорость потоков) может быть разработана в экспериментах по периодической хроматографии для каждой отдельной молекулы и в последующем легко преобразовываться для применения с вариантами осуществления устройства, предлагаемого настоящим изобретением.

Таблица 2
Пример способа применения представленного варианта осуществления устройства В для непрерывного выделения FVIII и вариантов FVIII при непрерывной перфузионной ферментации
Параметр Цель Скорость Qh потока клеток, выросших в культуре при непрерывном процессе перфузионной ферментации [л/день] 2000 Уравнительный резервуар: максимальный рабочий объем Vs [л] 200 Объем нагружения [объемы матрицы] 600 Объем адсорбционной матрицы, установленной в устройстве В [мл] 260 Скорость потока нагружения [объемы матрицы/мин] 12 Объем нагружения [л] 156 Время нагружения [мин] 50 Суммарное время хроматографии [ч] (методика, включающая нагружение, промывку, элюирование и несколько стадий регенерации/повторного уравновешивания) 1,5 Время простоя адсорбера/цикл [ч] 0,372 Циклы/период времени продолжительностью 24 ч 12,8 Время сбора [ч] 1,872 Приблизительное среднее время пребывания материала в устройстве (время сбора + время нагружения + время элюирования) 2,7

Для каждой отдельной молекулы продукта критерии долговечности могут определяться для конвективной адсорбционной установки, например, на основе давления в процессе нагружения или выделения. Как правило, определяется и оценивается максимальное количество циклов nmах. После того как адсорбционная установка была использована при полунепрерывной работе в течение nmax циклов, ее заменяют другой идентичной адсорбционной установкой без нарушения целостности и стерильности системы. В представленных вариантах осуществления это осуществляется по аналогии с установкой непрерывной стерильной фильтрации посредством применения либо распределительных магистралей и стерильных соединителей, либо посредством применения одноразовых шлангов и стерильных трубных сварочных машин.

В случае применения варианта осуществления устройства, предлагаемого настоящим изобретением, показанного на Фиг.3 с правой стороны, стерильный поток буфера, раствора для регулирования рН, стабилизирующего раствора или воды для инъекций добавляется постоянно или периодически из стерильного резервуара (204) с помощью насоса (203) для дополнительного введения буфера. Таким образом, состояние cTCF может свободно регулироваться, например, с точки зрения ионной силы, рН, добавления стабилизаторов и т.п.

Преимущества изобретения

Устройства, предлагаемые настоящим изобретением, и соответствующие способы применения упомянутых устройств решают проблемы традиционных процессов выделения, описанные выше (смотри общие предпосылки создания изобретения).

Во всех вариантах осуществления устройств А и В и соответствующих способах применения упомянутых устройств время пребывания продукта в потенциально вредной среде минимизировано, что существенно повышает выход и качество нестойких по своему существу сложных биологических продуктов. Производительность установки может быть увеличена, а стоимость продукта снижена.

Более того, устройства и соответствующие способы ликвидируют необходимость в холодильных емкостях или охлаждаемых резервуарах значительных размеров для промежуточного хранения больших объемов клеток, выросших в культуре, что снижает затраты на капитальные вложения в установку и позволяет полностью реализовать преимущества перфузионной ферментации, заключающиеся в компактности и мобильности.

Варианты осуществления устройств, соответствующих настоящему изобретению, и соответствующие способы снижают издержки на рабочую силу по сравнению с традиционной трудоемкой периодической обработкой благодаря высокой степени автоматизации. Новые устройства предоставляют возможность непрерывной работы 24 ч в сутки, в течение продолжительных периодов времени, с достижением максимальной производительности и коэффициента использования оборудования.

Кроме того, устройства, предлагаемые настоящим изобретением, ликвидируют материально-технические трудности на установках, включающих один или несколько ферментеров. Варианты осуществления могут обрабатывать материал, получаемый посредством одного или нескольких процессов перфузионной ферментации.

Важно отметить, что поскольку новые устройства и способы дают возможность осуществления работы в полностью стерильных условиях, ликвидируются проблемы, связанные с микробной загрязнением и эндотоксинами, чего нельзя было достичь путем асептической обработки с последующей простой стерильной фильтрацией.

В дополнение к этому, устройства, предлагаемые настоящим изобретением, позволяют избежать или минимизировать потребность в оценке степени очистки благодаря применению одноразовых деталей. Благодаря уникальным характеристикам устройств и способов, соответствующих настоящему изобретению, каждый одноразовый модуль, а также шланги, мягкие резервуары и узлы могут использоваться в течение продолжительного периода времени (на протяжение всей кампании), что резко снижает издержки и существенно повышает привлекательность утилизации одноразовых деталей с экономической точки зрения.

Представленные варианты осуществления устройств А и В, предлагаемые настоящим изобретением, и соответствующие способы оказались весьма пригодными для производства рекомбинантного фактора VTII системы свертывания крови, а также генно-инженерных вариантов FVIII, включая, но без ограничения, FVIII с делецией В-домена. Предполагается, однако, что настоящее изобретение окажется одинаково пригодным для получения других белков и биологических молекул, в частности сложных и по своей сути нестойких белков, например, фактора VII, фактора IX, фактора Х и т.п.

Преимущества устройства А и соответствующего способа

На Фиг.8 показан пример неожиданного увеличения пропускной способности фильтра, которое было обнаружено заявителями для интегрированной системы (100) непрерывного удаления частиц.

На Фиг.10 показано типичное распределение времени пребывания материала в установке и среднее время пребывания продукта в системе (300) непрерывной ультрафильтрации варианта осуществления устройства А, предлагаемого настоящим изобретением, определенное посредством адсорбции УФ-излучения осадком при 280 нм с модельным белком в типичных условиях. Как показано, среднее время пребывания продукта в системе составляет приблизительно всего 40 мин. Таким образом, суммарное время пребывания продукта в представленном варианте осуществления устройства А, от трубопровода для отведения из ферментера клеток, выросших в культуре, до конечного концентрированного осадка (изолята), составляет 1-2 ч или меньше. Это меньше 1/10 времени пребывания материала (28 ч или более) в традиционном периодическом процессе выделения, в котором продукт (клетки, выросшие в культуре) собирают в течение как минимум 24 ч (до нескольких дней), после чего продукт обрабатывают, как правило, в течение по крайней мере 4-10 ч.

На Фиг.11 показано сравнение полученного суммарного выхода рекомбинантного фактора системы свертывания крови (rFVIII) в случае непрерывной перфузионной ферментации без плазменного белка как в случае традиционного процесса периодического выделения (периодическая фильтрация плюс периодическая ультрафильтрация), так и в случае применения устройства А, предлагаемого настоящим изобретением, и соответствующего способа. Как показано на упомянутой фигуре, непрерывный процесс, предложенный настоящим изобретением, обеспечивает значительно более высокий выход продукта, следствием чего может быть увеличение производственных мощностей и снижение издержек производства.

В случае применения устройства А согласно способу, соответствующему настоящему изобретению, трансмембранное давление интегрированной непрерывной ультрафильтрации со временем возрастает, в то время как удельный поток на мембране (в л/ч/м2/бар) снижается при постоянной объемной пропускной способности. Это характерно для всех ультрафильтрационных процессов и обусловлено такими эффектами, как концентрационная поляризация, образование слоя геля и загрязнение. Однако, в противоположность периодической ультрафильтрации, как видно из примера, приведенного на Фиг.12, изменения давления и удельного потока в случае устройства А происходят крайне медленно, обеспечивая возможность непрерывной работы в течение недель, прежде чем возникнет необходимость очистки либо замены мембран. В дополнение к этому степень изменения и эффективность работы совершенно нечувствительны к производимому продукту либо линии клеток, используемой при непрерывной перфузионной ферментации (Фиг.12). Таким образом, устройство А, предложенное настоящим изобретением, и соответствующий способ также идеально подходят в качестве общей основы для быстрого производства различных белков, поскольку они надежно и предсказуемо работают с различными целевыми белками от разных линий клеток.

Неожиданно заявители установили, что отрицательные эффекты образования слоя геля и загрязнения в случае устройства А сводятся фактически до такого низкого уровня, что может быть обработан гораздо больший объем на площадь установленного ультрафильтра, прежде чем возникнет необходимость в очистке либо замене фильтров. Фиг.13 демонстрирует надежную долгосрочную работоспособность устройства А, предлагаемого настоящим изобретением. Приблизительно через 25 дней трансмембранное давление неожиданно проявило тенденцию к стабилизации в квазистационарном состоянии, что позволяло предположить еще более высокую долгосрочную работоспособность. На 27 день скорость потока осадка была целенаправленно удвоена для проверки эффекта более высокой пропускной способности. Через 34 дня произвели короткую промывку с помощью стерильного 0,5 М раствора NaOH не вскрывая системы, тем самым поддерживая целостность и стерильность всей системы в целом. После этого трансмембранное давление вновь стабилизировалось или по крайней мере увеличивалось, однако с чрезвычайно низкой скоростью. После 70 дней непрерывной стерильной работы скорость рециркуляционного потока была целенаправленно снижена наполовину для проверки влияния на работоспособность системы. Как и ожидалось, трансмембранное давление начало увеличиваться с несколько большей скоростью вследствие сниженного массопереноса, что, таким образом, повысило пристеночную концентрацию на поверхности мембраны. Однако прежде чем система была отключена, она успешно и надежно отработала 95 дней. На 1 м2 площади мембраны в целом приходилось около 4500 обработанных литров с минимальными затратами ручного труда (лишь ежедневный отбор проб). Для сравнения, оптимизированный традиционный процесс периодической ультрафильтрации при таком же варианте применения имеет в 45 раз меньшую допустимую нагрузку (приблизительно 100 л/м2) и требует как минимум полного времени работы 1-2 операторов.

Удивление вызывает также и то, что избирательность устройства А, предлагаемого настоящим изобретением, в частности его интегрированной системы (300) непрерывной ультрафильтрации, оказалась значительно выше избирательности традиционного периодического процесса. Специалистам в данной области техники хорошо известно, что в процессе традиционной периодической ультрафильтрации из задержанных макромолекул на начальной стадии процесса образуется вторичная мембрана (слой геля), которая уменьшает полосу пропускания средней молекулярной массы. В результате задерживается как целевая молекула, так и загрязняющие белки меньшего размера, что делает практически невозможной значительную одновременную очистку. Таким образом, в случае традиционной периодической ультрафильтрации редко оказывается возможным разделение белков, имеющих коэффициент различия с точки зрения их молекулярной массы, меньший 10. Однако, как показано на Фиг.14, в случае интегрированного процесса непрерывной ультрафильтрации, предлагаемого настоящим изобретением, можно отрегулировать условия для эффективного разделения IL-2SA (приблизительно 16 кДа) и зеленого флуоресцентного белка GFP (27-30 кДа). Вот эта эффективность разделения более высокая, чем ожидалось, и дает возможность для осуществления одновременной концентрации и очистки.

Преимущества устройства В и соответствующего способа

Фиг.15 иллюстрирует рабочие характеристики устройства В, предлагаемого настоящим изобретением. Используя коммерческий конвективный адсорбер (Mustang Q, Pall Corporation, 15-слойный модуль), осуществили около 100 последовательных циклов адсорбции/десорбции, концентрируя и очищая рекомбинантный вариант FVIII из культуры, полученной посредством процесса непрерывной перфузионной ферментации. Средний полученный выход составлял приблизительно 95% (разброс является следствием аналитических различий), в то время как давление оставалось относительно постоянным в течение всего количества осуществленных циклов. Таким образом, может быть точно указано, что до замены адсорберной установки может быть осуществлено по крайней мере 100 последовательных циклов.

Как было показано в подробном описании способа применения устройства В, предлагаемого настоящим изобретением, суммарное среднее время пребывания продукта в представленном варианте осуществления составляет менее 3 ч, прежде чем он оказывается элюированным в концентрированной, очищенной и стабилизированной форме в соответствующем буфере. Это значительно меньше времени пребывания в традиционном периодическом процессе выделения (более 24 ч), осуществляемом один раз в день, следствием чего является значительно более высокий выход лабильных по своему существу белковых продуктов. В представленном варианте осуществления, описание которого приведено выше, в течение дня осуществляется приблизительно 13 циклов, что в контексте Фиг.15 означает, что адсорберный узел полунепрерывного действия будет нуждаться в замене лишь каждый 7-8 дней, что осуществляется без нарушения стерильности и непрерывности работы.

На Фиг.16 показан пример УФ-профиля и профиля электропроводности в течение одного типичного цикла адсорбции/десорбции и регенерации устройства В. Видно, что может загружаться более 450 объемов адсорбера (CVs), в то время как продукт элюируется в виде очень острого пика. Содержание загрязняющих примесей в потоке существенно снижается в течение стадии нагружения, а также в течение промывки и очистки (фаза регенерации).

Фиг.17 иллюстрирует эффективность очистки процесса, предлагаемого настоящим изобретением, который включает полунепрерывную конвективную адсорбцию/десорбцию. В качестве примера показан электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия изолята варианта FVIII. Как видно, фракции элюата, включающие 95% загруженного варианта FVIII (что определяется отдельным анализом активности), содержат значительно меньше белка, нежели нагрузка, и являются, таким образом, очищенными. В элюате (изоляте) не наблюдается дополнительных полос разложения, что указывает на великолепное качество продукта.

Подводя итог, устройство В, предложенное настоящим изобретением, может обеспечивать подобную же эффективность очистки, что и сопоставимые периодические процессы, одновременно с этим сводя до минимального уровня потери выхода нестойких по своему существу белковых продуктов, а также проблемы с качеством продукта вследствие сведения времени пребывания продукта в установке до минимального уровня. Одновременно с этим резко снижаются издержки на рабочую силу вследствие высокой степени автоматизации, присущей процессу, соответствующему настоящему изобретению, требующему минимального вмешательства оператора.

Несмотря на то что настоящее изобретение было описано с некоторыми подробностями в качестве иллюстрации и примера с целью понимания, специалистам в этой области техники будет очевидна возможность практического внесения определенных изменений и модификаций. Следовательно, описание и примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения, который определяется прилагаемой формулой изобретения.

Соответственно, понятно и то, что варианты осуществления настоящего изобретения, приведенные в описании и предлагающие усовершенствованный способ фильтрации для получения высокого выхода молекулы, представляющей интерес, из данного потока питательных веществ, выполняют исключительно иллюстративную роль применения принципов настоящего изобретения. Из приведенного описания будет очевидна возможность внесения изменений в форму, способы применения и варианты использования раскрытых элементов изобретения без отступления от сущности изобретения либо объема прилагаемой формулы изобретения.

Похожие патенты RU2390526C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОТЪЕМНО-ДОЛИВНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ С ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТЬЮ КЛЕТОК 2015
  • Лаустсен Мадс
RU2710967C2
СПОСОБ НЕПРЕРЫВНОГО СОКРАЩАЮЩЕГО МИКРООРГАНИЗМЫ ПОЛУЧЕНИЯ И/ИЛИ ОБРАБОТКИ ПРОДУКТА 2016
  • Майзер Бенджамин
  • Шван Петер
  • Лобеданн Мартин
  • Мерле Фолкер
RU2721535C2
СПОСОБ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ КОНТАМИНАЦИИ СИСТЕМЫ 2015
  • Сноу Роберт
RU2713126C2
СПОСОБ ПОЭТАПНОГО УДЕРЖИВАНИЯ И ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ МОДУЛЬ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАКРОМОЛЕКУЛ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 2019
  • Чжу, Джо
  • Ли, Цзыцай
  • Сюй, Шуйцин
  • Кан, Стивен, З.
  • Линь, Цзюнь
  • Ван, Цзяньцин
  • Дуань, Цинтан
  • Ань, Минянь
  • Ли, Миньчжу
RU2769767C1
СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО БЕЛКА 2020
  • Сноу, Роберт
RU2790876C2
СИСТЕМА ПЕРФУЗИОННОЙ ФИЛЬТРАЦИИ ДЛЯ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК 2022
  • Никулин Артем Евгеньевич
  • Поплавка Николай Николаевич
  • Макаров Дмитрий Вячеславович
  • Беневоленский Максим Сергеевич
RU2800874C1
СПОСОБ ПЕРФУЗИОННОЙ ФИЛЬТРАЦИИ ДЛЯ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК 2022
  • Никулин Артем Евгеньевич
  • Поплавка Николай Николаевич
  • Макаров Дмитрий Вячеславович
  • Беневоленский Максим Сергеевич
RU2794425C1
ПОЛНОСТЬЮ ПРОТОЧНЫЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ 2019
  • Дют, Дидье
  • Эме, Селин
  • Мот, Бенуа
  • Пеццини, Жером
RU2792435C2
ВЫСУШЕННАЯ РАСПЫЛЕНИЕМ 3-ФУКОЗИЛЛАКТОЗА 2018
  • Йенневайн, Штефан
RU2810298C2
ОЧИСТКА ОЛИГОСАХАРИДОВ ОТ ФЕРМЕНТАЦИОННОГО БУЛЬОНА ПОСРЕДСТВОМ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ФИЛЬТРАЦИИ 2020
  • Йенневайн, Штефан
  • Кран, Ян Хенрик
  • Хельфрих, Маркус
RU2808729C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 390 526 C2

Реферат патента 2010 года ПРОЦЕСС И АППАРАТ ДЛЯ ОТДЕЛЕНИЯ БЕЛКА, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕГО ИНТЕРЕС, ОТ ГЕТЕРОГЕННОЙ ТКАНЕВОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОЙ СМЕСИ И ЕГО ОЧИСТКИ

Настоящее изобретение относится к процессу и аппарату для отделения и очистки белка, представляющего интерес, в потоке тканевой культуральной жидкости, получаемой в ходе непрерывного процесса перфузионной ферментации. Аппарат, предложенный настоящим изобретением, в котором поддерживают стерильные условия, в целом включает систему непрерывной перфузионной ферментации, систему непрерывного удаления частиц, интегрированную с системой перфузионной ферментации и приспособленную для непрерывного приема тканевой культуральной жидкости из нее и непрерывного производства осветленной тканевой культуральной жидкости, и систему непрерывной очистки, интегрированную с системой удаления частиц и приспособленную для непрерывного приема осветленной тканевой культуральной жидкости из нее и постоянного производства выделенного продукта, содержащего белок, представляющий интерес, причем система непрерывной очистки является системой ультрафильтрации. Процесс включает получение в ходе непрерывного процесса перфузионной ферментации гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси, содержащей белок, представляющий интерес, непрерывное удаление из нее крупнодисперсных загрязняющих примесей с получением осветленной тканевой культуральной жидкости, содержащей белок, представляющий интерес, и очистку белка от осветленной культуральной жидкости ультрафильтрацией, при этом удельная скорость потока тканевой культуральной жидкой смеси в ходе непрерывного процесса перфузионной ферментации, непрерывного удаления загрязняющих примесей непрерывной очистки поддерживается на постоянном уровне. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 17 ил., 2 табл.

Формула изобретения RU 2 390 526 C2

1. Процесс отделения белка, представляющего интерес, от гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси, и его очистки, включающий:
(a) получение посредством непрерывного процесса перфузионной ферментации гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси, содержащей белок, представляющий интерес;
(b) использование упомянутой тканевой культуральной жидкой смеси в непрерывном процессе удаления частиц, интегрированном с непрерывным процессом перфузионной ферментации;
(c) удаление крупнодисперсных загрязняющих примесей из тканевой культуральной жидкости в ходе непрерывного процесса удаления частиц с получением осветленной тканевой культуральной жидкости, содержащей белок, представляющий интерес;
(d) использование упомянутой осветленной тканевой культуральной жидкости в непрерывном процессе очистки ультрафильтрацией, интегрированном с процессом удаления частиц; и
(e) очистку белка, представляющего интерес, от осветленной тканевой культуральной жидкости в ходе непрерывного процесса очистки;
где удельная скорость потока упомянутой смеси в ходе непрерывного процесса перфузионной ферментации, непрерывного процесса удаления частиц и непрерывного процесса очистки поддерживается по сути на постоянном уровне.

2. Процесс по п.1, дополнительно включающий фильтрацию осветленной тканевой культуральной смеси с удельной скоростью потока, обеспечивающей пристеночную концентрацию, менее чем на приблизительно 20% превосходящую концентрацию осадка на мембране.

3. Процесс по п.1, дополнительно включающий фильтрацию осветленной тканевой культуральной смеси с удельной скоростью потока, обеспечивающей пристеночную концентрацию, менее чем на приблизительно 15% превосходящую концентрацию осадка на мембране.

4. Процесс по п.1, дополнительно включающий фильтрацию осветленной тканевой культуральной смеси с удельной скоростью потока, обеспечивающей пристеночную концентрацию, менее чем на приблизительно 10% превосходящую концентрацию осадка на мембране.

5. Процесс по п.1, дополнительно включающий фильтрацию осветленной тканевой культуральной смеси через ультрафильтрационную мембрану, имеющую площадь в квадратных метрах, равную приблизительно 0,1-2 объемным расходам продукта, получаемого посредством процесса перфузионной ферментации, в л/ч.

6. Процесс по п.1, дополнительно включающий фильтрацию осветленной тканевой культуральной смеси через ультрафильтрационную мембрану, имеющую площадь в квадратных метрах, равную приблизительно 0,3-1 объемному расходу продукта, получаемого посредством процесса перфузионной ферментации в литрах в час.

7. Аппарат для отделения белка, представляющего интерес, от гетерогенной тканевой культуральной жидкой смеси, и его очистки, включающий:
(а) систему непрерывной перфузионной ферментации, приспособленную для непрерывного производства тканевой культуральной жидкости, содержащей белок, представляющий интерес, с по сути постоянной объемной скоростью потока;
(b) систему непрерывного удаления частиц, интегрированную с системой перфузионной ферментации и приспособленную для непрерывного приема тканевой культуральной жидкости из нее и непрерывного производства осветленной тканевой культуральной жидкости; и
(c) систему непрерывной очистки, интегрированную с системой удаления частиц и приспособленную для непрерывного приема осветленной тканевой культуральной жидкости из нее и постоянного производства выделенного продукта, содержащего белок, представляющий интерес, причем эта система непрерывной очистки является системой ультрафильтрации;
причем упомянутый аппарат поддерживают в стерильных условиях.

8. Аппарат по п.7, отличающийся тем, что система ультрафильтрации включает ультрафильтрационную мембрану, имеющую площадь в квадратных метрах, равную приблизительно 0,1-2 объемным расходам продукта, получаемого посредством процесса перфузионной ферментации, в л/ч.

9. Аппарат по п.7, отличающийся тем, что система ультрафильтрации включает ультрафильтрационную мембрану, имеющую площадь в квадратных метрах, равную приблизительно 0,3-1 объемному расходу продукта, получаемого посредством процесса перфузионной ферментации, в л/ч.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2010 года RU2390526C2

Способ приготовления мыла 1923
  • Петров Г.С.
  • Таланцев З.М.
SU2004A1
US 6350382 B1, 26.02.2002
Способ приготовления мыла 1923
  • Петров Г.С.
  • Таланцев З.М.
SU2004A1
US 5490937 A, 13.02.1996.

RU 2 390 526 C2

Авторы

Фогель Енс

Джованнини Роберто

Константинов Константин Б.

Нгуень Хуон

У Пенг

Даты

2010-05-27Публикация

2005-09-30Подача