БЕЛКИ ЛИЗИСА КЛЕТОК VERO, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА ДЛЯ КЛЕТОК VERO, СОДЕРЖАЩИЙ БЕЛКИ ЛИЗИСА Российский патент 2014 года по МПК A61K38/00 G01N33/50 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к белкам, полученным при лизисе клеток Vero, получению таких белков и включающему их набору для определения белков из клеток Vero.

Уровень техники

Клетки Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) служат материалом для производства вакцин. Их характеризует четко определенный генетический фон и стабильный кариотип, клетки свободны от загрязнения экзогенными агентами и подходят для крупномасштабного культивирования и производства с использованием биореакторов, обеспечивающих гомогенность продукта и безопасность при массовом производстве вакцины. На протяжении многих лет было успешно разработано и утверждено для продажи на мировом рынке множество различных вакцин, полученных с использованием клеток Vero, включая очищенную вакцину против бешенства для человека, инактивированную (очищенную) вакцину против полиомиелита (IPV), вакцину против японского энцефалита (инактивированную) (JE). Вакцины могут быть произведены с использованием клеток Vero двумя способами. Первый способ заключается в культивировании секретируемого вируса, который после завершения репликации секретируется во внеклеточную культуральную среду. Культивирование секретируемого вируса при использовании клеточной среды для репликации вируса может привести к повреждению структуры клеток-хозяев, что может привести к гибели клеток и их разрушению, что ведет к высвобождению большого количества структурных белков клеток-хозяев в культуральную среду. В связи с необходимостью клеточного роста и размножения клетки Vero высвобождают большое количество факторов роста в культуральную среду в процессе роста и размножения. Второй способ заключается в культивировании не секретируемого вируса, который при культивировании в клетках-хозяевах остается внутри клеток-хозяев после завершения репликации вируса. Во время культивирования не секретируемого вируса, такого как вирус гепатита А, в клетках-хозяевах репликация вируса не будет вызывать патологические изменения. Таким образом, для высвобождения вирусов клетки должны быть разрушены физическими или химическими методами. В собранном растворе вируса в дополнение к клеточным факторам роста, выделенным во время клеточного роста и размножения, присутствует большое количество выделенных при лизисе клеток белков, состав которых более сложен.

Годы клинического применения показали безопасность и эффективность использования клеток Vero в качестве субстрата для производства вакцин. С другой стороны, однако, нельзя исключить риск теоретической онкогенности вакцин, полученных с использованием клеток Vero. Существует два способа контроля такого риска: контроль количества пассажей клеток Vero до 130-150 поколений и снижение содержания остаточного количества ДНК и белка клеток Vero. Так как в настоящий момент в уровне техники нет специфичных средств обнаружения клеточных белков Vero, контроль качества вакцин по-прежнему проводят косвенно, определяя общее содержание белка в вакцине. (Gao Enming и др.. Consideration on the Residual Substances in Vero Cell Vaccines, Center for Drug Evaluation, State Food and Drug Administration of China, 12 января 2007 г.). Некоторые компоненты остаточных белков клетки-хозяина (НСР) в вакцине могут представлять собой аллергены. В 1998 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сформулировала "Протокол о производстве биопрепаратов с использованием клеток животных в качестве клеточного субстрата", требуя, чтобы содержание НСР в непрерывной линии клеток было уменьшено до приемлемого уровня. Это свидетельствует о том, что ВОЗ обеспокоена о содержании НСР и их влиянии на безопасность вакцин.

Tian Во и Ding Zhifen предложили метод количественного определения НСР клеток Vero в вакцинах (Tian Во, Ding Zhifen, Chinese Journal of Biologies, 2005, 18(2): 159-161, 164). Wang Hui и др. также предложили тест для определения остаточных белков клеток Vero в препаратах вакцин (Wang Hui, Zhang Yuelan, Guo Qinyuan и др., Chinese Journal of Biologies, 2007, 20 (2): 937-939, 947). Однако описанные в приведенных выше публикациях методы определения остаточных белков клеток Vero предназначены для выявления остаточных белков клеток-хозяев в вакцине, полученной только в культуре секретируемого вируса, и не предназначены для выявления остаточных белков клеток-хозяев в вакцине, полученной в культуре не секретируемого вируса. Поэтому в методах обнаружения НСР клеток Vero в вакцинах, описанных в приведенных выше публикациях, присутствуют недостатки.

В настоящее время в мире нет коммерчески доступных наборов для определения остаточного содержания НСР клеток Vero. Основной причиной этого является трудность получения некоторых материалов, необходимых для определения остаточного содержания НСР. Одним из необходимых материалов являются полученные при лизисе клеток Vero белки, которые могут быть использованы в качестве иммуногена, которым иммунизируют животных для получения антител, которые могут быть использованы в последующих реакциях для анализа и которые могут служить в качестве стандарта для анализа.

Краткое описание изобретения

Объектами настоящего изобретения являются полученные при лизисе клеток Vero белки и метод их получения. Белки могут быть использованы в качестве стандарта и антигена в анализе на НСР клеток Vero для определения остаточного содержания НСР клеток Vero в процессе производства вакцин и для контроля качества.

Другим объектом настоящего изобретения является набор для определения содержания полученных при лизисе клеток Vero белков, который позволяет преодолеть недостатки, связанные с известными в уровне техники методами определения НСР клеток Vero.

Для достижения указанных целей в одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ получения выделяющихся при лизисе клеток Vero белков, включающий:

а) культивирование клеток Vero и их сбор;

б) разрушение и лизис клеток Vero;

в) очистку выделяющихся при лизисе клеток Vero белков и

г) концентрированно для получения выделяющихся при лизисе клеток Vero белков.

Культивирование клеток Vero и их сбор. Клетки Vero представляют собой непрерывную линию клеток почки обезьяны, принятую и одобренную для использования в производстве вакцин, где вакцины для человека включают очищенную вакцину против бешенства для человека, инактивированную вакцину против полиомиелита (IPV), инактивированную вакцину против энцефалита В (JE), инактивированную вакцину против гепатита А (ВГА). Способы получения указанных выше вакцин хорошо известны специалистам в данной области. Например, процесс получения инактивированной вакцины против гепатита А (ВГА) с использованием клеток Vero описан в китайском патенте ZL 02106859.

Клетки Vero, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены экстракцией по методам, описанным в литературе, например, по методам, описанным в китайском патенте ZL 02106859, клетки также легко доступны, например, из АТСС (АТСС серия №: CCL-81). Как описано Kistner и др. (Vaccine, 1998, 16:960-968) или в W096/15231, клетки Vero адаптированы к росту в культуральной среде с сывороткой, без сыворотки или без сыворотки и белков. Способы культивирования клеток Vero и реагенты для культивирования хорошо известны специалистам в данной области техники, см. патент США №4783407 и W02003/049767. Для роста в культуральной среде без сыворотки используют минимальную среду DMEM НАМ F12, дополненную неорганическими солями, аминокислотами, бикарбонатом натрия (2 г/л) и экстрактом дрожжей или сои (1-10 г/л), или другие культуральные растворы.

Разрушение и лизис клеток Vero. Выделяющиеся при лизисе клеток Vero белки по настоящему изобретению могут быть получены разрушением и лизисом клеток с помощью химических агентов (например, органических растворителей), с помощью ферментативной обработки (например, обработки лизоцимом и ЭДТА), механической или физической обработки (такой как гомогенизация, обработка ультразвуком, гомогенизация с помощью высокого давления, растирание). Разделение внутриклеточных продуктов также предполагает сочетание механических и не механических методов. Предпочтительные методы для проведения разрушения и лизиса клеток включают химический лизис, осмотическое разрушение, повторяющееся замораживание и оттаивание, ферментативный лизис клеток, разрушение ультразвуком и механический лизис клеток, причем разрушение ультразвуком наиболее предпочтительно.

Очистка. Для облегчения очистки продукта или удаления нежелательных примесей могут быть использованы различные методы очистки внеклеточных продуктов (из культуральной среды) или внутриклеточных продуктов (из лизата). Одним из методов является разделение между твердой и жидкой фазами (например, центрифугированием/осаждением, экстракцией и фильтрацией). Другой метод состоит в концентрировании (например, испарении, ультрафильтрации, адсорбции и седиментации). Еще одним методом является хроматография (например, эксклюзионная хроматография, ионообменная хроматография, хроматофокусирование, гидрофобная хроматография, аффинная хроматография, металл-хелатная хроматография и ковалентная хроматография). Эти методы могут быть легко использованы специалистами в данной области техники. При необходимости могут быть использованы методы стерилизации, например фильтрация, нагревание или облучение (для получения дополнительной информации об очистке белков см. Ratledge С, Kristlansen В (2001) Basic biotechnology, 2-е изд., Cambridge University Press, Cambridge, Великобритания).

В одном из вариантов указанная очистка включает предварительную очистку и стадию тонкой очистки. Методы предварительной очистки включают изоэлектрическое осаждение, осаждение высаливанием и экстракцию органическими растворителями, причем экстракция органическим растворителем является предпочтительной. Тонкую очистку проводят с помощью хроматографии, в том числе эксклюзионной хроматографии, ионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии, аффинной хроматографии, металл-хелатной хроматографии и ковалентной хроматографии.

В одном из вариантов стадия предварительной очистки включает добавление раствора, полученного после разрушения клеток, к равному объему трихлорметана, перемешивание смеси от 20 до 30 минут, центрифугирование смеси при 4000 об/мин при температуре 2-8°С в течение 20 - 25 минут и отбор верхней водной фазы, содержащей белки.

В одном из предпочтительных вариантов стадия предварительной очистки включает добавление раствора, полученного после разрушения клеток, к равному объему трихлорметана, перемешивание смеси в течение 20 минут, центрифугирование смеси при 4000 об/мин при температуре 2-8°С в течение 20 минут и отбор верхней водной фазы, содержащей белки.

В одном из вариантов стадия тонкой очистки предполагает обработку образца, полученного после предварительной очистки, методом мембранной ультрафильтрации, очистку гидрофобной хроматографией и эксклюзионной хроматографией и сбор целевого белка. Указанный целевой белок характеризуется тем же диапазоном собираемых белковых пиков, как и собираемые пики, характерные для вируса и его компонентов в процессе производства вакцины. Не ограничивающие примеры указанных вирусов и их компонентов включают вирус гепатита А и его компоненты.

В предпочтительных вариантах указанная очистка гидрофобной хроматографией представляет собой гидрофобную хроматографию на фенилсефарозе 6FF, которую проводят следующим образом: образец загружают в буфере нанесения со скоростью 30-60 см/ч, затем колонку промывают 3 CV (объемами колонки) 1,0 моль/л раствора РВ (рН 6,0-7,5), после чего линейно элюируют 5 CV 0,02 моль/л раствора РВ (рН 6,0-7,5), и, наконец, собирают элюированные фракции с проводимостью ниже 48 мСм/см. Указанная эксклюзионная хроматография представляет собой эксклюзионную гель-хроматографию на сефарозе 4 Fast Flow, где элюцию проводят в 0,01 моль/л растворе PBS (рН 7,4) со скоростью 45 см/ч и собирают при элюции второй пик.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает полученные при лизисе клеток Vero белки, полученные согласно описанным выше способам.

Полученные при лизисе клеток Vero белки по настоящему изобретению представляют собой смесь белков с молекулярной массой в следующем диапазоне: 11 кДа, 17-34 кДа, 55 кДа и 72 кДа -170 кДа.

Полученные при лизисе клеток Vero белки по настоящему изобретению могут быть использованы для получения детектирующего реагента для НСР клеток Vero. Белки могут быть использованы в качестве иммуногена для разработки метода определения НСР клеток Vero и в качестве стандарта для анализа.

Полученные при лизисе клеток Vero белки по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве антигенов для получения соответствующих антител. Указанные антитела, которые представляют собой поликлональные антитела, обладают способностью специфически связывать полученные при лизисе клеток Vero белки. Не ограничивающие примеры антител включают кроличьи IgG против полученных при лизисе клеток Vero белков и IgG морской свинки против полученных при лизисе клеток Vero белков.

В еще одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен набор для анализа НСР клеток Vero, включающий твердую фазу, антитела на твердой фазе, конъюгированные с лигандом антитела и белки-стандарты, отличающийся тем, что антитела представляют собой антитела против белков, полученных при лизисе клеток Vero по настоящему изобретению, а указанные белки-стандарты представляют собой белки, полученные при лизисе клеток Vero по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте набор для анализа НСР клеток Vero по настоящему изобретению дополнительно содержит модифицированные биотином антитела и конъюгированный с лигандом авидин.

В другом предпочтительном варианте набор для анализа НСР клеток Vero по настоящему изобретению дополнительно содержит антитела, модифицированные 2,4-динитрофенолом, и конъюгированные с лигандом антитела против 2,4-динитрофенола.

Набор для анализа по настоящему изобретению по желанию может включать реагенты для обнаружения указанного выше конъюгированного с лигандом (или меченого) авидина или конъюгированных с лигандом (или меченых) антител против 2,4-динитрофенола.

Белки-стандарты.

Полученные при лизисе клеток Vero белки по настоящему изобретению, полученные по описанным выше методом получения, поставляются в наборе для анализа по настоящему изобретению в качестве белков-стандартов для определения остаточного содержания НСР клеток Vero в процессе производства вакцин и контроля качества.

Антитела.

В настоящем документе термин "антитела против полученных при лизисе клеток Vero белков" относится к антителам, полученным с использованием указанных выделенных при лизисе клеток Vero белков в качестве антигенов. Эти антитела, которые представляют собой поликлональные антитела, обладают способностью специфически связывать полученные при лизисе клеток Vero белки. Не ограничивающие примеры антител включают кроличьи IgG против полученных при лизисе клеток Vero белков и IgG морской свинки против полученных при лизисе клеток Vero белков.

Антитела против полученных при лизисе клеток Vero белков могут быть получены с использованием полученных при лизисе клеток Vero белков в качестве антигенов с помощью обычных методов получения соответствующих антител, известных в уровне техники.

Например, кроличьи IgG против полученных при лизисе клеток Vero белков и IgG морской свинки против полученных при лизисе клеток Vero белков могут быть получены с использованием следующих стадий:

1) четырехкратной иммунизации кролика или морской свинки белками, полученными при лизисе клеток Vero по настоящему изобретению, с последующим отбором крови,

где для кролика, например, с массой тела 2 кг первую иммунизацию проводят в дозе 0,5 мг белков на кролика, вторую иммунизацию проводят через 4 недели в дозе 0,5 мг белков на кролика, третью иммунизацию проводят при той же дозе через 10 дней и, наконец, четвертую иммунизацию проводят через 2 недели после третьей иммунизации, затем кровь животных собирают через 1 неделю;

для морской свинки, например, с массой тела 250 г первую иммунизацию проводят в дозе 0,2 мг белков на морскую свинку, вторую иммунизацию проводят через 2 недели в дозе 0,4 мг белков на морскую свинку, третью иммунизацию проводят при той же дозе через 10 дней и, наконец, четвертую иммунизацию проводят через 2 недели после третьей иммунизации, затем кровь животных собирают через 1 неделю;

2) выбора антисыворотки с более высоким титром антител из сывороток двух животных и очистки антисыворотки;

3) измерения титра после очистки.

Очистка IgG может быть проведена осаждением сульфатом аммония, методом с использованием каприловой кислоты и сульфата аммония, аффинной колоночной хроматографией на А белке.

В настоящем изобретении термин "титр" относится к окончательному титру, то есть максимальному разведению сыворотки, при котором могут быть обнаружены связавшиеся антитела.

Конъюгированные с лигандом антитела (или меченые антитела).

Как хорошо известно специалистам в данной области, очищенные антитела могут быть количественно определены, если они помечены или конъюгированы с ферментом (например, с пероксидазой, β-D-галактозидазой, щелочной фосфатазой, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназой или т.п.), помечены или конъюгированы с флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом, такие антитела называют "конъюгированные с лигандом антитела" или "меченые антитела". Если антитела помечены ферментом, при реакции фермента с соответствующим субстратом продукт ферментативной реакции может быть использован в качестве метки для количественного и качественного определения антигенов, с которыми специфически связываются антитела. Кроме того, при использовании меченых флуоресцентной группой или радиоактивным изотопом антител флуоресценция или радиоактивность могут быть использованы в качестве метки для количественного и качественного выявления антигенов, с которыми специфически связываются антитела.

"Конъюгированные с лигандом антитела" или "меченые антитела" дополнительно включают модифицированные биотином, модифицированные 2,4-динитрофенолом антитела и тому подобное. Биотин специфически связывается авидином, в то время как 2,4-динитрофенол специфически связывается антителами против 2,4-динитрофенола. Таким образом, указанные меченые антитела могут быть количественно и качественно обнаружены с применением меченых ферментом, нуклидом или флуоресцентной меткой авидина или антител против 2,4-динитрофенола.

Указанные меченые антитела могут быть получены взаимодействием реагентов для мечения биотином (NHS-LC-биотин, Pierce, Ltd) и/или пероксидазы, несущей сшивающий агент (активированная малеимидом пероксидаза хрена. Pierce Co., Ltd), с антителами.

В некоторых вариантах метки в указанных конъюгированных с лигандами антителах в наборе для анализа НСР клеток Vero по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются, ферментами, нуклидами и флуоресцентными метками. Ферменты включают, но не ограничиваются, пероксидазой, β-D-галактозидазой, щелочной фосфатазой и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой; нуклиды включают, но не ограничиваются, ³H, ¹⁸⁸Re, ¹³¹I, флуоресцентные метки включают, но не ограничиваются, изотиоцианатом флуоресцеина, тетраэтилродамином, изотиоцианатом тетраметилродамина, хелатами трехвалентных лантаноидов, таких как хелат европия (Eu³⁺), тербия (Tb³⁺) и церия (Се³⁺).

Если метка представляет собой фермент, набор по настоящему изобретению дополнительно содержит вспомогательные реагенты для ферментативной реакции, в том числе раствор субстрата, хромогенный раствор, раствор для остановки реакции и буферный раствор для отмывания.

Примеры вспомогательных реагентов включают:

1. раствор субстрата: 3% раствор Н₂О₂ в фосфатно-цитратном буфере (рН 5,0);

2. хромогенный раствор: 0,0004 моль/л раствор ТМВ в метаноле или 0,0013 моль/л раствор гидрохлорида ТМВ;

3. Раствор для остановки реакции: 2 моль/л раствор серной кислоты;

4. Буферный раствор для отмывания: PBS раствор.

Твердая фаза:

В настоящем документе "твердая фаза" относится к любому твердому субстрату, такому как планшет для ИФА, носитель белкового чипа, например мембрана, стекло и т.д., на котором может быть отдельно анализировано несколько жидких образцов методами по настоящему изобретению. В настоящем документе "реакционная лунка" твердой фазы относится к ограниченной области на твердой фазе, которая служит зоной приема образцов. Реакционные лунки на обычной твердой фазе получают, формируя выемки на поверхности планшета, причем объем каждой из выемок достаточен, чтобы вместить и содержать объем образца и объем буфера или раствора для отмывания, добавленных на любой стадии анализа. Используемый здесь термин "измерение" целевых молекул относится к определению, количественной оценке или определению содержания аналита или целевой молекулы.

Набор для анализа НСР клеток Vero, предусмотренный в настоящем документе, может быть эффективно использован для обнаружения остаточного содержания НСР клеток Vero с помощью следующих стадий:

отбора образца,

выполнения определения с использованием указанного набора для анализа НСР клеток Vero и

анализа результатов.

Способы определения

Антитела являются ключевыми реагентами во многих методах определения, используемых в медицине, ветеринарии и других областях. Такие методы определения включают многие традиционно используемые иммунологические методы анализа, такие как анализ на белковых чипах, иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунологический анализ (РИА), иммуногистохимия (ИГХ) и иммунофлуоресцентный (ИФ) анализ. Описание методов см. Ausubel и др. "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New York, 1987. Кроме того, иммуноанализ предоставляет средства для визуализации иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания или иммунофлуоресценции (ИФ) в образце ткани. См. "Principles and Practice of Immunoassay", Christopher P. Price и David J. Neoman, Stockton Press, New York, 1991.

В конкретном варианте анализ по настоящему изобретению представляет собой иммуноферментный анализ, в котором поликлональные антитела против конкретной молекулярной формы полученных при лизисе клеток Vero белков используют для выявления общего содержания полученных при лизисе клеток Vero белков (не связанных в комплекс и связанных в комплекс с антителом белков) или содержания свободных (не связанных в комплекс) полученных при лизисе клеток Vero белков, например, в образце вакцины. Не ограничивающий пример иммуноферментного анализа может быть осуществлен следующим образом.

1. Сорбция на планшете. Поверхность реакционной лунки планшета для анализа покрывают антителами против полученных при лизисе клеток Vero белков в оптимальной концентрации. Оптимальную концентрацию антител определяют по стандартной кривой, построенной с использованием известных концентраций полученных при лизисе клеток Vero белков, где кривая характеризуется желаемыми чувствительностью и точностью в требуемом диапазоне эффективных концентраций. Для полученных при лизисе клеток Vero белков диапазон эффективных концентраций полученных при лизисе клеток Vero белков, которые могут быть обнаружены с помощью набора для анализа по настоящему изобретению, составляет от 62,5 нг/мл до 4000 нг/мл. Специалисты в данной области легко без дополнительных экспериментов могут определить, достигается ли приемлемая чувствительность и точность в пределах требуемого диапазона.

2. Отмывание планшета. Раствор для сорбции антител сливают, затем добавляют и сливают промывочный буфер (приблизительно 400 мкл/лунку). Стадию промывания повторяют несколько раз по мере надобности. Буфер для отмывания может представлять собой 0,01 моль/л фосфатный буфер (содержащий 0,0027 моль/л хлорида калия, 0,137 моль/л хлорида натрия, рН 7,4,0,01% масса/объем TritonX-100).

3. Блокирование планшета. Буфер для блокирования (буфер для абсорбции антител, содержащий 1% БСА/0,1% Тритона Х-100), включающий белок и поверхностно-активное вещество, добавляют в реакционные лунки. Планшеты можно хранить заблокированными.

4. Добавление образца и стандарта. Планшеты промывают, как описано выше. Сто (100) мкл каждого стандарта и образцов, которые необходимо исследовать, добавляют в соответствующие реакционные лунки планшета, а затем в каждую лунку добавляют 50 мкл реагента. Смесь осторожно перемешивают в течение 15 секунд, затем инкубируют при 37°С в течение 60 минут. Реакционный раствор удаляют, реакционный планшет промывают 5 раз буфером. После удаления излишков воды в каждую лунку добавляют 50 мкл хромогенного раствора, который инкубируют при 37°С в течение 15 минут, после чего реакцию останавливают. Реакционный планшет помещают на планшетный спектрофотометр и определяют оптическую плотность. Различное протекание хромогенной реакции в каждой лунке приводит к различным значениям оптической плотности.

5. Примеры подходящих ферментативных субстратов, полезных для количественной оценки интенсивности окраски комплекса, включают нитрофенилфосфат для щелочной фосфатазы или сульфонат тетраметилбензидина (TMBS) для пероксидазы хрена. Интенсивность окраски можно измерить в единицах поглощения (е.п., для п-нитрофенола абсорбцию измеряют при 405 нм, а для TMBS абсорбцию измеряют при 450 нм), которые служат в качестве показателя содержания НСР в исследуемом образце. Точную концентрацию НСР можно измерить, определяя поглощение образца и сравнивая полученное значение со стандартной кривой, построенной с использованием стандартных НСР.

6. При получении во время анализа достаточного сигнала измерение сигнала проводят, например, с помощью планшетного спектрофотометра или планшетного флуориметра для ИФА.

7. Обработку данных проводят, строя калибровочную кривую по измеренным сигналам, полученным с использованием стандартных растворов с известными концентрациями выделенных при лизисе клеток Vero белков. Калибровочную кривую используют для расчета концентраций полученных при лизисе клеток Vero белков в исследуемом образце.

Преимущества изобретения

Настоящее изобретение предусматривает полученные при лизисе клеток Vero белки и способ их получения. Белки могут быть использованы в качестве иммуногена для разработки метода определения НСР клеток Vero и в качестве стандарта для анализа. Полученные при лизисе клеток Vero белки по настоящему изобретению имеют широкий спектр применения. Они могут быть использованы не только при производстве вакцин против внутриклеточных не секреторных вирусов, таких как вирус гепатита А, но также могут быть использованы для контроля качества и анализа в процессе получения других вакцин из клеток Vero, причем анализ характеризуется высокой специфичностью, высокой чувствительностью и хорошей воспроизводимостью.

Настоящее изобретение также предусматривает соответствующий набор для анализа НСР клеток Vero, который характеризуется высокой специфичностью, высокой чувствительностью и хорошей воспроизводимостью. Он может быть использован для контроля качества и анализа в процессе получения вакцин не только против не секреторных вирусов, таких как вирус гепатита А, но и при получении других вакцин из клеток Vero.

Краткое описание фигур

На Фиг.1 показана блок-схема способа получения выделяемых при лизисе клеток Vero белков.

На Фиг.2 показана хроматограмма при очистке лизата клеток Vero на гидрофобной фенилсефарозной смоле Phenyl Sepharose 6 Fast Flow.

На Фиг.3 показана хроматограмма при очистке лизата клеток Vero на сефарозе для эксклюзионной хроматографии Sepharose 4 Fast Flow.

На Фиг.4 показан SDS-PAGE стандарта полученных при лизисе клеток Vero белков, окрашенный серебром.

На Фиг.5 показана стандартная кривая, построенная с использованием сэндвич ИФА метода для полученных при лизисе клеток Vero белков.

На Фиг.6 показан анализ на специфичность метода определения НСР клеток Vero по настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими конкретными примерами. Подразумевается, что указанные примеры лишь иллюстрируют настоящее изобретение, а не ограничивают широту настоящего изобретения. Если для упомянутых в следующих примерах экспериментальных процедур не указаны конкретные условия, то процедуры, как правило, проводят в соответствии с обычными условиями или в соответствии с условиями, рекомендованными производителями. Пропорции и проценты рассчитаны по весу или объему, если конкретно не указано иное.

Источники материалов

Клетки Vero для посева: АТСС серия №: CCL-81,

экспериментальные животные

кролик (обычный сорт, масса тела 2 кг), из Shanghai Puxin Biological Co., Ltd, Шанхай, Китай;

морская свинка (чистый сорт, масса тела 250 г), из Shanghai Laboratory Animal Center, Китайская академия наук.

Основные инструменты и реактивы

Ультразвуковой разрушитель клеток Sonics VCF1500, максимальная выходная мощность 1500 Вт; ультрафильтр - 2 кассетный фильтр Pellicon; Biomax-100 (MWCO (предел эксклюзии)=100 кДа) (Millipore Corporation); ультрафильтрационный концентратор (MWCO=100 КД) (Millipore Corporation); хроматограф Akta Pilot (GE Healthcare Co, Ltd); хроматографические колонки BPG 140/950; INDEX 140/500 (GE Healthcare Co, Ltd); смола - гидрофобный гель фенилсефарозы Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Co, Ltd); сефароза для эксклюзионной хроматографии Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Co, Ltd), аффинная колонка с белком А, пероксидаза хрена (HRP) (Sigma Co, Ltd), планшеты для ИФА (Costar Ltd.); планшетный спектрофотометр для ИФА, Thermo Multiskan MK3; телячья сыворотка, Lanzhou Minhai Biotechnology, Ltd., Gansu, Китай, партия №051203, раствор для культивирования клеточных культур: среда 199 (GIBCO); бычий сывороточный альбумин (БСА, фракция V), изготовлен Calbiochem Ltd. и упакован Yicheng Bioscience Ltd., Шанхай, Китай; коза анти-кролик-HRP, коза антиморская свинка-HRP, KPL Ltd.; овальбумин (альбумин из куриного яичного белка), Sigma Co., Ltd., вирус гепатита А (ВГА), штамм рНМ175 вируса гепатита А, 10,81 мкг/мл, Biodesign International; стандарт анти-ВГА-IgG, 75 МЕ/мл, National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Китай; трипсин, BD Co., Ltd.; гидролизат лактальбумина, GIBCO Co., Ltd.; ProClin 300 от Supeico Ltd.; TMB гидрохлорид, Suzhou ВЕС Biology Technology Co., Ltd., провинция Jiangsu, Китай.

Пример 1: Получение выделяемых при лизисе клеток Vero белков

Способ получения

1. Культивирование и сбор клеток. Клетки из пробирки с клетками Vero из рабочего банка клеток инокулировали во флакон для культивирования клеток, после чего добавляли среду 199, содержащую 10% телячьей сыворотки, затем клетки инкубировали при температуре 37±1°С. После роста перевитых клеток до плотного монослоя полученные клетки Vero обрабатывали трипсином для пересева и размножения и инкубировали при 37±1°С в течение 25 дней, после чего клетки собирали. Клетки обрабатывали трипсином и центрифугировали при 3500 об/мин при 4°С в течение 30 минут. Осадок клеток собирали для дальнейшего использования в качестве источника для получения образцов выделяемых при лизисе белков.

2. Разрушение и лизис клеток. Собранные клетки Vero разрушали и лизировали ультразвуком при выходной мощности 1400 Вт до отсутствия интактных клеток в смеси.

3. Экстракция белков хлороформом. К раствору разрушенных клеток добавляли равный объем хлороформа, смесь встряхивали на шейкере при 300 об/мин в течение 20 минут для лучшего контакта хлороформа с клетками. После оседания разрушенных клеток смесь центрифугировали при 4000 об/мин при 4°С в течение 20 минут, затем содержащую белки верхнюю водную фазу удаляли. В стакан для центрифугирования добавляли равный объем 0,01 моль/л PBS (рН 7,8) и экстракцию повторяли 4 раза.

4. Концентрирование. Все полученные в процессе экстракции растворы объединяли и концентрировали с использованием ультрафильтрационной мембраны с MWCO 100 кДа. К полученному в процессе ультрафильтрации концентрату добавляли соль для получения РВ буфера, которая после полного растворения приводила к конечной концентрации РВ 1,0 моль/л, рН 6,8.

5. Очистка. Концентрат адсорбировали на фенилсефарозном гидрофобном геле Phenyl Sepharose 6 Fast Flow при скорости потока 50 см/ч, после окончания адсорбции сорбент промывали 3 CV 1,0 моль/л раствора РВ (рН 6,8), а затем линейно элюировали 5 CV 0,02 моль/л раствора РВ (рН 6,8). Элюированные фракции с проводимостью ниже 48 мСм/см собирали и концентрировали с использованием мембраны для ультрафильтрации с MWCO 100 кДа. Полученный концентрат загружали гель для эксклюзионной хроматографии Sepharose 4 Fast Flow и элюировали 0,01 моль/л раствором PBS (рН 7,4) при скорости потока 45 см/ч, причем при элюции собирали второй пик.

6. Дальнейшее концентрирование. Собранный раствор сначала концентрировали до 200 мл с использованием мембраны для ультрафильтрации с MWCO 100 кДа, а затем концентрировали до 30 мл с использованием 50 мл ультрафильтрационных пробирок для центрифугирования (MWCO=100 кДа), в результате получали специфические выделенные при лизисе клеток Vero белки (стандарт выделенных при лизисе клеток Vero белков или НСР клеток Vero).

Результаты эксперимента. Концентрация выделенных при лизисе клеток Vero белков, определенная по методу Лоури, составила 540 мкг/мл. Соответствующие экспериментальные данные по изобретению представлены в Таблице 1 ниже.

Таблица 1. Изменение содержания белка в образце на различных стадиях очистки Стадия очистки Разрушение клеток Vero Экстрак
ция белков Концентрирова
ние Гидрофоб
ная хроматография Эксклюзион
ная хроматогра
фия Объем (мл) 2300 10600 2250 12286 2543 Содержание белка (мкг/мл) 17690 2137 3779 192 16 Выделение белков клеток Vero - 44,3% 79,1% 94,2% 99,9%

Результаты SDS-электрофореза, окрашенного серебром, показаны на Фиг.4, где

дорожка 1 - белковый стандарт молекулярной массы,

дорожка 2 - неочищенные белки, полученные при лизисе клеток Vero, выделенные на стадии 4,

дорожка 3 - полученные при лизисе клеток Vero белки.

Результаты показывают, что выделенные при лизисе клеток Vero белки, полученные после очистки, содержат различные белковые компоненты, причем их молекулярные массы лежат в диапазоне 55 кДа, 11 кДа, 170 - 72 кДа и 34-17 кДа.

Пример 2. Получение антител против выделенных при лизисе клеток Vero белков

1. Иммунизация кроликов

Иммунизации подвергли трех кроликов. Первую иммунизацию проводили эмульсией 0,5 мг выделенных при лизисе клеток Vero белков, полученных, как описано в Примере 1, которые полностью эмульгировали в равном объеме полного адъюванта Фрейнда, эмульсию вводили подкожно в 6-8 точек на спине каждого кролика. Четыре недели спустя проводили вторичную иммунизацию эмульсией 0,5 мг выделенных при лизисе клеток Vero белков, полученных, как описано в Примере 1, которые полностью эмульгировали в равном объеме полного адъюванта Фрейнда, эмульсию вводили подкожно и внутримышечно в несколько точек. Через десять дней после вторичной иммунизации аналогично проводили третью иммунизацию. Наконец через две недели после третьей иммунизации проводили четвертую иммунизацию. Через неделю после четвертой иммунизации кровь собирали и анализировали ее на титр антител.

Таблица 2. Титры в сыворотке крови иммунизированных кроликов Кролик Объем сыворотки (мл) Титр 1 35 1:106 2 40 1:106 3 41 1:106

2. Иммунизация морских свинок

Иммунизации подвергли трех морских свинок. Первую иммунизацию проводили эмульсией 0,2 мг выделенных при лизисе клеток Vero белков, полученных, как описано в Примере 1, которые полностью эмульгировали в равном объеме полного адъюванта Фрейнда, эмульсию вводили подкожно в 5-6 точек на спине каждой морской свинки, в каждую точку вводили по 0,1 мл эмульсии. Две недели спустя проводили вторичную иммунизацию эмульсией 0,4 мг выделенных при лизисе клеток Vero белков, полученных, как описано в Примере 1, которые полностью эмульгировали в равном объеме полного адъюванта Фрейнда, эмульсию вводили подкожно в несколько точек. Через десять дней после вторичной иммунизации аналогично проводили третью иммунизацию. Наконец через две недели после третьей иммунизации проводили четвертую иммунизацию. Через неделю после четвертой иммунизации кровь собирали и анализировали ее на титр антител.

Таблица 3. Титры в сыворотке крови иммунизированных морских свинок Морская свинка Объем сыворотки (мл) Титр 1 5 1:105 2 4 1:105 3 5,5 1:105

3. Очистка сыворотки.

Антисыворотку с более высоким титром антител, полученную от двух животных, как описано выше, отбирали для очистки. Аффинную хроматографию проводили с использованием коммерчески доступных расфасованных аффинных колонок с иммобилизованным на сефарозе белком А, в результате получали IgG против полученных при лизисе клеток Vero белков. Затем определяли поглощение при 280 нм и 260 нм и концентрацию антител рассчитывали по следующей формуле:

С (мг/мл)=1,45×OD_{280 нм} - 0,74×OD_{260 нм}

Таблица 4. Концентрация антител после очистки   OD_{280 нм} OD_{260 нм} Разведение Концентрация антител (мг/мл) 1# антитело морской свинки 0,226 0,163 20 4,109 2# антитело морской свинки 0,208 0,154 20 3,722 3# антитело морской свинки 0,196 0,149 20 3,449 1# антитело кролика 0,204 0,148 20 3,696 2# антитело кролика 0,215 0,156 20 3,895 3# антитело кролика 0,182 0,141 20 3,163

4. Определение титра антител после очистки.

Определение титра антител проводили с использованием непрямого ИФА. Выделенные при лизисе клеток Vero белки, полученные, как описано в Примере 1, разбавляли карбонатным буфером (0,05 моль/л РВ, рН 9,6) до 10 мкг/мл. В лунки планшета для микротитрования вносили по 100 мкл разведения и инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующий день планшет дважды промывали PBS. Затем планшет блокировали 2% раствором БСА в объеме 125 мкл/лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов с последующим двукратным промыванием PBS. IgG против выделенных при лизисе клеток Vero белков, полученные на стадии 3, как описано выше, разбавляли до концентрации 1 мг/мл, а затем готовили 10-кратные последовательные разведения, разведения добавляли в планшет в объеме 100 мкл/лунку. Планшет инкубировали при 37°С в течение 60 минут, промывали и выбивали остатки жидкости. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл конъюгированных с ферментом вторичных антител (коза антикролик-HRP или коза-антиморская свинка-HRP) и планшет инкубировали при 37°С в течение 30 минут, а затем отмывали и выбивали остатки жидкости. В каждую лунку добавляли растворы хромогенного реагента А и хромогенного реагента В, затем планшет инкубировали при 37°С в течение 15 минут. Для остановки реакции в лунки добавляли 2 моль/л раствор серной кислоты. Затем на планшетном спектрофотометре определяли интенсивность окраски, из которой рассчитывали титр антител.

Таблица 5. Титр антител после очистки   1# антитело морской свинки 2# антитело морской свинки 3# антитело морской свинки 1# антитело кролика 2# антитело кролика 3# антитело кролика Титр 1:106 1:105 1:105 1:105 1:106 1:105

Пример 3. Получение конъюгированных с ферментом антител

Были отобраны имеющие наиболее высокий титр IgG против выделенных при лизисе клеток Vero белков, полученные на стадии 3, как описано выше, (1 # IgG морской свинки против выделенных при лизисе клеток Vero белков и 2 # IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero белков), отобранные антитела метили пероксидазой хрена (HRP) с использованием периодата натрия (Luo Jiali и др., Acta Biochimica and Biophysica Sinica, 1981,13:1).

Таблица 6. HRP-IgG против выделенных при лизисе клеток Vero белков Конъюгированное с ферментом антитело OD_{403 нм} OD_{280 нм} Концент
рация HRP (мг/мл) Концентрация IgG(Mr/Mn) Процент меченых антител Моляр
ное отноше
ние HRP-кроличьи IgG против выделенных при лизисе клеток Vero белков 1,39 2,60 0,56 1,35 0,53 1,66 HRP-IgG морской свинки против выделенных при лизисе клеток Vero белков 1,20 2,80 0,48 1,51 0,42 1,27

Пример 4. Определение оптимальной концентрации для сорбции IgG морской свинки против выделенных при лизисе клеток Vero белков

IgG морской свинки против выделенных при лизисе клеток Vero белков, полученные, как описано в Примере 2, разбавляли 0,05 моль/л РВ (рН 9,6) до 5-20 мкг/мл. В лунках планшета для микротитрования сорбировали разведения антител в объеме 100 мкл/лунку, планшет инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующий день планшет два раза промывали 0,01 моль/л PBS (рН 7,4). Затем в лунки планшета добавляли по 150 мкл 2% раствора БСА-PBS на лунку и планшет блокировали при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем дважды промывали PBS и сушили на воздухе. В лунки планшета вносили серийные разведения стандарта выделенных при лизисе клеток Vero белков (получены, как описано в Примере 1, концентрации приведены в Таблице 7), и планшет инкубировали при 37°С в течение 60 минут. Затем планшет промывали четыре раза и выбивали из планшета остатки жидкости. Конъюгированное с ферментом антитело HRP-IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero белков разбавляли PBS-T (содержащим 10% бычьей сыворотки и 0,03% ProClin 300) (1:500-1:1000). В лунки планшета добавляли по 100 мкл разведения на лунку, после чего планшет инкубировали при 37°С в течение 60 минут, затем планшет промывали 4 раза PBS-T и выбивали из планшета остатки жидкости. Цветную реакцию проводили при 37°С в течение 10 минут, затем реакцию останавливали и определяли интенсивность окраски. Результаты опыта показали, что оптимальная концентрация антител для сорбции на планшете лежит в диапазоне 5-20 мкг/мл.

Таблица 7. Эксперимент для оптимизации концентрации IgG морской свинки против выделенных при лизисе клеток Vero белков для их сорбции на планшет Значение оптической плотности (вычитание нулевого уровня) Концентрация антител для сорбции стандарт 5 мкг 10 мкг 20 мкг 4000 нг 2,495 2,753 3,011 2000 нг 1,267 1,382 1,690 1000 нг 0,480 0,599 0,718 500 нг 0,320 0,373 0,387 250 нг 0,152 0,178 0,225 125 нг 0,065 0,087 0,105 62,5 нг 0,030 0,027 0,037 Уравнение регрессии y=1,5852x+44,474
R²=0,9963 y=1,449x+15,935
R²=0,9985 y=1,3054x-17,45 R²=0,9958

Пример 5: Определение оптимального разведения HRP-IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero белков

В планшет с сорбированными очищенными IgG морской свинки против выделенных при лизисе клеток Vero белков, полученных, как описано в Примере 2 (10 мкг/мл), вносили серийные разведения стандарта выделенных при лизисе клеток Vero белков (полученных, как описано в Примере 1, концентрации приведены в Таблице 8), планшет инкубировали при 37°С в течение 60 минут, затем промывали 4 раза и выбивали из него остатки жидкости. Конъюгированные с ферментом антитела кролика HRP-IgG против выделенных при лизисе клеток Vero белков разбавляли PBS-T (содержащим 10% бычьей сыворотки и 0,03% ProClin 300) до получения соответствующих разведении (1:500-1:1000). В каждую лунку планшета добавляли сто (100) мкл разбавленного раствора конъюгированного с ферментом антитела, после чего планшет интенсивно встряхивали. Планшет инкубировали при 37°С в течение 60 минут, затем промывали 4 раза PBS-T и выбивали из него остатки влаги. Цветную реакцию проводили при 37°С в течение 10 минут, затем реакцию останавливали и определяли интенсивность окраски. Результаты опыта показали, что оптимальные разведения НКР-IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero белков лежат в диапазоне 1:500-1:1000.

Таблица 8. Разведения HRP-IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero белков Оптическая плотность (вычитание нулевого уровня) Разведения HRP-IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero белков Стандарт 1:500 1:750 1:1000 4000 нг 3,182 2,913 2,884 2000 нг 1,635 1,481 1,411 ЮООнг 0,728 0,693 0,567 500 нг 0,441 0,408 0,349 250 нг 0,203 0,194 0,183 125 нг 0,100 0,094 0,079 62,5 нг 0,064 0,031 0,037 Уравнение регрессии y=1,2556x-5,9 R²=0,9989 y=1,3723x-6,4208 R²=0,9994 y=1,38x4-47,379 R²=0,9971

Пример 6. Налаживание метода двойного сэндвич ИФА

Сорбция антител на планшете. Очищенные IgG морской свинки против выделенных при лизисе клеток Vero белков разбавляли 0,05 моль/л СВ (рН 9,6) до концентрации 5-20 мкг/мл. В планшет для микротитрования добавляли 100 мкл/лунку каждого разведения, планшет инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующий день планшет промывали два раза 0,01 моль/л PBS (рН 7,4). Затем в лунки планшета добавляли по 150 мкл 2% БСА-PBS, планшет блокировали при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем дважды промывали PBS и сушили на воздухе. Планшет помещали в герметично закрываемый пакет, в который также помещали небольшой пакет осушителя, и хранили в таком виде при 4°С для последующего использования.

Добавление образца. Стандарт выделенных при лизисе клеток Vero белков, полученных, как описано в Примере 1, разбавляли PBS-T до 4000 нг/мл, 2000 нг/мл, 1000 нг/мл, 500 нг/мл, 250 нг/мл, 125 нг/мл и 62,5 нг/мл. В каждую лунку планшета добавляли сто (100) мкл соответствующего разведения описанного выше стандарта, а также 0,01 моль/л PBS-T и исследуемый образец. Планшет инкубировали при 37°С в течение 60 мин, планшет промывали 4 раза PBS-T и выбивали из него остатки жидкости.

Добавление HRP-IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero белков. HRP-IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero белков, полученные, как описано в Примере 2, разбавляли PBS-T (содержащим 10% бычьей сыворотки и 0,03% ProClin 300) до подходящего разведения (1:500-1:1000). В каждую лунку планшета добавляли сто (100) мкл разведения HRP-IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero белков, планшет интенсивно встряхивали для перемешивания содержимого лунок. Планшет инкубировали при 37°С в течение 60 минут, затем промывали 4 раза PBS-Т и выбивали для удаления остатков жидкости.

Проведение цветной реакции. В каждую лунку добавляли хромогенный агент А в качестве субстрата (0,1 моль/л натрий ацетат-цитратный буфер, содержащий 0,0038 моль/л перекиси водорода, 20000 единиц/л гентамицина, рН 5,0) и хромогенный агент В (0,02 моль/л Трис-HCl буфер, содержащий 0,0005 моль/л дигидрата динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,0013 моль/л ТМВ гидрохлорида), реакцию проводили при 37°С в течение 10 минут.

Определение интенсивности окраски. В каждую лунку добавляли 50 мкл раствора для остановки реакции (2 моль/л H₂SO₄), планшет интенсивно встряхивали. Значение оптической плотности раствора в каждой лунке определяли на планшетном спектрофотометре при 450 нм.

Расчет. Стандартную кривую строили, вычитая оптическую плотность при концентрации стандарта 0 нг/мл (т.е. поглощение раствора для разведения образца - 0,01 моль/л PBS-T) из значений оптической плотности при различных концентрациях стандарта и образца (вычитание нулевого уровня). Приведены уравнения линейной регрессии и значения R². Содержание НСР клеток Vero в образце рассчитывали на основе стандартной кривой.

Пример 7. Корреляция стандартной кривой

Стандарт выделенных при лизисе клеток Vero белков, полученных, как описано в Примере 1, разбавляли в два раза до концентраций от 4000 нг/мл до 62,5 нг/мл. Разведения с различными концентрациями белков анализировали, как описано в Примере 6. Была построена кривая, в которой на оси ординат были отложены концентрации стандарта выделенных при лизисе клеток Vero белков, а на оси абсцисс отложены значения 1000 × оптической плотности, полученные вычитанием значений оптической плотности при концентрации стандарта 0 нг/мл (т.е. поглощения раствора для разведения образца - 0,01 моль/л PBS-T) из значений оптической плотности при различных концентрациях стандарта (вычитание нулевого уровня). Кривая была приблизительно линейной, как показано на Фиг.5. Корреляции кривой наблюдалась (R²≥0,99) при концентрации стандарта 62,5-4000 нг/мл.

Таблица 9. Результаты анализа стандарта выделенных при лизисе клеток Vero белков Содержание стандарта выделенных при лизисе клеток Vero белков(нг/мл) 62,5 125 250 500 1000 2000 4000 OD_{450 нм} 0,057 0,100 0,217 0,396 0,880 1,623 3,135

Пример 8. Набор для определения НСР клеток Vero

Планшет с сорбированными IgG морской свинки против выделенных при лизисе клеток Vero белков 1×96-луночный планшет Стандарт (очищенные выделенные при лизисе клеток Vero белки, полученные, как описано в Примере 1, 8000 нг/мл) 1×флакон 500 мкл HRP-IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero белков 1×флакон 50 мкл Буфер для разведения фермента 1×флакон 20 мл 20×промывочный PBS буфер 1×флакон 50 мл Хромогенный агент А 1×флакон 7 мл

Хромогенный агент В 1×флакон 7 мл Раствор для остановки реакции (2 моль/л H₂SO₄) 1×флакон 7 мл

Пример 9. Набор для анализа НСР клеток Vero

Планшет с сорбированными IgG морской свинки против выделенных при лизисе клеток Vero белков 1×96-луночный планшет Стандарт (очищенные выделенные при лизисе клеток Vero белки, полученные, как описано в Примере 1, 8000 нг/мл) 1×флакон 500 мкл HRP-IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero белков 1×флакон 50 мкл Буфер для разведения фермента 1×флакон 20 мл 20×промывочный PBS буфер 1×флакон 50 мл Хромогенный агент А 1×флакон 7 мл Хромогенный агент В 1×флакон 7 мл Раствор для остановки реакции (2 моль/л H₂SO₄) 1×флакон 7 мл

Пример 10. Исследование специфичности набора для анализа НСР клеток Vero

Набор для определения, как описано в Примере 8, в основном используют для определения содержания белков клетки-хозяина в промежуточных продуктах при производстве вакцин в клетках Vero. Указанные промежуточные продукты могут содержать другие компоненты кроме белков клетки-хозяина. Такие компоненты, которые, в частности, включают бычью сыворотку, культуральную среду, БСА, яичный альбумин, вирус гепатита А (ВГА), анти-ВГА IgG, трипсин и гидролизат лактоальбумина, не должны мешать определению с помощью набора. Поэтому набор для определения, описанный в Примере 8, применяли для определения, как описано в Примере 6, с использованием бычьей сыворотки, культуральной среды, 2% БСА, 2% овальбумина, ВГА (разведение 1:4, 2,7 мкг/мл), анти-ВГА IgG (2 МЕ/мл), 0,25% трипсина и 2% гидролизата лактоальбумина в качестве образцов для проверки специфичности описываемого метода определения.

Результаты приведены на Фиг.6, где: 1) стандарт выделенных при лизисе клеток Vero белков; 2) PBS-T; 3) культуральная среда, 4) бычья сыворотка; 5) БСА; 6) овальбумин; 7) ВГА, 8) ВГА-IgG; 9) трипсин и 10) гидролизат лактоальбумина. Результаты показывают, что набор для определения по настоящему изобретению не дает перекрестной реакции с бычьей сывороткой, культуральной средой, БСА, яичным альбумином, ВГА, анти-ВГА IgG, трипсином и гидролизатом лактоальбумина и поэтому является высокоспецифичным.

Пример 11. Исследование точности набора для анализа НСР клеток Vero

С использованием набора для определения, описанного в Примере 8, были определены значения оптической плотности при 450 нм в 10 лунках одного планшета, каждая из которых содержит 1000 нг/мл стандарта, определение проводили, как описано в Примере 6. Определения проводили в трех повторностях, средний коэффициент вариации (CV%) для одного набора составил 6,0%.

Таблица 10. Найденные значения оптической плотности (OD) при 450 нм для 1000 нг/мл стандарта Номер лунки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CV% OD_{450 нм} 0,730 0,671 0,662 0,625 0,631 0,610 0,619 0,653 0,719 0,652 6,2% 0,735 0,711 0,660 0,637 0,635 0,622 0,620 0,647 0,722 0,664 6,4% 0,834 0,774 0,758 0,713 0,693 0,773 0,710 0,737 0,782 0,768 5,5%

Пример 12. Исследование образцов вакцины и определение воспроизводимости метода

Были получены четыре партии образцов инактивированной вакцины против гепатита А, как описано в китайском патенте ZL 0210685.9. Указанные образцы 6 раз исследовали описанным в Примере 6 методом, используя набор для определения, описанный в Примере 8. Определенное содержание НСР клеток Vero приведено в Таблице 11, причем средний CV составил 6,2%, что указывает на хорошую воспроизводимость метода.

Таблица 11. Концентрация НСР клеток Vero в образцах вакцины   Уравнение регрессии для стандарта Концентрация НСР клеток Vero (нг/мл) Образец из первой партии вакцины Образец из второй партии вакцины Образец из третьей партии вакцины Образец из четвертой партии вакцины Экспери
мент 1 y=1,063x+10,497
R²=0,999 384 401 328 223 Экспери
мент 2 y=1,0665x+9,0876
R²=0,9986 380 342 292 242 Экспери
мент 3 y=1,2742x-32,471 R²=0,999 364 371 262 221 Экспери
нт 4 y=1,6439x-5,9769 R²=0,9976 376 415 284 224 Экспери
мент 5 y=1,3581x-38,712 R²=0,9951 389 427 292 250 Экспери
мент 6 y=1,299x-11,772 R²=0,9988 403 419 277 246 Среднее (нг/мл) 382 395 289 234 CV (%) 3,4 8,3 7,7 5,5

Пример 13. Сравнение метода определения общего содержания белка в образцах вакцины с методом определения НСР клеток Vero

Общее содержание белка в указанных выше образцах четырех партий вакцины определяли с использованием метода Лоури, результаты сравнивали с данными определения НСР клеток Vero в образцах инактивированной вакцины против гепатита А, полученных в клетках Vero. Результаты опыта показали, что настоящее изобретение как средство определения и контроля качества инактивированных вакцин против гепатита А, получаемых в клетках Vero, является более направленным по сравнению с косвенным контролем качества методом определения общего белка в вакцине. Таким образом, могут быть ужесточены критерии качества образцов вакцины, что тем самым обеспечит более высокий уровень безопасности вакцин.

Таблица 12. Сравнение результатов двух методов определения   Образец из первой партии вакцины Образец из второй партии вакцины Образец из третьей партии вакцины Образец из четвертой партии вакцины Общее содержание белка (мкг/мл) 3,3 2,4 2,2 1,5 НСР клеток Vero (нг/мл) 382 395 289 234

Пример 14. Определение отношения измеренного содержания НСР к теоретическому

С использованием набора для анализа, описанного в Примере 8, по методу, описанному в Примере 6, одновременно были исследованы разведения стандарта НСР, разбавленные образцом вакцины из 3 партии (после двойного разведения), и разведения стандарта НСР, разбавленные PBS-T. Отношение измеренного содержания НСР к теоретическому в образце вакцины составило в среднем 96% (см. Таблицы 13 и 14), что указывает на отсутствие какого-либо влияния веществ из образца вакцины на специфичность метода обнаружения НСР по настоящему изобретению.

Таблица 13. Результаты определения стандарта выделенных при лизисе клеток Vero белков (НСР) и образца вакцины (разведение в два раза) Содержание стандарта НСР (нг/мл) 62,5 125 250 500 1000 2000 4000 Образец вакцины(нг/мл) 133 OD_{450 нм} 0,057 0,100 0,217 0,396 0,880 1,623 3,135 Образец вакцины OD_{450 нм} 0,130

Таблица 14. Определение отношения измеренного содержания НСР к теоретическому   Разбавленный образцом вакцины стандарт (133 нг/мл) Значение OD 0,261 0,311 0,401 0,578 0,940 1,664 3,214 Результат определения содержания НСР (нг/мл) 183 246 361 586 1048 2088 3946 Теоретическое содержание НСР (нг/мл) 194 255 378 624 1116 2099 4066 Отношение измеренного содержания НСР к теоретическому (%) 94,3 96,7 95,6 93,9 93,9 99,5 97,0

Настоящее изобретение не ограничено конкретными приведенными здесь вариантами. Приведенные примеры предназначены только для иллюстрации отдельных аспектов изобретения. Функционально эквивалентные методы и компоненты подпадают под настоящее изобретение. Различные модификации изобретения, в дополнение к приведенным и описанным здесь, очевидны специалисту в данной области из вышеизложенного описания и сопровождающих чертежей. Такие модификации подпадают под Формулу изобретения. Все приведенные выше ссылки включены в настоящее изобретение в полном объеме

Группа изобретений относится к области биотехнологии и касается способа получения белков, выделенных при лизисе клеток Vero, включающего следующие стадии: культивирование и сбор клеток Vero; разрушение и лизис клеток Vero; очистку выделенных при лизисе клеток Vero белков путем гидрофобной хроматографии на фенилсефарозе 6FF, эксклюзивную хроматографию на сефарозе, элюцию, концентрирование, выделенные белки представляют собой смесь белков с молекулярными массами 11 кДа, 17-34 кДа, 55 кДа и 72-170 кДа. Выделенные при лизисе клеток Vero белки, полученные по настоящему изобретению, имеют широкий спектр применения. Они могут быть использованы для контроля и анализа качества в ходе получения вакцин с применением клеток Vero при высокой чувствительности и хорошей воспроизводимости метода. В настоящем изобретении также предусмотрен набор для анализа НСР клеток Vero, характеризующийся высокой специфичностью, высокой чувствительностью и хорошей воспроизводимостью. Набор может быть использован для контроля и анализа качества в ходе получения не только не секретируемых вирусных вакцин против таких вирусов, как вирус гепатита А, но и других вакцин, получаемых с применением клеток Vero. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 14 табл., 14 пр., 6 ил.

1. Способ получения белков, выделенных при лизисе клеток Vero, включающий следующие стадии:
а) культивирование и сбор клеток Vero;
б) разрушение и лизис клеток Vero;
в) очистка белков, выделенных при лизисе клеток Vero, и
г) концентрирование белков, полученных при лизисе клеток Vero, для чего образец, полученный после стадии очистки, подвергают ультрафильтрации с использованием мембраны с пределом исключения по молекулярным массам MWCO=100 кДа и концентрированию в пробирках с мембраной, имеющей предел исключения MWCO=100 кДа;
д) очистка концентрата, полученного на стадии «г» гидрофобной хроматографией на фенилсефарозе 6FF, которую проводят следующим образом: образец наносят на колонку в буфере нанесения при скорости 30-60 см/ч, затем колонку промывают 3 CV (объемами колонки) 1,0 моль/л РВ раствора с pH 6,0-7,5, после чего белки линейно элюируют 5 CV 0,02 моль/л РВ раствора с pH 6,0-7,5 и, наконец, собирают элюированные фракции с проводимостью ниже 48 мСм/см; указанная эксклюзионная хроматография представляет собой эксклюзионную хроматографию на сефарозе Sepharose 4 Fast Flow, причем элюцию проводят с использованием 0,01 моль/л раствора PBS с pH 7,4 при скорости потока 45 см/ч, при элюции собирают второй пик.

2. Способ по п.1, где разрушение и лизис клеток включает химический лизис клеток, разрушение клеток осмотическим шоком, повторяющееся замораживание и размораживание, ферментативный лизис клеток, ультразвуковое разрушение и механический лизис клеток.

3. Способ по п.2, где разрушение и лизис клеток представляет собой ультразвуковое разрушение.

4. Способ по п.1, в котором очистка включает стадию предварительной очистки экстракцией органическим растворителем.

5. Способ по п.4, где экстракция органическим растворителем включает добавление к раствору, полученному после разрушения клеток, равного объема трихлорметана, встряхивание смеси в течение 20 минут, центрифугирование смеси при 4000 об/мин при температуре 2-8°C в течение 20 минут и отбор верхней водной фазы, содержащей белки.

6. Способ по п.1, где вирус и его компоненты являются вирусом гепатита A и его компонентами.

7. Выделенные при лизисе клеток Vero белки, полученные методом по любому из пп.1-6.

8. Выделенные при лизисе клеток Vero белки по п.7, представляющие собой смесь белков с молекулярными массами в следующих пределах: 11 кДа, 17-34 кДа, 55 кДа и 72 кДа - 170 кДа.

9. Применение выделенных при лизисе клеток Vero белков по п.7 для получения реагента для обнаружения НСР клеток Vero.

10. Набор для анализа НСР клеток Vero, включающий твердую фазу, антитела в твердой фазе, конъюгированные с лигандом антитела, и белки-стандарты, где указанные антитела представляют собой антитела против белков, выделенных при лизисе клеток Vero, а указанные белки-стандарты представляют собой выделенные при лизисе клеток Vero белки, полученные методом по любому из пп.1-6.

11. Набор для анализа НСР клеток Vero по п.10, дополнительно содержащий модифицированные биотином антитела и конъюгированный с лигандом авидин.

12. Набор для анализа НСР клеток Vero по п.10, дополнительно содержащий антитела, модифицированные 2,4-динитрофенолом, и конъюгированные с лигандом антитела против 2,4-динитрофенола.

13. Набор для анализа НСР клеток Vero по любому из пп.10-12, где антитела к белкам, выделенным при лизисе клеток Vero, представляют собой IgG морской свинки против белков, выделенных при лизисе клеток Vero, или IgG кролика против белков, выделенных при лизисе клеток Vero.

14. Набор для анализа НСР клеток Vero по любому из пп.10-12, где метка в указанных конъюгированных с лигандом антителах представляет собой фермент, нуклид или является флуоресцентной меткой.

15. Набор для анализа НСР клеток Vero по любому из пп.10-12, где фермент выбран из пероксидазы, β-D-галактозидазы, щелочной фосфатазы или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

16. Набор для анализа НСР клеток Vero по любому из пп.10-12, где указанный нуклид выбран из ³H, ¹⁸⁸Re или ¹³¹I.

17. Набор для анализа НСР клеток Vero по п.14, где флуоресцентная метка выбрана из изотиоцианата флуоресцеина, тетраэтилродамина, изотиоцианата тетраметилродамина или хелатов трехвалентных лантаноидов.

18. Набор для анализа НСР клеток Vero по любому из пп.10-12, где твердая фаза представляет собой планшет для ИФА или носитель для белкового чипа.