НОВЫЕ АНАЛОГИ ИНСУЛИНА С ПОВЫШЕННЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ ЦИНКА Российский патент 2004 года по МПК A61K38/28 A61P3/10 C12N15/17 

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).

Изобретение относится к медицине, точнее к аналогам инсулина. Группа изобретений раскрывает способы получения аналогов инсулина, их применение, в частности, в фармацевтических препаративных формах для лечения сахарного диабета типа I, а также типа II. Технический результат: новые аналоги инсулина обладают повышенной способностью связывания цинка, а также к их устойчивым комплексам с цинком, которые по сравнению с человеческим инсулином обладают замедленным профилем действия. 20 с. и 40 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль формулы I

где (A1-A5) обозначают аминокислотные остатки в положениях А1 по А5 А-цепи человеческого инсулина или инсулина животного;

(А15-А19) обозначают аминокислотные остатки в положениях с А15 по А19 А-цепи человеческого инсулина или инсулина животного;

(В8-В18) обозначают аминокислотные остатки в положениях с В8 по В18 В-цепи человеческого инсулина или инсулина животного;

(В20-В29) обозначают аминокислотные остатки в положениях с В20 по В29 В-цепи человеческого инсулина или инсулина животного;

R8 обозначает Thr или Аlа;

R9 обозначает Ser или Gly;

R10 обозначает Ilе или Val;

R14 обозначает Туr, His, Asp или Glu;

R21 обозначает Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu или Gln;

R1 обозначает Phe, His, Asn, Asp или Gly;

R2 обозначает Val, Ala или Gly;

R3 обозначает Asn, His, Glu или Asp;

R4 обозначает Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly или Glu;

R30 обозначает Thr, Ala или Ser;

Z обозначает атом водорода или пептидный остаток с 1 до 4 генетически кодируемыми аминокислотными остатками, содержащий от 1 до 4 гистидиновых остатка (His);

при условии, что в случае, когда Z означает атом водорода, R1 или R3 означает His, Glu или Asp, при этом R3 означает His, если R1 обозначает нейтральный или отрицательно заряженный аминокислотный остаток, или при условии, что в случае, когда Z означает атом водорода, R14 означает His, Asp или Glu, и далее при условии, что аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль формулы I отличается не только путем вариаций аминокислотных остатков в положениях R3 или R3 в сочетании с R21 или R3 в сочетании с R4 в формуле I человеческого инсулина.

2. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по п.1, отличающиеся тем, что R8 означает Thr, R9 означает Ser и R10 означает Ile.3. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по п.1 или 2, отличающиеся тем, что R21 означает Asn и R1 означает Phe.4. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по одному или более пп.1-3, отличающиеся тем, что R2 означает Val, R3 означает Asn и R3 означает Gln.5. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по одному или более пп.1-4, отличающиеся тем, что R14 означает Туr.6. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по одному или более пп.1-4, отличающиеся тем, что R14 означает His.7. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по одному или более пп.1-4, отличающиеся тем, что R14 означает Asp.8. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по одному или более пп.1-4, отличающиеся тем, что R14 означает Glu.9. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по одному или более пп.1-8, отличающиеся тем, что R30 означает Thr.10. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по одному или более пп.1-8, отличающиеся тем, что R30 означает Аlа.11. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по одному или более пп.1-8, отличающиеся тем, что R30 означает Ser.12. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по одному или более пп.1-11, отличающиеся тем, что Z означает His.13. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по одному или более пп.1-11, отличающиеся тем, что Z означает His-Ala-.14. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по одному или более пп.1-11, отличающиеся тем, что Z означает His-Ala-Ala-.15. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по п.12, отличающиеся тем, что В-цепь содержит последовательность

His Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

(SEQ ID №: 3).

16. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по п.12, отличающиеся тем, что В-цепь содержит последовательность

His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

(SEQ ID №: 4).

17. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по п.13, отличающиеся тем, что В-цепь содержит последовательность

His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leа Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

(SEQ ID №: 5).

18. Аналог инсулина или его физиологически приемлемая соль по п.14, отличающиеся тем, что В-цепь содержит последовательность

His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

(SEQ ID №: 6).

19. Аналог инсулина и/или его физиологически приемлемая соль по одному или более пп.1-18 для получения фармацевтической препаративной формы, обладающей инсулиновой активностью с замедленным наступлением действия.20. Способ получения аналога инсулина или его физиологически приемлемой соли по пп.1-21, включающий построение способного к воспроизведению экспрессионного вектора, который содержит последовательность ДНК, которая кодирует предшественник аналога инсулина с общей аминокислотной последовательностью II

Met-X2m

-(Arg)_p-Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B29)-R30-X1n-Arg-(А1-А5)-Cys-Cys-R8-Ser-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(А15-А19)-Cys-R21 II,

где Х1n

означает пептидную цепь с n аминокислотными остатками, причем n означает целое число от 0 до 34;

Х2m

означает пептидную цепь с m аминокислотными остатками, причем m означает целое число от 0 до 20;

р=0, 1 или 2;

R30 означает Thr, Ala или Ser;

Z отсутствует или означает пептидный остаток с 1 до 4 способных генетически кодироваться аминокислотных остатков, содержащих от 1 до 4 гистидиновых остатка (His)

и имеют любые указанные в п.1 значения, причем имеют место также указанные в п.1 ограничения; экспрессию в клетке-хозяине и высвобождение аналога инсулина из его предшественника химическими и ферментативными методами, при этом клеткой–хозяином является бактерия E.coli или дрожжевая клетка Saccharomyces cerevisiae.

21. Способ по п.20 для получения аналога инсулина по п.16, отличающийся тем, что предшественник аналога инсулина имеет последовательность

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala

Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

(SEQ ID №:7).

22. Способ по п.20 или 21 для получения аналога инсулина по п.17, отличающийся тем, что предшественник аналога инсулина имеет последовательность

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala

Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

(SEQ ID №: 8).

23. Способ по п.20 или 21 для получения аналога инсулина по п.18, отличающийся тем, что предшественник аналога инсулина имеет последовательность

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val

Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala

Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys

Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

(SEQ ID №: 9).

24. Предшественник аналога инсулина, имеющий аминокислотную последовательность II

Met-X2m

-(Arg)_p-Z-Rl-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B29)-R30-X1n-Arg-(Al-A5)-Cys-Cys-R8-Ser-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21 II,

где X1n

, X2m, p, R30 и Z имеют указанные в п.20 значения.

25. Предшественник аналога инсулина с общей аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID №: 7.

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala

Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn.

26. Предшественник аналога инсулина с общей аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID №: 8:

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys

Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala

Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr

Cys Asn.

27. Предшественник аналога инсулина с общей аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID № 9:

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val

Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly GInVal Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala

Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys

Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn.

28. Последовательность ДНК, кодирующая предшественник аналога инсулина, имеющая нуклеотидную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности предшественника аналога инсулина по п.24.29. Последовательность ДНК, кодирующая предшественник аналога инсулина, имеющая нуклеотидную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности предшественника аналога инсулина по п.25.30. Последовательность ДНК, кодирующая предшественник аналога инсулина, имеющая нуклеотидную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности предшественника аналога инсулина по п.26.31. Последовательность ДНК, кодирующая предшественник аналога инсулина, имеющая нуклеотидную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности предшественника аналога инсулина по п.27.32. Экспрессионный вектор, содержащий последовательность по п.28, оперативно связанную с регуляторными последовательностями.33. Экспрессионный вектор, содержащий последовательность по п.29, оперативно связанную с регуляторными последовательностями.34. Экспрессионный вектор, содержащий последовательность по п.30, оперативно связанную с регуляторными последовательностями.35. Экспрессионный вектор, содержащий последовательность по п.31, оперативно связанную с регуляторными последовательностями.36. Штамм E.coli K12 W31110, продуцирующий предшественник аналога инсулина и трансформированный в эксперссионном векторе, выбранном из векторов по одному из пп.32-35.37. Фармацевтическая препаративная форма, содержащая по меньшей мере один аналог инсулина и/или по меньшей мере одну его физиологически приемлемую соль по одному из пп.1-18 в количестве 40-100 U/мл ИЕ инсулина.38. Фармацевтическая препаративная форма по п.37, отличающаяся тем, что она содержит аналог инсулина и/или его физиологически приемлемую соль в растворенной, аморфной и/или кристаллической форме.39. Фармацевтическая препаративная форма по п.37 или 38, отличающаяся тем, что она содержит дополнительно вспомогательное депонирующее вещество.40. Фармацевтическая препаративная форма по п.39, отличающаяся тем, что вспомогательным депонирующим веществом является протаминсульфат, причем аналог инсулина и/или его физиологически приемлемая соль представлены в форме сокристаллизата с протаминсульфатом.41. Фармацевтическая препаративная форма по одному или более пп.37-40, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит немодифицированный человеческий инсулин.42. Фармацевтическая препаративная форма по п.37 или 41, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит аналог инсулина.43. Фармацевтическая препаративная форма по п.42, отличающаяся тем, что аналогом инсулина является Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32) - человеческий инсулин.44. Раствор для инъекций с активностью инсулина, содержащий фармацевтическую препаративную форму по одному или более пп.37-43 в растворенной форме.45. Раствор для инъекций по п.44, отличающийся тем, что он содержит от 1 мкг до 2 мг цинка на 1 мл.46. Раствор для инъекций по п.45 отличающийся тем, что он содержит от 5 до 200 мкг цинка на 1 мл.47. Инсулино-цинковый комплекс, содержащий инсулиновый гексамер и от 4 до 10 ионов цинка на гексамер инсулина, отличающийся тем, что гексамер инсулина состоит из шести молекул аналога инсулина формулы I

где (A1-A5) обозначают аминокислотные остатки в положениях с А1 по А5

А-цепи человеческого инсулина или инсулина животного;

(A15-A19) - обозначают аминокислотные остатки в положениях с А15 по А19 А-цепи человеческого инсулина или инсулина животного;

(В8-В18) обозначают аминокислотные остатки в положениях с В8 по В18 В-цепи человеческого инсулина или инсулина животного;

(В20-В29) обозначают аминокислотные остатки в положениях с В20 по В29 В-цепи человеческого инсулина или инсулина животного;

R8 обозначает Thr или А1а;

R9 обозначает Ser или Gly;

R10 обозначает Ilе или Val;

R14 обозначает Туг, His, Asp или Glu;

R21 обозначает Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu или Gin;

R1 обозначает означает любой способный генетически кодироваться аминокислотный остаток, отсутствует или обозначает атом водорода;

R2 обозначает Val, Ala или Gly;

R3 обозначает Asn, His, Glu или Asp;

R4 обозначает Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gin, Gly или Glu;

R30 обозначает любой способный генетически кодироваться аминокислотный остаток или -ОН;

Z обозначает атом водорода или пептидный остаток с 1 до 4 способными генетически кодироваться аминокислотными остатками, содержащий от 1 до 4 гистидиновых остатка (His).

48. Инсулиноцинковый комплекс по п.47, содержащий от 5 до 8 ионов цинка на гексамер инсулина.49. Инсулиноцинковый комплекс по п.47 или 48, отличающийся тем, что гексамер инсулина состоит из шести молекул аналога инсулина формулы I по одному или более пп.1-18.50. Инсулиноцинковый комплекс по п.47 или 48, отличающийся тем, что В-цепь аналога инсулина формулы I содержит последовательность Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

(SEQ ID №: 10).

51. Инсулиноцинковый комплекс по п.47 или 48, отличающийся тем, что В-цепь аналога инсулина формулы I содержит последовательность

Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

(SЕQ ID №: 11).

52. Инсулиноцинковый комплекс по одному или более пп.47-51 для получения фармацевтической препаративной формы, обладающей активностью инсулина с замедленным наступлением действия.53. Фармацевтическая препаративная форма, содержащая по меньшей мере один инсулиноцинковый комплекс по одному или более пп.47-51.54. Фармацевтическая препаративная форма, содержащая кислый раствор по меньшей мере одного аналога инсулина по одному или более пп.47-51 и/или его физиологически приемлемой соли с соответствующим количеством ионов цинка, обеспечивающим образование инсулиноцинкового комплекса по одному или более пп.47-51.55. Фармацевтическая препаративная форма по п.54, содержащая кислый раствор аналога инсулина и/или его физиологически приемлемой соли по одному или более пп.1-18 с соответствующим количеством ионов цинка, обеспечивающим образование инсулиноцинкового комплекса по п.49.56. Фармацевтическая препаративная форма по п.54, содержащая кислый раствор по меньшей мере одного аналога инсулина по п.50 или 51 и/или его физиологически приемлемой соли с соответствующим количеством ионов цинка, обеспечивающим образование инсулиноцинкового комплекса по п.50 или 51.57. Фармацевтическая препаративная форма по одному или более пп.53-56, отличающаяся тем, что она содержит инсулиноцинковый комплекс в растворенной, аморфной и/или кристаллической форме.58. Раствор для инъекций с активностью инсулина, содержащий фармацевтическую препаративную форму по п.57 в растворенной форме.59. Раствор для инъекций по п.58, отличающийся содержанием от 1 мкг до 2 мг цинка на 1 мл.60. Раствор для инъекций по п.59, отличающийся тем, что он содержит от 5 до 200 мкг цинка на 1 мл.