СПОСОБ КОНТРОЛЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ДИСБАКТЕРИОЗОВ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к микробиологическому производству и может быть использовано при контроле биологической активности препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов (пробиотиков) медицинского и ветеринарного назначения.

Известно, что одним из показателей специфической активности пробиотиков (колибактерин, бификол, лактобактерин и др.) и производственных штаммов бактерий для их изготовления является наличие антагонистического действия в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Антагонистическую активность пробиотиков и бактериальных штаммов определяют in vitro регламентированными способами, которые включают совместное культивирование с тест-культурами в жидкой или на плотной питательной среде. Наиболее распространен способ отсроченного антагонизма, когда, подсев тест-штаммов на плотную питательную среду проводится через определенный период после посева испытуемой культуры. Подсев тест-штаммов, в качестве которых используют патогенные и условно-патогенные культуры шигелл, стафилококков, протея и др., проводят в виде перпендикулярных штрихов к выросшей испытуемой культуре. Антагонистическая активность последней количественно характеризуется величиной зоны подавления роста каждого тест-штамма, измеряемой в мм (ФС 42-3365-97 "Колибактерин сухой").

Недостатком данного способа контроля антагонистической активности является использование большого количества патогенных и условно-патогенных бактериальных штаммов, работа с которыми трудоемка и требует специальных условий.

Сущность изобретения заключается в следующем. Развитие in vitro на плотной питательной среде бактериальной культуры, обладающей антагонистической активностью, сопровождается диффузией комплекса метаболитов, продуцируемых в процессе роста в окружающую среду, которая специфически изменяется и становится непригодной для развития других популяций. В искусственно созданных условиях проявление антагонистической активности бактериальной культуры, в зависимости от таксономической принадлежности тест-штаммов, выражается в виде гетеро-, гомо- или изоантагонизма. Оценка антагонистической активности может быть основана на определении любой ее составляющей или их совокупности. Изоантагонизм представляет собой подавляющее влияние продуктов метаболизма на развитие того же штамма бактерий. Для определения гетеро- и гомоантагонизма, пробиотиков не обязательно использовать патогенные и условно-патогенные штаммы бактерий. Широкая номенклатура пробиотиков и, соответственно, принадлежность производственных штаммов для их изготовления к различным таксономическим группам позволяют применять их в качестве тест-культур для взаимного определения гетеро- и (или) гомоантагонизма in vitro. Предлагаемый способ позволяет объективно оценить антагонистическую активность по отдельным составляющим или их совокупности и исключить использование патогенных и условно-патогенных тест-штаммов при контроле данного показателя пробиотиков.

Достигаемый технический результат заключается в упрощении и удешевлении способа контроля и снижении трудоемкости, связанной с ведением и подготовкой тест-штаммов к проведению исследования антагонистической активности (см. табл. 1 в конце описания).

При осуществлении способа могут быть использованы обычные регламентированные условия проведения теста отсроченного антагонизма для каждого пробиотика или производственного штамма, включая продолжительность культивирования испытуемой культуры и время подсева тест-штаммов. Подготовка тест-штаммов заключается в растворении физиологическим раствором сухой биомассы пробиотика или производственного штамма с последующим разведением бактериальной взвеси до рекомендованной концентрации микробных клеток.

Пример 1. Определение антагонистической активности колибактерина.

Сухую биомассу колибактерина (на основе штамма E.coli М-17) в ампуле или флаконе растворяют 0,85% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на одну дозу препарата. Полученную взвесь высевают штрихом по диаметру чашки Петри бактериологической петлей на плотную питательную среду Гаузе N 2. После (48 ± 4) ч инкубации при температуре (37 ± 1)^oC перпендикулярно к выросшей культуре 3 - 4 штрихами подсевают изогенную культуру штамма E.coli М-17 (концентрация взвеси составляет 5 • 10⁸ кл/мл). Учет результатов проводят через (20±4) ч инкубирования при температуре (37 ± 1)^oC по величине зон угнетения роста тест-культуры. Показатель угнетения роста тест-культуры во всех штрихах-посевах составляет (и должен составлять) не менее 15 мм.

Пример 2. Определение антагонистической активности лактобактерина.

Сухую биомассу лактобактерина (на основе штамма L.plantarum 8Р-А3) в ампуле или флаконе растворяют физиологическим раствором из расчета 1 мл на одну дозу препарата. Полученную взвесь высевают штрихом по диаметру чашки Петри на плотную питательную среду МРС - 5. После (96 ± 4) ч инкубации при температуре (37 ± 1)^oC перпендикулярно к выросшей культуре подсевают изогенную культуру штамма L.plantarum 8Р-А3, гомогенную культуру штамма L.fermentum 90Т-С4 и гетерогенную культуру штамма E.coli М-17 (концентрация взвесей каждой из культур составляет 10⁸ кл/мл). Учет результатов проводят через (36 ± 12) ч инкубирования при температуре (37 ± 1)^oC по величине зон угнетения роста тест-культур. Показатель угнетения роста во всех штрих-посевах составляет (и должен составлять) не менее 20 мм.

Сравнительные результаты антагонистической активности колибактерина и бификола по отношению к различным тест-штаммам приведены в табл. 2. Представленные данные свидетельствуют о сопоставимости показателей антагонистической активности испытуемых культур по отношению к патогенным и непатогенным тест-штаммам.

Таким образом, предлагаемый способ, не уступая известному по информативности, позволяет сократить количество тест-штаммов, исключить работу с патогенными культурами и снизить затраты на проведение исследования.

Изобретение относится к области медицины. Сущность изобретения: предложен способ контроля антагонистической активности препаратов in vitro, исключающий использование патогенных и условно-патогенных тест-штаммов. Определение показателей отсроченного антагонизма на плотной питательной среде включает применение в качестве контрольных изо-, гомо- и гетерогенных бактериальных штаммов, используемых в производстве пробиотических препаратов. Способ обеспечивает упрощение, удешевление и снижение трудоемкости контроля антагонистической активности при исследовании. 2 табл.

Способ контроля антагонистической активности препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов, включающий посев и инкубацию бактерийного препарата на плотной питательной среде с последующим подсевом тест-штаммов и определением зоны задержки их роста, отличающийся тем, что в качестве тест-штаммов используют непатогенные культуры изо-, гомо- и гетерогенных производственных штаммов бактерий, применяемых в производстве препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов.