ШТАММЫ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS LICHENIFORMIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ И ДИСБИОЗОВ И БИОПРЕПАРАТ БИСПОРИН ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ И ДИСБИОЗОВ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Изобретение относится к биотехнологии, и может быть использовано в ветеринарии и медицине для получения биопрепаратов, нормализующих микрофлору и ингибирующих развитие патогенных микроорганизмов.

В настоящее время имеются биопрепараты - пробиотики, нормализующие микрофлору: лактобактерин, ацилакт, бифидумбактерин, колибактерин, бификол, биоспорин, споробактерин (Воробьв А. А. и др. Дисбактериозы - актуальная проблема медицины/ Вестник РАМН - 1997. - 3. - С.3-5).

Однако известные биопрепараты имеют ограниченный спектр действия в следствие слабой антагонистической активности ко многим патогенным бактериям.

Наиболее близким аналогом является препарат биоспорин, содержащий в основе живые клетки штаммов Bacillus subtilis 3 (ВКПМ В-2335) и В. licheniformis 31(ВКПМ В-2336) (Патент РФ 1722502, А 61 К 35/74, опубл. 30.03.92).

Биоспорин характеризуется высокой антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов (Сорокулова И.Б. Сравнительное изучение биологических свойств биспорина и других коммерческих препаратов на основе бацилл /Микробиол. журнал - 1997.- т.59, 6. - С.43-49). Препарат применяют для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека (Приказ Министра здравоохранения РФ 353 от 29.12.1992 г.).

Однако в инструкции по применению биоспорина, утвержденной Минздравом РФ от 14.08.98 г, имеется упоминание о том, что поскольку бактерии штаммов Bacillus высокочувствительны к антибиотикам, то "одновременное применение антибиотиков и химиопрепаратов нецелесообразно". Эти свойства штаммов ограничивают сферу применения препарата при тяжелых формах гнойно-воспалительных заболеваний, лечение которых требует совместного введения пробиотика и антибиотика.

Задачей изобретения является создание новых антибиотикоустойчивых штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis с высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов и получение на их основе высокоэффективного препарата, обладающего более широким спектром антибактериальной активности и который можно будет применять совместно с антибиотиками.

Технический результат, полученный от использования новых штаммов, выражается в повышении эффективности лечения за счет расширения спектра антагонистической активности штаммов и возможности сочетанного применения пробиотика с антибиотиками.

Сущность изобретения заключается в следующем:
Новые штаммы бактерий Bacillus subtilis3/Re и Bacillus licheniformis31/Re получены путем многократного пересева штаммов В.subtilis 3 и B.licheniformis 31 через питательный агар с возрастающей концентрацией антибиотиков. Штаммы бактерий Bacillus subtilis3/Re и Bacillus licheniformis31/Re депонированы в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.И. Тарасевича под номерами ГКПМ 263 и ГКПМ 264 соответственно.

Штаммы обладают устойчивостью к ампицилину, метициллину, оксациллину, бензилпенициллину, моксалактаму, цефоперазону, цефотаксиму, моксалактаму, цефтазидиму, цефтизоксиму, цефуроксиму, цефтриаксону, ваккомицину, клиндамицину, пиперациллину, моксалактаму, полимиксину Е, хлорамфеникону и азтреонаму.

Культурально-морфологические и биохимические свойства штаммов B.subtilis ГКПМ 263 и B. licheniformis ГКПМ 264 в сравнении с исходными представлены в табл. 1.

Сравнительные данные по антибиотикочувствительности и антагонистической активности штаммов B. subtilis ГКПМ 263 и B.licheniformis ГКПМ 264 представлены в табл. 2 и 3 соответственно, и свидетельствуют, что новые штаммы обладают высокой антибиотикоустойчивостью и антагонистической активностью.

Биопрепарат Биспорин для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиозов содержит живые штаммы бактерий Bacillus subtilis ГКПМ 263, Bacillus licheniformis ГКПМ 264, взятые в эффективном количестве, и защитную среду.

В качестве защитной среды препарат может содержать сыворотку крови, молоко, сахарозо-желатиновую смесь и т.д.

Оптимальным соотношением бактериальных культур В.subtilis ГКПМ 263 и В. licheniformis ГКПМ 264 для получения препарата Биоспорин является (в об.%) - 50: 50 при количестве живых микробных клеток 4•10⁷ - 1,6•10¹⁰ кл/мл (для В. subtilis ГКПМ 263) и 2•10⁶ - 3•10⁹ кл/мл (для В. licheniformis ГКПМ 264).

Препарат Биспорин характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и может применяться совместно с антибиотиками.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Готовят серии препарата Биспорин с различным количеством бактерий. Для этого штаммы бактерий В. subtilis ГКПМ 263 и В. licheniformis ГКПМ 264 выращивают раздельно на сусло агаре в течение 36 часов при температуре 37^oС. Смывают выросшие бактериальные культуры физиологическим раствором, рассчитывают по оптическому стандарту мутности (ОЕ - оптических единиц) количество микробных клеток в 1 мл суспензии.

Затем готовят ассоциации этих двух микробных культур в защитной среде, например, в сахарозо-желатиновой смеси, с вариированием количественного состава микробных клеток каждого штамма.

Проверяют антагонистическую активность полученных препаратов методом отсроченного антагонизма. В табл. 4 представлены данные о составе некоторых вариантов изготовленного препарата (бактериальные суспензии В. subtilis ГКПМ 263 и В. licheniformis ГКПМ 264 смешивают в равных объемных пропорциях - 50: 50).

Антагонистическую активность полученных серий биопрепарата Биспорин изучают методом отсроченного антагонизма и методом совместного культивирования с тест-культурами. В качестве тест-культур используют S. sonnei 32, S. typhimurium 11, S. aureus 209 и С. albicans 690.

В табл. 5 представлены данные об антагонистической активности полученных серий препарата Биспорин.

Как видно из полученных данных, оптимальные количества живых микробных клеток в 1 мл составляют для В.subtilis ГКПМ 263 - 4•10⁷ - 1,6•10¹⁰ кл/мл и для В. licheniformis ГКПМ 264 - 2•10⁶ - 3•10⁹ кл/мл живых микробных клеток. Дальнейшее увеличение количества живых микробных клеток не изменяет существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.

Представленные закономерности отмечают при соотношении бактериальных культур 50:50. Были испытаны также и другие соотношения В. subtilis ГКПМ 263 и В. licheniformis ГКПМ 264 при количестве живых микробных клеток в 1 мл исходной суспензии соответственно 4•10⁷ -1,6•10¹⁰ кл/мл и 2•10⁶ - 3•10⁹ кл/мл. Изготовляют различные варианты препарата и их активность исследуют при совместном культивировании с тест-культурами. Данные, полученные в этой серии опытов со штаммом S. aureus 209, представлены в табл. 6.

Как видно из табл. 6, наиболее оптимальным сочетанием культур В. subtilis ГКПМ 263 и В. licheniformis ГКПМ 264 является их соотношение 50:50 (в об. %). При такой пропорции культур регистрируется наиболее быстрая элиминация стафилококков. Сходные закономерности отмечают при испытании этих вариантов препарата на других тест - культурах.

Таким образом, установлено, что оптимальным соотношением бактериальных культур В. subtilis ГКПМ 263 и В. licheniformis ГКПМ 264 для получения препарата Биоспорин является (в об.%) - 50:50 при количестве живых микробных клеток 4•10⁷ - 1,6•10¹⁰ кл/мл (для В. subtilis ГКПМ 263) и 2•10⁶ - 3•10⁹ кл/мл (для В. licheniformis ГКПМ 264).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине для получения биопрепаратов, нормализующих микрофлору и ингибирующих развитие патогенных микроорганизмов. Новые штаммы бактерий Bacillus subtilis3/Re и Bacillus licheniformis31/Re получены путем многократного пересева штаммов B.subtilis 3 и В.licheniformis 31 через питательный агар с возрастающей концентрацией антибиотиков. Штаммы бактерий Bacillus subtilis3/Re и Bacillus licheniformis31/Re депонированы в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.И.Тарасевича под номерами ГКПМ 263 и ГКПМ 264 соответственно. Биопрепарат Биспорин содержит живые штаммы бактерий Bacillus subtilis ГКПМ 263, Bacillus licheniformis ГКПМ 264, взятые в эффективном количестве, и защитную среду. Оптимальным соотношением бактериальных культур В. subtilis ГКПМ 263 и В. licheniformis ГКПМ 264 (в об.%) - 50: 50 при количестве живых микробных клеток 4•10⁷ - 1,6•10¹⁰ кл/мл (для В. subtilis ГКПМ 263) и 2•10⁶ - 3•10⁹ кл/мл (для В. licheniformis ГКПМ 264). Препарат Биспорин характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и может применяться совместно с антибиотиками. 3 с. и 2 з.п.ф-лы, 6 табл.

1. Штамм бактерий Bacillus subtilis ГКПМ №263, используемый для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиозов.2. Штамм бактерий Bacillus licheniformis ГКПМ №264, используемый для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиозов.3. Биопрепарат для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиозов, содержащий живые штаммы бактерий Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis и защитную среду, отличающийся тем, что из штаммов Bacillus subtilis он содержит штамм Bacillus subtilis ГКПМ №263, а из штаммов Bacillus licheniformis - штамм Bacillus licheniformis ГКПМ №264, взятые в эффективном количестве.4. Биопрепарат по п.3, отличающийся тем, что содержит штамм Bacillus subtilis ГКПМ №263 и штамм Bacillus licheniformis ГКПМ №264 в титрах 4·10⁷-1,6·10¹⁰ кл/мл и 2·10⁶-3·10⁹ кл/мл соответственно.5. Биопрепарат по п.3, отличающийся тем, что содержит штаммы, взятые в равных объемных соотношениях.