ПРОБИОТИК ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И КОРРЕКЦИИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦЫ Российский патент 2022 года по МПК A61K35/741 A61P1/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, в частности к средствам для профилактики и коррекции колибактериоза и других желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птицы.

Препараты для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) имеют различную природу и состав, обеспечивающий позитивное воздействие на микробиоту животных (Markowia P., Ślfcewska K. The role of probiotics, prebiotics and synbiotics in animal nutrition. Gut Pathog. 2018, 10:21). Наиболее известен колисодержащий моновидовой пробиотический препарат «Колибактерин», содержащий в 1 дозе не менее 10¹⁰ живых клеток Escherichia coli M-17, лиофилизированных в среде культивирования (Авторское свидетельство №189128 опубл. 17.11.1966). Лечебное действие обусловлено антагонистической активностью кишечной палочки в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, включая шигеллы, сальмонеллы, протеи и др. Препарат показан при формах дисбактериоза кишечника, протекающих на фоне дефицита нормальных кишечных палочек. Недостатком препарата является то, что он создан на основе штамма М-17, который не в достаточной степени адаптирован к изменившимся современным условиям окружающей среды (появление антибиотикорезистентности и толерантности к бактериоцинам у бактерий - возбудителей кишечных инфекций сельскохозяйственной птицы), а именно, данный штамм теряет свои антагонистические свойства, обладает выраженной чувствительностью к основным антибиотикам и, особенно, к колицинам.

На сегодняшний день наиболее перспективными считаются не моно, а поликомпонентные препараты синбиотического и симбиотического типа. Составы многокомпонентных композиций определяются особенностями используемых микроорганизмов и характером поставленной задачи. «Бификол» представляет собой лиофильно высушенную в среде культивирования микробную массу живых антагонистически активных штаммов бифидобактерий (В. bifidum 1) и кишечной палочки (Е. coli М-17), которые и определяют терапевтический эффект «Бификола» (Фармакопейная статья ФС 42-3268-96 «Бификол сухой»; в книге под ред. В.А. Княжева. Дисбактериозы. Теория и практика. Нижний Новгород, 1999, с. 70-73). По механизму действия этот препарат является многофакторным лечебным средством; обладает антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, включая шигеллы, сальмонеллы, протеи; оказывает корригирующее воздействие на нарушенный микробиоценоз; стимулирует местные репаративные процессы в кишечнике; способствует улучшению пищеварения и обмена веществ; стимулирует естественные факторы защиты.

Комплексный жидкий препарат «Биофлор» содержит биологически активный экстракт из сои, овощей и прополиса, сквашенный по специальной технологии бактериями Е. coli M-17 (Червинец Ю.В., Червинец В.М., Шендеров Б.А. Современные представления о биотехнологическом потенциале симбиотической микробиоты человека. Верхневолжский медицинский журнал. 2018. Т. 17, вып. 1). Недостатком препаратов является то что, что они созданы на основе штамма М-17, который не адаптирован к изменившимся современным условиям окружающей среды (см. выше).

Известен пробиотик лактомикроцикол, используемый для выращивания и откорма бройлерной птицы, содержащий микробную биомассу штаммов бактерий Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 (ВКПМ, В-6253) и Е. coli S5/98 (ВКПМБ В-8564), взятые в соотношении 1:1 (Патент РФ №2268925 опубл. 27.01.2006). Недостатком данного препарата является использование антагонистических микроорганизмов в его составе, которые могут ингибировать действие друг друга.

Перспективным на сегодняшний день считается применение искусственно сконструированных штаммов с множественной продукцией бактериоцинов или комбинированных пробиотических препаратов, сочетающих несколько штаммов с различными свойствами. Так, например, в связи со снижением антагонистических свойств штамма Е. coli Ml7 было предложено восстановить его конкурентоспособность с помощью рекомбинантных плазмид, детерминирующих продукцию двух бактериоцинов (микроцина В5 и колицин EI), а также устойчивость к ним. Показано, что штамм Е. coli, продуцирующий одновременно микроцин и колицин, жизнеспособен в условиях кишечника животных (Патент РФ №2144954 опубл. 27.01.2000).

Сравнение основных характеристик вышеназванных препаратов (моновариантных и поликомпонентных, природных и генно-модифицированных) свидетельствует, что все они, как правило, предназначены для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных, а в качестве прототипа следует рассматривать колибактерин. При этом основным и общим недостатком этих бактерийных препаратов является относительно низкая эффективность воздействия на многие культуры энтеропатогенных бактерий, что свидетельствуете недостаточном спектре и уровне их антагонистической активности.

Задачей, решаемой изобретением, является создание эффективного моновидового симбиотического препарата для профилактики и лечения колибактериоза и других желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц.

Данная задача решается путем получения препарата на основе композиции из двух штаммов-продуцентов бактериоцинов, включая природный штамм Е. coli ЛЭГМ-18 и генно-модифицированный штамм Е. coli ZP с конъюгативным механизмом передачи продукции бактериоцина, выполненной в виде лекарственных форм на основе жидкой или лиофилизированной клеточной биомассы.

Технический результат, обеспечивающий решение задачи, заключается в получении препарата с более выраженным и расширенным спектром антагонистической активности, повышающим эффективность профилактики и лечения колибактериоза и других заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц.

К новым признакам изобретения относятся:

- Наличие в составе препарата композиции из двух штаммов-продуцентов бактериоцинов, включая природный штамм Е. coli ЛЭГМ-18 и генно-модифицированный штамм Е. coli ZP с конъюгативным механизмом передачи продукции бактериоцина;

- Композиция включает объемное соотношение жидких культур штаммов 1:(0,25-4);

- Жидкая культура каждого штамма с содержанием не менее 10⁷ КОЕ/мл;

- Композиция выполнена в виде лекарственных форм на основе жидкой или лиофилизированной клеточной биомассы.

Признаки прототипа, совпадающие с признаками изобретения - моновидовой состав препарата на основе бактерий вида Escherichia coli, обладающих антагонистической активностью и предназначенных для профилактики и лечения колибактериозов и других желудочно-кишечных заболеваний.

Причинно-следственная связь между новыми признаками и техническим результатом.

Получение более эффективного колисодержащего препарата обусловлено сочетанием разных механизмов антагонистической активности используемых штаммов и их биологической совместимости. Высокий уровень антагонистической активности композиции по сравнению с прототипом (колибактерином) позволяет использовать препарат с более низким содержанием клеток (10⁷-10⁸ КОЕ/мл вместо 10⁹-10¹⁰ КОЕ/мл).

Пример 1. Полученные после раздельного культивирования на казеиновом бульоне бактериальные взвеси штаммов Е. coli ЛЭГМ-18 и Е. coli ZP, содержащие по 10⁸ КОЕ/мл, смешивают в соотношении 1:1 и сразу используют в ветеринарной практике. В 1 мл готового жидкого препарата содержится не менее 10⁸ КОЕ/мл.

Пример 2. Штамм Е. coli ЛЭГМ-18 культивируют на казеиново-дрожжевой среде. В полученной взвеси содержится не менее 10⁸ КОЕ/мл. Штамм Е. coli ZP культивируют на казеиновом бульоне. Полученная взвесь содержит не менее 10⁷ КОЕ/мл. Жидкие бактериальные взвеси смешивают в соотношении 1:4 соответственно и сразу используют полученный препарат, содержащий 10⁸ КОЕ/мл, в ветеринарной практике, для профилактики и лечения бактериальной инфекции животных.

Пример 3. Штамм Е. coli ЛЭГМ-18 культивируют на казеиновом бульоне. В полученной взвеси содержится не менее 10⁷ КОЕ/мл. Штамм Е. coli ZP культивируют на казеиново-дрожжевой среде. Полученная взвесь содержит не менее 10⁸ КОЕ/мл. Жидкие бактериальные взвеси смешивают в соотношении 4:1 соответственно и к полученной смешанной культуре добавляют защитную сахарозо-желатиновую среду для лиофилизации в количестве 20% от объема полученной суспензии. Препарат разливают по 2-3 мл во флаконы вместимостью 5-10 мл и подвергают сублимационному высушиванию до остаточной влажности не более 3%. Готовый сухой препарат, содержащий не менее 10⁷ КОЕ/0,2 г, хранится не менее 12 месяцев без потери специфической активности при температуре (6±2)°С. Перед применением препарат ресуспендируют до восстановления первоначального объема.

Штамм Escherichia coli ЛЭГМ-18 ранее выделен из фекалий здорового пациента в 1993 г. на базе ИЭГМ УрО РАН профессором Пшеничновым Р.А. и соавт., первично охарактеризованный и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ЛЭГМ №18 ВКПМ №В-6240). Из-за высокой антагонистической активности штамм был рекомендован для получения колисодержащего препарата (Патент №2065875, конв. Приоритет 19.04.1993). Второй изучаемый штамм Е. coli ZP (N4i рОХ38а Cmr, Gmr) создан Starčič Erjavec M. путем введения в клетки известного пробиотического штамма Е. coli Nissle 1917 конъюгативной плазмиды рОХ38а, несущей colE7-ген. У штамма детектирован более высокий уровень бактериоциногении, и, кроме того, киллинг близкородственных бактерий осуществляется за счет конъюгационно-опосредованной передачи гена колицина Со1Е7 (Starčič Erjavec М., PetkovSek Ž., Kuznetsova M.V., Maslennikova I.L., Žgur-Bertok D. 2015. Strain ŽP - the first bacterial conjugation-based "kill"-"anti-kill" antimicrobial system. Plasm id, 3 (82), 28-34.).

Штаммы E.coli ЛЭГМ-18 и E.coli ZP обладают всеми свойствами, характерными для семейства Enterobacteriaceae, рода Escherichia и является типичным представителем вида Escherichia coli commune. Бактерии представляют собой короткие с округлыми концами подвижные палочки с размерами 0,2 на 1,5 мкм, расположенными в мазке в виде отдельных клеток или небольших скоплений. Грамотрицательные, спор не образуют, капсулы не имеют. На полноценной агаровой среде через 18-20 часов роста при температуре 37°С образуют гладкие, круглые с ровными краями колонии диаметром 2,0-2,5 мм. В жидкой полной среде (мясо-пептонный бульон, казеиновый гидролизат и другие) вызывают равномерное помутнение. При лиофилизации с использованием сахарозо-желатиновой защитной среды штаммы сохраняют жизнеспособность в течение срока хранения (6 месяцев): число жизнеспособных клеток более 50%.

Антагонистическая активность штаммов в отношении ряда представителей условно-патогенных и патогенных микроорганизмов представлена в таблицах 1 и 2. Антагонистическую активность определяли согласно ОФС.1.7.2.0009.15 «Определение специфической активности пробиотиков» методом отсроченного антагонизма на плотной среде. Учитывали величину зоны отсутствия роста тест-штамма, измеренную в миллиметрах (мм). Как видно из табл. 1, штамм Е. coli ЛЭГМ-18 демонстрировал выраженную антагонистическую активность по отношению ко всем протестированным условно-патогенным и патогенным культурам. Наибольшая активность штамма Е. coli ZP проявлялась по отношении Е. coli 231, Salmonella Typhimurium, Proteus mirabilis, P. vulgaris, Klebsiella pneumoniae, и по этому показателю данный штамм заметно превосходил контрольный. Следует отметить, что зоны ингибирования роста тест-штаммов, полученные с использованием смешанной культуры (Е. coli ЛЭГМ-18 + Е. coli ZP), были в большинстве случаев достоверно больше, чем при тестировании моновариантной культуры, включая контрольный пробиотический штамм М-17.

Дополнительно была оценена концентрационнозависимая антагонистическая активность штаммов с использованием метода отсроченного антагонизма в жидкой среде. Антагонизм оценивали по угнетению роста тестовых культур в присутствии метаболитов исследуемых штаммов, содержащихся в культуральной жидкости. Рассчитывали процент угнетения роста тестовых культур, принимая за 100% показатель оптической плотности культуры, выросшей в контрольных лунках без добавления культуральной жидкости (Бухарин О.В., Семенов А.В., Черкасов С.В. // Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. 2010. Т. 12. №4. С. 347-352).

Штамм Е. coli ЛЭГМ-18 в монокультуре (супернатанты получены от культуры в концентрации 10⁹ КОЕ/мл) демонстрировал значительную активность в отношении всех тест-штаммов, при этом уровень антагонизма был существенно выше, чем у контрольного М-17 в большей концентрации (10¹⁰ КОЕ/мл).

В отношении штамма Е. coli ZP следует отметить, что подавление роста культур Е. coli 643, S.Jlexneri и S. aureus составило более 30%. Использование супернатантов двух штаммов (Е. coli ЛЭГМ-18 + Е. coli ZP) в различных соотношениях (исходные культуры в концентрации 10⁸ КОЕ/мл) показало более высокую антагонистическую активность, чем у контрольного штамма M-17 в отношении всех исследованных представителей условно-патогенных и патогенных бактерий.

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, в частности к средствам для профилактики и коррекции колибактериоза и других желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птицы. Симбиотический препарат для профилактики и коррекции желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птицы на основе бактерий Escherichia coli представляет собой композицию из взятых в объемном соотношении 1:(0,25-4) жидких культур штаммов Е. coli ЛЭГМ-18 и Е. coli ZP с содержанием в каждой не менее 10⁷ КОЕ/мл, выполненную в виде лекарственных форм на основе жидкой или лиофилизированной клеточной биомассы. Изобретение обеспечивает получение препарата с выраженным и расширенным спектром антагонистической активности, повышающим эффективность профилактики и лечения колибактериоза и других заболеваний сельскохозяйственных животных и птицы. 3 пр., 2 табл.

Симбиотический препарат для профилактики и коррекции желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птицы на основе бактерий Escherichia coli, отличающийся тем, что представляет собой композицию из взятых в объемном соотношении 1:(0,25-4) жидких культур штаммов Е. coli ЛЭГМ-18 и Е. coli ZP с содержанием в каждой не менее 10⁷ КОЕ/мл, выполненную в виде лекарственных форм на основе жидкой или лиофилизированной клеточной биомассы.