СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИММУНОДЕФИЦИТНОГО СОСТОЯНИЯ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/74 G01N33/68 G01N33/536 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, а именно к исследованию биологических материалов иммунологическими методами. Оно может быть использовано в клинической иммунологии, терапии и других областях медицины в диагностических целях для раннего выявления функциональных нарушений в иммунной системе, сопровождающих иммунодефицитное состояние (ИДС) и часто сопутствующих развитию многих заболеваний, определения показания к иммуномодулирующей терапии.

Ранняя диагностика функциональных нарушений в иммунной системе имеет решающее значение для индивидуальной профилактики развития неспецифических воспалительных заболеваний, рецидивов хронических процессов, подготовки больных к оперативным вмешательствам, отбора контингента для работы в экстремальных условиях. Однако реальные возможности иммунологической оценки состояния организма на ранней стадии иммунодефицитного состояния ограничены отсутствием адекватных способов диагностики.

Для исследования функциональной активности рецепторного аппарата иммунокомпетентных клеток и их дифференцировки в клинической практике широко используется тест розеткообразования. Он обусловлен наличием на поверхности Т-лимфоцитов гликопротеиновой структуры - E-рецептора. Аналогично другим известным представителям типичных поверхностных белков, E-рецептор характеризуется рядом свойств, к которым относятся процессы регулируемого синтеза, экспрессии на мембране клетки, сбрасывания и реабсорбции, а также лигандные свойства, проявляющиеся в способности связывать различные вещества, в данном случае - мембранные структуры эритроцитов барана. Вариации метода розеткообразования позволяют идентифицировать Т-лимфоциты с высоко- и среднеаффинными E-рецепторами и судить о функциональной рецепторной активности иммунокомпетентных клеток.

Известный способ индивидуального подхода к оценке состояния отдельных звеньев иммунитета (Новиков К.Д. и др. Оценка иммунного статуса - Витебск: Медицина. - 1996. - С. 49-55) использует реакцию розеткообразования для выявления иммунодефицита.

Недостатком способа является то, что он не позволяет судить о функциональных изменениях, сопутствующих иммунодефицитному состоянию.

Другим недостатком используемого метода является то, что известный способ диагностирует количественные изменения содержания Т-клеток и выявляет уже сформированные структурные изменения, являющиеся основой развития заболевания, например, структурный иммунодефицит, либо изменения, сопутствующие уже развившемуся заболеванию, не позволяет определить начальные стадии и разные формы иммунодефицитного состояния, что не может дифференцированно определить показания к иммуномодулирующей терапии.

Настоящее изобретение учитывает, что формирование иммунодефицитного состояния не является внезапным процессом, существует этап угрозы развития заболевания, включающий экзогенные и эндогенные факторы риска. Первым этапом развития иммунодефицитного состояния являются функциональные изменения в системе иммунитета. Одной из причин развития иммунодефицитного состояния является угнетение тимической активности. Этому способствуют ряд как экзогенных, так и эндогенных причин, реализующихся на фоне индивидуальных особенностей организма.

Изменения в субпопуляционной структуре лимфоцитов могут быть вызваны действием эндогенных факторов иммунной системы, к которым в первую очередь необходимо отнести изменения уровня чувствительности иммунокомпетентных клеток к действию гормонов тимуса. Существует определенная связь между функциональным состоянием тимуса, динамикой содержания и процессами рециркуляции субпопуляций лимфоцитов.

Целью изобретения является повышение точности диагностики компенсированной и декомпенсированной форм иммунодефицитного состояния на основе изменений, предшествующих развитию заболеваний, ассоциированных с иммунной тимической недостаточностью.

Поставленная цель достигается за счет того, что проводят оценку как процентного содержания Т-клеток в периферической крови относительно региональной нормы, так и иммунореактивности клеток в нагрузочных тестах розеткообразования in vitro с гормоном - T-активином и определяют два показателя: показатель относительного содержания Т-клеток (ПОТ) и показатель реактивности Т-клеток (ПРТ).

где E-РОКн - показатель нормы, определяемый для каждой лаборатории в регионе; E-РОКб - показатель E-РОК больного.

В отличие от известного способа, который оценивает процентное содержание Т-клеток относительно нормативных показателей в широком диапазоне значений (например, 60-86%), предлагаемая формула позволяет учитывать региональные показатели иммунного статуса, которые отличаются в разных регионах, и унифицировать оценку относительного содержания Т-клеток по предлагаемому значению коэффициента.

При индексе ≥ 0,8 диагностируют нормальное состояние организма, при ПОТ < 0,8 диагностируют иммунодефицитное состояние по содержанию Т-клеток относительно нормы.

где E-РОКб - показатель E-РОК больного без T-активина; E-РОКт - показатель E-РОК больного при нагрузке T-активином.

При ПРТ ≥ 1,0 судят о наличии необходимых резервных возможностей иммунной системы, при ПРТ < 1,0 диагностируют гипореактивность иммунной системы, которая возникает при нарушении рецепторной функции клеток.

Предлагаемый способ дает возможность получить относительные величины одной размерности и провести их одновременное сравнение в сочетании. Сочетанная оценка показателей ПОТ и ПРТ по таблице (табл. 1) позволяет выявить 3 типа иммунодефицитного состояния, характеризующих вторичный иммунодефицит, и определить компенсированные и декомпенсированные формы.

Первый тип ИДС характеризует скрытое компенсированное ИДС с гипореактивностью иммунной системы при сохранении нормального уровня процентного содержания Т-лимфоцитов в периферической крови.

Второй тип ИДС характеризует компенсированное ИДС со снижением процентного содержания Т-лимфоцитов в периферической крови при сохранении реактивности иммунной системы.

Третий тип ИДС характеризует декомпенсированный структурный иммунодефицит, при котором снижено содержание Т-лимфоцитов и имеется гипореактивность иммунной системы, что требует иммунокоррегирующей терапии.

Способ осуществляют следующим образом.

Мононуклеарные клетки (МНК) выделяют из 5 мл венозной крови, стабилизированной гепарином (250 ед/мл), наслаивают на 3 мл раствора верографин-фиколла (d=1,082 г/см³). После центрифугирования при 400g 40 мин МНК собирают пастеровской пипеткой с поверхности раствора верографин-фиколла и трижды отмывают: два раза в забуференном физиологическом растворе и третий раз в среде RPMI 1640. Клетки ресуспензируют в 1 мл среды RPMI 1640, подсчитывают в камере Горяева и разводят средой до концентрации 2,5•10⁶ кл/мл (Белокринецкий Д. В. , Куряницкий М.И., Трошева М.Ю., Корнев Б.М. Изучение влияния T-активина и делагина на T-клеточную систему иммунитета у больных саркоидозом //Иммунология. -1992. - N3. - С. 56-59).

В качестве тест-частиц для определения рецепторов активации МНК используют эритроциты барана (ЭБ) из венозной крови в виде 1 % суспензии (0,1 мл осадка ЭБ плюс 9,9 мл среды).

Для проведения реакции розеткообразования 0,2 мл суспензии МНК переносят в две пробирки. В первую пробирку добавляют 0,2 мл взвеси ЭБ, центрифугируют 5-10 мин, помещают в холодильник при температуре +4^oC на 1 час, добавляют 20 мкл глютарового альдегида, ресуспензируют, готовят мазок.

Во вторую пробирку добавляют 0,2 мл T-активина в концентрации 1,5•10⁴ мкг/мл на 30 мин в термостат при температуре +37^oC. После инкубации добавляют 0,2 мл ЭБ, после чего смесь клеток осаждают центрифугированием при 800g 5-10 мин и ставят в холодильник при температуре +4^oC на 1 час. Затем добавляют 20 мкл глютарового альдегида, ресуспензируют встряхиванием до получения гомогенной суспензии, готовят препарат, в котором подсчитывают количество розеткообразующих лимфоцитов.

Показатель ПРТ учитывает изменение реактивности иммунокомпетентных клеток под действием T-активина, который повышает в клетке уровень цГМФ, отражает функциональные способности клетки в определенный период и позволяет дать их качественную характеристику.

Известный и предлагаемый способы были апробированы на различном контингенте лиц без признаков ИДС и с проявлениями ИДС в группе часто и длительно болеющих (ЧДБ) взрослых людей 20-40 лет. Результаты представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы, по процентным показателям содержания Т-лимфоцитов судить о наличии иммунологической недостаточности в группе часто и длительно болеющих не представляется возможным, так как относительное содержание Т-клеток не снижено, а даже повышено по отношению к нормативным значениям и значениям у здоровых лиц.

Предлагаемый способ, апробированный в условиях исследования рецепторной функциональной способности иммунокомпетентных клеток в условиях изменения гормонального фона (тест in vitro) у лиц с разными состояниями здоровья, подтвердил различную направленность динамики изменения рецепторной активности. У лиц ЧДБ T-активин не вызывает увеличения рецепторной активности.

Нами была обследована группа из 51 человека в возрасте от 29 до 51 года, среди которых 18 человек считали себя практически здоровыми (11 женщин и 7 мужчин), 8 человек с хроническим бронхитом (ХБ), в стадии ремиссии (5 женщин и 3 мужчины) и 25 человек с диагнозом структурного иммунодефицита (СИД) (9 женщин и 16 мужчин). Диагноз выставлен на основании иммунологического обследования, которое включало общепринятый метод оценки иммунного статуса.

В результате исследования общего содержания E-POK и нагрузочных тестов с T-активином определены два показателя - ПОТ и ПРТ, типы ИДС и их распределение (%) относительно предлагаемых критериев в трех группах обследуемых (таблица 3).

Предлагаемый способ диагностики иммунодефицитного состояния показал, что 77,8% обследуемых лиц, считающих себя практически здоровыми, имеют соответствующие норме показатели ПОТ и ПРТ, а у 22,2% удалось определить скрытое иммунодефицитное состояние (ИДС 1 типа), которое у 95% лиц подтвердилось при глубоком клиническом обследовании.

В группе больных ХБ предлагаемый способ у 100% подтвердил иммунодефицитное состояние и, кроме того, позволил определить типы ИДС и показания к иммуномодулирующей терапии. У 62,5% больных ХБ диагностированы компенсированные типы ИДС и у 37,6% - декомпенсированный 3 тип ИДС, который необходимо корригировать иммуномодулирующими препаратами.

В группе больных, у которых обычным способом диагностирован структурный иммунодефицит, только у 4% обследованных диагноз не подтвердился. У 96% лиц предлагаемый способ позволил определить иммунодефицитное состояние и его формы: у 76% - компенсированное ИДС (28% 1 типа и 48% 2 типа) и у 20% декомпенсированное ИДС (3 тип), требующие иммуномодулирующей терапии.

Таким образом, предлагаемый способ, в отличие от известного, позволяет среди различного контингента лиц в 96-100% случаев диагностировать ИДС и определить компенсированные формы ИДС (1 и 2 типа) и декомпенсированную форму (ИДС 3 типа), точнее определять показания к иммунокоррекции.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, а именно к исследованию биологических материалов иммунологическими методами, и может быть использовано для раннего выявления функциональных нарушений в иммунной системе и определения показаний к иммуномодулирующей терапии. Сущностью изобретения является проведение оценки как процентного содержания Т-клеток в периферической крови относительно региональной нормы, так и иммунореактивности клеток в нагрузочном тесте розеткообразования in vitro с Т-активином и определение показателя относительного содержания Т-клеток (ПОТ) и показателя реактивности Т-клеток (ПРТ). Техническим результатом является диагностика иммунодефицитных состояний, определение компенсированных и декомпенсированных форм. 3 табл.

Способ диагностики иммунодефицитного состояния, включающий забор крови, выделение мононуклеарных клеток, проведение реакции розеткообразования и оценку количественного содержания Т-клеток, отличающийся тем, что дополнительно определяют иммунореактивность клеток в нагрузочном тесте розеткообразования in vitro с Т-активином концентрацией 1,5•10^-4 мкг/мл и определяют показатель относительного содержания Т-клеток (ПОТ) и показатель реактивности Т-клеток (ПРТ) по формулам

где Е-РОКн - показатель нормы, определяемый для каждой лаборатории в регионе;
Е-РОКб - показатель Е-РОК больного,

где Е-РОКб - показатель Е-РОК больного без Т-активина,
Е-РОКт - показатель Е-РОК больного при нагрузке Т-активином,
и при значениях ПОТ ≥ 0,8, ПРТ ≥ 1,0 диагностируют нормальное состояние организма, при ПОТ > 0,8, ПРТ < 1,0 диагностируют компенсированный гипореактивный 1 тип иммунодефицитного состояния (ИДС), при ПОТ < 0,8, ПРТ ≥ 1,0 судят о наличии компенсированного 2 типа ИДС, при ПОТ < 0,8, ПРТ < 1,0 диагностируют декомпенсированный 3 тип ИДС и определяют показания к иммунокорригирующей терапии.