Способ определения активности тимуса Советский патент 1990 года по МПК G01N33/53 G01N33/49 

1

Изобретение относится к медицине, а именно к исследованию биологичес. ких материалов иммунологическими методами. Оно может быть использовано в клинической иммунологии, терапии, хирургии и других областях медицины в диагностиче ких целях.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Поставленная цепь достигается за счет того, что кроме тотальных Е-розеткооб азующих клеток- (т-РОК) определяют количество комплексных ,;. розеткообразующих клеток (к-РОК), показатель функции тимуса определяют по формуле

ПФТ

тРОК кРОКхбб

где 66 - среднее значение т-РОК у

здоровых людей.

.При ПФТ от 0,75 до 1,25 диагност.и- руют:нормальную функцию тимуса, при

ПФТ ,75 - недостаточную, при ПФТ 1,25 - повышенную.

Способ осуществляется следуюоио

образом.

Мононуклеарные клетки (МНК) выделяют их 5 мл венозной крови, стабилизированной гепарином (250 ед/мл), наслаивают на 3 мл раствора верогра- фин-фиколл (d 1,082 г/см ). После центрифугирования при 400 g 40 мин МНК собирают пипеткой с поверхности раствора верографин-фиколл и трижды отмывают: первый раз при 400 g 10 мин, второй при 200 g 5 мин (в эабуфервнном физрастворе;) и третий - йри 200 g 5 мин в среде 199. Клетки суспендируют в 1 мл среды, подсчитывают в камере Горяева и разводят средой до концентрации 2,510 кл/мл. ; Для приготовления эритроцитов барана (ЭБ) венозную кРОвь барана хранят не более двух недель после забора с консервантом (15% от общего объема),

(Л

4

сд

а

используют трижды отмытые средой 199 (первая и вторая отмывки при 200 g 5 мин, третья - при 400 g 5 мин) ЭБ в виде 1%-ной суспензии (0,1 мл осад ка ЭБ плюс 9,9 мл среды).

Для проведения реакции розеткооб- разования 0,2 мл суспензии МНК смешивают с 0,2 мл взвеси ЭБ в двух пробирках, смесь клеток -осаждают центри фугированием при 200 g 5 мин. Для подсчета к-РОК осадок инкубируют при 37°С t,5 ч, суспендируют энерч-ичным встряхиванием до получения гомогенной суспензии (без видимых на глаз сгустков), вновь центрифугируют при 200 g 5 мин и инкубируют при . 16-18 ч. Перед подсчетом удаляют 0,2 МП надосадочной зидкости, осадок суспендируют осторожным покачивани- ем пробирки (обычно 10-15 движений), каплю полученной суспензии помещают ца предметное стекло и накрывают покровным. При 300-400 увеличении под воздушной И|-1мерсией подсчитывают количество лимфоцитов с 3 и более прикрепившимися ЭБ (розетки) на 100- 200 лимфоцитов

Для определения т-РОК осадок МНК н ЭБ (вторая пробирка инкубируют при 15 мин и при 4 С 16-18 ч, после чего готовят препарат для подсчета и считают розетки, как описано выше ДЯя, % к-РОК.

Показатель функции тимуса опреде- ляется по формуле

ПФТ

тРОК

где 66 - среднее значение т-РОК у здоровых доноров, равное 66%.

Из формулы следует, что ПФТ учитывает интенсивность продукций Е-ре- цептора Т-лимфоцитами (т-РОК) и количество предшественников Т-лимфо- цнтов (к-РОК), несущих только структуру для реабсорбдии Е-рецептора. При снижении функции тимуса увеличивается количество предшественников Т-лш оцитов., при повышении.функции тимуса увеличивается интенсивность гГродук1цга Е-рецептора T-лимфoцитa ш, а количество предшественников уменьшается. При ПФТ от 0,75 до 1,25 диаг ностируют нормальную функцию тимуса, при ПФТ 0,75 - недостаточную, при ПФТ 1,25 - повышенную

Пример 1. Вольная К., тяжелая миастения. Определены % тотальных и комплексных розеткообраэующих клеток (т-РОК и к-РОК), по формуле вы- числей ПФТ.

fgJ5 20 25

30

40

5

5

ПФТ 0,90. Функция тимуса оценивается как нормальная (ПФТ у здоровых людей от 0,75 до 1,25).

П р и м е р 2. Та же больная, через 5 месяцев после удаления тимуса. Определены % тотальных и комплексных РОК,, по формуле вычислен ПФТ

ПФТ 0,21. Функция тимуса оцени-. вается как сниженная. , В данном случае резко замедлен процесс дифференцировки Т-лимфоцитов вследствие удаления тимуса. В периферической крови резко снижено количество зрелых Т-лимфоцитов, несущих Е-рецептор, тогда как общее количество Т-лимфоцитов (зрелых, несунр1Х Е-рецептор, и незрелых, не несущих Е-рецептор, но имеющих структуру для его реабсорбции) остается высоким.

Пример 3. Больному П. проведен курс лечения Т-активином. До и после лечения определялись % тотальных и комплексных РОК, по форму- . ле вычислен ПФТ.

ПФТ до лечения 0,80. ПФТ после последней инъекции Т-активина 2,52. В данном случае функция тимуса оценивается как повышенная, что связано с усилением дифференцировки Т-лимфоцитов под влиянием эндогенного тимического фактора и экзогенного - в виде Т-активина,

Предложенный способ позволяет более точно оценивать активность ти- муса. Более высокая точность предлагаемого способа достигается преимущественно за счет того, что можно оценить не только нормальную и пониженную (как по способу-прототипу), но н повышенную функцию тимуса.

Кроме того, предлагаемый способ не требует специальных стимуляторов розеткообразования, аутоплазмы или тимусньпс факторов, что значительно упрощает способ,

Формулаизобретения

Способ определения активности тимуса, включаннций вьделение лимфоцитов из крови, инкубацию их с эритроцитами барана с последующим опреде 14700566

Tr и2 Роэеткообразу«р«ду «ими и при снесении отношения и

глеток несущих иа своей поаерхнос-количества лимфоцитов, несущих Е-рети Е-рецвптор, отличающий-цептор. по сравиени о с иормой

с я тем что, с целью повышения точ-определшвт поииженную функцию тияости способа, дополнительно в кровимуса, а при увеличении отношения и

Сольаи определяют общее количествоЬннжеиии количества лимфоцитов, несуТ-тмвюцитов. несущих и не несушросщшс и не несущих Е-рецептор. - повьгЕ-рецептор. вычисляет отновеш(.е меж шенную функцию тимуса.

Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - повышение точности способа. Суспензию мононук- леарных клеток смешивают с взвесью эритро1Д1Тов барана. Смесь клеток осаждают центрифугированием. Осадок инкубируют, суспендируют, вновь центрифугируют и инкубируют. Определяют количество комплексных розеткообра- ,зующих и тотальных Е-розеткообразукг- щих клеток. По их отношению определяют показатель функции тимуса. Если показатель равен 0,75-1,25, то диагностируют нормальную функцию тимуса.