ШТАММ БАКТЕРИЙ B.anthracis КМ104-БЕСПЛАЗМИДНЫЙ pXO1-Тох, pXO2-Cap, АВИРУЛЕНТНЫЙ, рВС16 ТЕТРАЦИКЛИНЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ Tet, СТРЕПТОМИЦИНЗАВИСИМЫЙ Str ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12R1/07 

Штамп бактерий B.anthracis KM 104 - бесплазмидный pXO1^--Tox^-, pXO2^--Cap^-, авирулентный, pBC16^- - тетрациклинчувствительный Tet^S, стрептомицинзависимый Str^D для использования в генетических экспериментах.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается штамма B.anthracis Davies "R" 31. Штамму присвоен номер B.anthracis KM 104 Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб». Особенностями штамма являются: отсутствие собственных плазмид, детерминирующих токсинообразований (pXO1) и капсулопродукцию (pXO2); обладает одномоментно стрептомицинрезистентностью (Str^R) и стрептомицинзависимостью (Str^D) и выраженной тетрациклинчувствительностью (Tet^S).

Изучение генома B.anthracis позволило установить наличие в клетках сибиреязвенного микроба двух плазмид большой молекулярной массы, связанных с основными свойствами этого возбудителя - патогенностью и иммуногенностью [1]. Токсинообразование у B.anthracis опосредовано [2] плазмидой pXO1, а капсулообразование - плазмидой pXO2 [3].

Штамм B.anthracis Davies S., являющийся прототипом нашему B.anthracis Davies R 31, выделен из костей трупа [4] в 1955 году, авторами предполагалось использовать его в качестве вакцинного штамма, но впоследствии выяснилось, что хотя штамм Davies S - авирулентен, но протективным эффектом он не обладает, поскольку у него отсутствует плазмида токсинообразования pXO1, а содержит он только плазмиду pXO2, детерминирующую капсулообразования.

Целью изобретения является получение авирулентного бесплазмидного штамма B.anthracis Davies с экспрессируемыми фенотипическими свойствами для использования в генетических экспериментах - рекомбинационных процессов.

Поставлена цель достигается тем, что нами элиминирована из B.anthracis Davies S плазмида pXO2 (капсулообразования) и способом селекции [5] придано свойство стрептомицинзависимости, т.е. получен штамм с генетической характеристикой: pXO1^-, pXO2^- pBC16^- (Tox^-, Cap^-, Tet^S, Str^D), который может быть использован в генетических экспериментах. Например, при осуществлении рекомбинационных процессов (трансдукции, мейтинга, фьюжина, трансформации и др.).

У штамма B.anthracis KM 104 ряд культурально-морфологических особенностей:

1. не растет на питательных средах, не содержащих стрептомицин;

2. характер роста на плотных питательных средах - рост в "R" диссоциативной форме на обычной плотной питательной среде, содержащий стрептомицин;

3. характер роста на жидких питательных средах - с диффузным помутнением на дне пробирки с сердечно-мозговым бульоном (ВHI) фирмы «Difco», незначительный осадок, при микроскопировании - короткие (из 3-5 клеток) стрепты.

Биохимическая активность штамма - типичная для B.anthracis.

Отношение к гомо- и гетерологическим фагам - чувствителен к видоспецифическим «К» и «γ» фагам, а также к группоспецифическому фагу «Бф» [6].

Состав среды для размножения - казеингидролизатный агар (КГА) [7] со «стрептомицином сульфат» не менее 50 ед/мл Str в среде.

При подкожном заражении мышей и морских свинок споровой извесью в дозе

2,5·10⁶ спор/мл гибель животных не наступала в течение 10 суток (срок наблюдения). В конце опыта животных усыпляли хлороформом, вскрывали с целью выделения возбудителя сибирской язвы, делая высевы из внутренних органов отпечатками на КГА со стрептомицином 100 мкг/мл. Посевы инкубировали в течение 48-72 ч. По окончанию инкубации рост возбудителя сибирской язвы не обнаруживали.

Данный штамм B.anthracis Davies R №31 Str^D принят на депонирование 19 марта 2008 года в Государственную коллекцию патогенной бактерии института «Микроб» и ему присвоен номер B.anthracis KM104.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Определение культурально-морфологических свойств B.anthracis KM104.

Для культивирования штамма можно использовать общепринятые в исследованиях плотные или жидкие питательные среды на основе мясопептонного или триптиказо-соевого перевара (мясопептонный агар или бульон, агар Хоттингера, среду Луриа и др.), но лучшими показателями в спорообразовании проявляются на среде КГА [7].

Через 48-72 ч на плотной среде КГА вырастают шероховатые, бахромчатые колонии 3-5 мм в «R»-форме, беловато-серого цвета, дающие при микроскопии краев колонии феномен «львиной гривы», в жидкой питательной среде через 24-48 ч культивирования на дне пробирки формируется осадок в виде «комочка ваты».

В отличие от вирулентной формы B.anthracis, растущей на сывороточной среде в анаэробных условиях в «S» диссоциативной форме, штамм B.anthracis KM 104 - атоксигенный, бескапсульный и растет только в «R»-форме.

Пример 2. Исследование штамма B.anthracis KM 104 на чувствительность к бактриофагам.

Для выявления чувствительности штамма B.anthracis KM 104 к фагам суточную бульонную культуру высевают дорожкой на плотную среду КГА, содержащую стрептомицин. На дорожку бактериологической петлей наносят бляшкой специфические фаги «К» и «γ», а также группоспецифические (трансдуцирующие) фаг «Бф». Ко всем трем фагам у B.anthracis KM 104 проявлялась рецепторная и репродуктивная активность.

Пример 3. Проверка уровня стрептомицинзависимости штамма B.anthracis KM 104 и чувствительность его к тетрациклину.

Для проверки уровня стрептомицинзависимости и чувствительности к тетрациклину у Str^D штамма B.anthracis KM 104 предварительно готовили питательные среды КГА, содержащие 200; 100; 50; 25; 12,5; 5 мкг/мл «стрептомицина сульфата», а также 20; 10; 5; 2,5 мгк/мл тетрациклинов в среде.

Споровую взвесь в дистиллированной воде B.anthracis KM 104 (≈20000000 спор/мл) высевали бактериологической петлей штрихами на подготовленные селективные питательные среды, содержащие антибиотик. После культивирования посева в течение 24-48 ч при 35°С учитывали рост. На среде, содержащей стрептомицин B.anthracis KM 104, рост только при содержании стрептомицина не менее 50 мкг/мл, и на средах, содержащих даже 2,5 мкг/мл и более, тетрациклина B.anthracis не рос, т.е. проявлялось Tet^S свойство.

Пример 4. Использование str^r и str^d генов для генетического анализа по переносу маркеров стрептомицинустойчивости (Str^R) и стрептомицинзависимости (Str^D) с помощью трансдукции, мейтинга и других рекомбинационных процессов.

С этой целью предварительно у штаммов B.anthracis KM 104 (Str^D) и B.anthracis Davies (Str^R) путем высева на питательную среду КГА без стрептомицина получают стрептомициннезависимые варианты. С помощью рекомбинационного анализа (реципрокной трансдукции) Str^R и Str^D вариантов и их ревертантов устанавливают, что стрептомицинрезистентность и стрептомицинзависимость контролируются различными участками генома у B.anthracis КМ 104.

Результат трансдукции свидетельствует, что стрептомициннезависимость вариантов, полученных от стрептомицинзависимых, обусловлена не реверсией в участке str^d, а мутацией в других тесно сцепленных участках, сопровождающейся активацией супрессора, который препятствует проявлению функции локуса str^d.

Следовательно, эксперимент генетического анализа, позволивший установить, что стрептомицинрезистентность (Str^R) и стрептомицинзависимость (Str^D) контролируют различные участки генома B.anthracis KM 104, и это свидетельствует об особенностях генетически маркированного (Str^D) штамма, отличающегося двойной мутацией от других Str^R штаммов.

Таким образом, установлено, что штамм B.anthracis KM104 (атоксигенный, бескапсульный), обладая основными свойствами вида, имеет свои полезные отличительные признаки: стрептомицинзависимость, авирулентность для белых мышей и морских свинок, т.е. имеет генетические свойства, необходимые при экспериментальной работе.

Литература

1. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. / Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. ВУНМЦ МЗ РФ М: 1999 - 447 с.

2. Evidence for Plasmid-Mediated Toxin Production in Bacillus anthracis./Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph J.D. et al. Inf. Immun., 1983 - P.371-376.

3. Demonstration of a Capsule Plasmid in Bacillus anthracis./ Green B.D., Battisti L., Kochler T.M. et al. Inf. Immun., 1985, - P.291-297.

4. Davies D.Y., Harvey B.W.S. The isolation of Bacillus anthracis from bones.//Lanset - 1955 - Vol.269 - №2 - P.86-87.

5. Способ получения стрептомицинрезистентных вариантов возбудителя сибирской язвы из симбиотической смеси клеток Bacillus anthracis и скользящих бактерий - Myxococcus xanthus. Буланцев А.Л (Ru), Липницкий А.В. (Ru). Патент №2233883. Бюл. №22, - 2004.

6. Bulantsev A.L., Lipnitsky A.V., Barcov A.M. Genetic exchange between bacilli by transduction. // The 2^nd international workshop on the molecular biology of Bacillus cereus, Bacillus anthracis and Bacillus Thuringiensis. - Taos, New Mexico, USA August 11-13, 1999.

7. Питательная среда для выращивания сибиреязвенных микробов. Александров Н.И., Николаенко Ю.П., Фатхинурова Т.И., Лазарева Е.С. Автор. свид. №400620, 1973, Бюл. №40.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Штамм депонирован в коллекции РосНИПЧИ «Микроб» и ему присвоен номер B.anthracis KM 104. У штамма элиминирована плазмида pXO2 (капсулообразования) и он является авирулентным для белых мышей и морских свинок, обладает характерными культурально-морфологическими, биологическими свойствами, чувствительностью к специфическим фагам, характерными для B.anthtacis. Генетическая характеристика штамма позволяет осуществлять его использование в генетических экспериментах.

Штамм B.anthracis KM 104 (коллекция РосНИПЧИ «Микроб») - бесплазмидный pXO1^--Тох^-, pXO2^--Cap^-, авирулентный, рВС16^- тетрациклинчувствительный Tet^S, стрептомицинзависимый Str^D для использования в генетических экспериментах.