СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА CCR5 delta 32 Российский патент 2015 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно генетике, гематологии, и может использоваться для определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 при скрининговом обследовании образцов пуповинной крови, поступающих в банк пуповинной крови.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) проникает в клетки посредством связывания гликопротеина вирусной оболочки gp 120 с мембранными рецепторами CD4 и CCR5. Одновременная экспрессия рецепторов CD4 и CCR5 встречается на T-лимфоцитах, моноцитах, макрофагах и дендритных клетках. Белок CCR5 кодируется геном CCR5, расположенным на коротком плече хромосомы 3 в позиции 21 (3p21). Существует полиморфизм CCR5 delta 32, представляющий из себя делецию 32 пар нуклеотидов в кодирующей области гена CCR5. В результате экспрессии мутантного гена в гомозиготном состоянии транслируется укороченный, функционально неактивный белок CCR5. Вследствие этого гомозиготные носители этого полиморфизма обладают практически полной резистентностью к инфицированию ВИЧ. Гомозиготными носителями делеционного аллеля являются около 1% белого населения [1, 2]. Известен успешный случай трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) периферической крови в 2007 году в Германии ВИЧ-инфицированному пациенту с острым миелоидным лейкозом от донора, гомозиготного носителя полиморфизма CCR5 delta 32 [3, 4]. Однако несмотря на успешность проведенного лечения, это был лишь единичный случай и в последующем ни одной ТГСК для лечения ВИЧ-инфекции не было проведено вследствие редкой встречаемости полиморфизма CCR5 delta 32 и строгими условиями подбора образцов костного мозга и периферической крови по системе HLA. В то же время гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 могли бы со значительно большей вероятностью быть использованы для проведения трансплантации при ВИЧ-инфекции в связи со значительно менее строгими требованиями подбора образца по системе HLA [5].

В настоящее время в Российской Федерации представлено незначительное количество тест-систем для детекции мутации CCR5 delta 32. Доступные диагностические тест-системы обладают высокой стоимостью, для проведения исследований требуется наличие дорогостоящего оборудования. Кроме того, на данные диагностические тест-системы не получены сертификаты соответствия, что предполагает применение этих наборов только для научных целей и не допускает использование этих наборов в любых видах диагностических процедур. Пример - комплект реагентов «АмплиСенс CCR5del32-скрин» для определения полиморфизма CCR5 delta 32 методом пиросеквенирования.

Существуют способы определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 методом аллель-специфичной ПЦР в реальном времени [5, 6].

В качестве прототипа можно рассматривать способ определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32, основанный на использовании метода ПЦР с рестрикционным анализом продуктов амплификации (ПЦР-ПДРФ) [7].

К недостаткам способа, выбранного нами в качестве прототипа, а также вышеуказанных аналогов, можно отнести то, что данные способы отличаются необходимостью использования дополнительных этапов анализа, реагентов и оборудования для проведения исследования, что увеличивает себестоимость метода, трудоемкость и время проведения анализа и не позволяет использовать данный метод для проведения скринингового обследования.

Техническим результатом изобретения является упрощение способа определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32, сокращение времени его проведения и снижение его себестоимости, что обеспечит возможность проведения скринингового обследования.

Технический результат изобретения достигается тем, что способ определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 заключается в выделении ДНК, проведении ПЦР, детекции продукта реакции с использованием электрофореза, при этом ДНК выделяют из криоконсервированной пуповинной крови, а при проведении ПЦР используют следующие праймеры:

F: TGTGTTTGCGTCTCTCCCA

R: CTCTTCTTCTCATTTCGACACCG,

ПЦР проводят при 94°C в течение 5 мин, затем проводят 35 циклов, каждый из которых состоит из 3-х этапов: 94°C - 30 с, 56°C - 40 с, 72°C - 40 с. После чего проводят ПЦР при 72°C - 10 мин и 15°C - 5 мин. Детекцию полиморфизма осуществляют в 8% полиакриламидном геле с применением вертикального электрофореза. Наличие специфических ДНК-фрагментов определяют после электрофоретического разделения ПЦР-амплификационной смеси и окрашивания геля бромистым этидием с помощью трансиллюминатора. Длина ПЦР фрагментов составляет 224 п.н. при нормальном варианте гена и 192 п.н. при аллельном полиморфизме CCR5 delta 32.

Способ осуществляется следующим образом:

Перед постановкой реакции криоконсервированную при -70°C пуповинную кровь в микропробирках типа Эппендорф размораживают при комнатной температуре в течение 20-40 мин. Геномную ДНК выделяют из 0,9-1,0 мл пуповинной крови с использованием коммерческих наборов Protrans (Германия) или Axygen (США). Скрининговое исследование образцов на CCR5 delta 32 аллель проводят методом ПЦР. ДНК амплифицируют в конечном объеме реакционной смеси 20 мкл. Реакционная смесь содержит 10-кратный буфер для Taq-полимеразы, 2 мМ MgCl₂, 2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (dNTP), прямой и обратный праймеры (по 30 нг каждого), 0,1 Ед Taq-полимеразы, 40-120 нг исследуемой геномной ДНК. Используют следующие праймеры, фланкирующие делеционный сайт:

F: TGTGTTTGCGTCTCTCCCA

R: CTCTTCTTCTCATTTCGACACCG.

ПЦР проводят в амплификаторе Biorad My Cycler Version 1.065. Условия реакции: 94°C - 5 мин; далее 94°C - 30 с, 56°C - 40 с, 72°C - 40 с в течение 35 циклов; затем 72°C - 10 мин и 15°C - 5 мин. Детекцию полиморфизма осуществляют в 8% полиакриламидном геле с применением вертикального электрофореза. Наличие специфических ДНК-фрагментов определяют после электрофоретического разделения ПЦР-амплификационной смеси и окрашивания геля бромистым этидием с помощью трансиллюминатора. Длина ПЦР фрагментов составляет 224 п.н. при нормальном варианте гена и 192 п.н. при аллельном полиморфизме CCR5 delta 32.

Электрофореграмма продуктов амплификации представлена на Фиг. 1:

1 - гетерозиготное носительство полиморфизма CCR5 delta 32;

2 - нормальный тип гена CCR5;

3 - полиморфизм CCR5 delta 32 в гомозиготном состоянии.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа являются:

- при проведении ПЦР используют следующие праймеры:

F: TGTGTTTGCGTCTCTCCCA

R: CTCTTCTTCTCATTTCGACACCG;

- ПЦР проводят при 94°C в течение 5 мин, затем проводят 35 циклов, каждый из которых состоит из 3-х этапов: 94°C - 30 с, 56°C -40 с, 72°C - 40 с; после чего проводят ПЦР при 72°C - 10 мин и 15°C - 5 мин;

- длина ПЦР фрагментов составляет 224 п.н. при нормальном варианте гена;

- аллельный полиморфизм CCR5 delta 32 определяется при наличии ПЦР-фрагментов размером 192 п.н.

Причинно-следственная связь между существенными отличительными признаками и достигаемым результатом:

Дизайн специфичных праймеров разработан с использованием биоинформационной базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.). Подобраны оптимальные условия для прохождения ПЦР - длина праймеров, температура отжига, длина ДНК-амплификата, соотношение нуклеотидов. Произведена проверка пары праймеров на возможность образования димеров, дуплексов, шпилек. Результаты подтверждены прямым секвенированием с использованием секвенатора CEQ 8800 (Beckman Coulter, США).

Пример конкретного выполнения способа:

Пример 1

Амплификация проводилась в объеме 18 мкл. Состав реакционной смеси: 14,5 мкл бидистиллированной воды, 2 мкл буфера для полимеразы (Taq буфер, 10-кратный, pH 8.6, без Mg2+), 1,2 мкл 25 мМ MgCl_2, 2 мкл смеси прямого и обратного праймеров (50 нг каждого праймера), 0,4 мкл смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (10 mM dNTP), 0,1 мкл Taq-полимеразы (1 единица активности), 2 мкл анализируемой геномной ДНК (40-120 нг). ПЦР проводилась в амплификаторе Biorad My Cycler Version 1.065. Условия реакции: 94°C - 5 мин; далее 94°C - 30 с, 56°C - 40 с, 72°C - 40 с в течение 35 циклов; затем 72°C - 10 мин и 15°C - 5 мин. Детекция полиморфизма осуществлялась в 8% полиакриламидном геле с применением вертикального электрофореза. Наличие специфических ДНК-фрагментов определяли после электрофоретического разделения ПЦР-амплификационной смеси и окрашивания геля бромистым этидием с помощью трансиллюминатора. Длина ПЦР фрагментов составляла 224 п. н. при нормальном варианте гена и 192 п.н. при аллельном полиморфизме CCR5 delta 32.

Длины фрагментов, получаемые при генотипировании аллельного полиморфизма:

В процессе скринингового исследования детекции аллельного полиморфизма CCR5 delta32 обследовано 2960 образцов пуповинной крови общественного регистра. В результате исследования выявлен 31 образец с генотипом CCR5 delta 32/delta 32, что составило 1,05%. В 534 образцах аллельный полиморфизм CCR5 delta 32 присутствовал в гетерозиготном состоянии (18,04%).

Таким образом, заявляемый способ определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 методом ПЦР по сравнению с прототипом снижает трудоемкость и сокращает время проведения исследования, уменьшает себестоимость анализа за счет отсутствия дополнительного этапа исследования (этапа рестрикционного анализа продуктов амплификации), при этом не возникает необходимости в приобретении дополнительных реагентов, в частности дорогостоящей рестриктазы. Данный метод может быть использован для проведения скринингового обследования на носительство аллельного полиморфизма CCR5 delta 32.

Источники информации

1. Deng, Н. Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1 / H. Deng, R. Liu, W. Ellmeier [et al.] // Nature. - 1996. - Vol. 381. - P. 661-666.

2. Dragic, T. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5 / T. Dragic, V. Litwin, G.P. Allaway [et al.] // Nature. - 1996. - Vol. 381. - P. 667-673.

3. Hutter, G. Long-Term Control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 Stem-Cell Transplantation / G. Hutter, D. Nowak, M. Mossner // N. Engl. J. Med. - 2009. - Vol. 360. - P. 692-698.

4. Alters, K. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Δ32/Δ32 stem cell transplantation / K. Allers, G. Hütter, J. Hofmann // Blood. - 2011. - Vol. 117, №10. - P. 2791-2799.

5. Petz, L.D. Hematopoietic Cell Transplantation with Cord Blood for Cure of HIV Infections / L.D. Petz, I. Redei, Y. Bryson [et al.] // Biol. Blood Marrow Transplant. - 2013. - Vol. 19, №3. - P. 393-397.

6. Кофиади И.А. Распределение аллелей генов CCR5, CCR2 и SDF1, ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ-инфекции, в Российских популяциях / И.А. Кофиади, Д.В. Ребриков, Д.Ю. Трофимов [и др.] // Доклады академии наук. - 2007. - Т. 415, №6. - С. 842-845.

7. Патент RU 2249619 C2, 23.04.2003 г. Способ одновременного определения мутаций CCR5del32 и CCR5M303 в гене CCR5 человека, обуславливающих генетическую устойчивость обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1). Рахманалиев Э.Р., Апрятин С.А., Николаева И.А., Климов Е.А., Сулимова Г.Е., Сидорович И.Г

Изобретение относится к области медицинской генетики и предназначено для определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32. Осуществляют выделение ДНК из криоконсервированной пуповинной крови. Проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием специфических праймеров. Наличие специфических ДНК-фрагментов определяют после электрофоретического разделения ПЦР-амплификационной смеси и окрашивания бромистым этидием. При нормальном варианте гена длина ПЦР фрагментов составляет 224 п.н. При аллельном полиморфизме CCR5 delta 32 длина ПЦР фрагментов составляет 192 п.н. Изобретение обеспечивает специфическую детекцию аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 в образце пуповинной крови и может быть использовано для проведения скринингового обследования. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32, заключающийся в выделении ДНК, проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР), детекции продукта реакции с использованием электрофореза, отличающийся тем, что ДНК выделяют из криоконсервированной пуповинной крови, а при проведении ПЦР используют следующие праймеры:
F: TGTGTTTGCGTCTCTCCCA
R: CTCTTCTTCTCATTTCGACACCG
и ПЦР проводят при 94°C в течение 5 мин, затем проводят 35 циклов, каждый из которых состоит из 3-х этапов: 94°C - 30 с, 56°C - 40 с, 72°C - 40 с, после чего проводят ПЦР при 72°C - 10 мин и 15°C - 5 мин; детекцию полиморфизма осуществляют в 8% полиакриламидном геле с применением вертикального электрофореза; наличие специфических ДНК-фрагментов определяют после электрофоретического разделения ПЦР-амплификационной смеси и окрашивания геля бромистым этидием с помощью трансиллюминатора, длина ПЦР фрагментов составляет 224 п.н. при нормальном варианте гена и 192 п.н. при аллельном полиморфизме CCR5 delta 32.